荧光定量操作.docx

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荧光定量操作

样品取回后，冻于-70冰箱中。

样品包括组织样和血清样品。

检查目的基因的表达情况。

需要作的工作如下：

1、首先是组织总RNA的提取。

提取步骤见TRNZOL试剂说明书。

2、组织mRNA提取后进行反转录，得到cDNA样品。

3、以CDNA样品为模板进行特定基因的扩增（可先用普通PCR验证/为了验证表达的差异，应采用定量PCR，并选用内参基因）

注意：

为了让提取的RNA质量可靠，每次研磨的组织样品不能过多，这就要求我们在取样是不能取太多的样品，而且所取样品必须准确、可靠。

否则会导致后续试验都不准确。

一．总RNA提取准备工作：

、

（一）基本器材和试剂

1．实验器具与材料

（1）移液枪：

1ml、200ul、10ul

（2）枪头：

1ml、200ul、20ul

（3）枪头盒：

1ml一个,200ul和20ul的枪头盒至少一个

（4）EP管1.5ml、100ul

（5）研钵:

据一次提取RNA样品多少定.

（6）容量瓶：

1000ml

（7）盐水瓶：

100ml

（8）广口瓶几个（配75％乙醇，盛放氯仿，异丙醇等用）

2．实验器具的处理与准备

（1）塑料制品：

（包括吸头、EP管等）将塑料制品逐个浸泡于0.1%DEPC水中（必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水）37℃过夜,然后送至高压锅灭菌（121-126℃）至少30分钟，后在60-70℃烘烤箱中烘干，试验前将枪头放入枪盒。

优级耗材可直接使用。

（2）玻璃制品：

（主要是玻璃研磨器）先泡酸过夜，冲洗干净后，在0.1%DEPC水中泡8小时左右（过夜），37℃烘干，用蒙锡纸包裹送至干烤（100-200℃）3次。

（3）金属制品：

（镊子等）先洗干净，再送干烤3次。

（不需要泡DEPC水）

3．试剂配制和准备

（1）DEPC水：

泡实验器具的DEPC水的配制：

1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。

DEPC处理水的配制：

100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC，37℃过夜，送至高压去除未反应的DEPC。

（2）75％乙醇（最好在抽提时现配）：

用无水乙醇和DEPC水配制（DEPC水:

无水乙醇＝1:

3）,然后放于-4℃预冷备用。

（3）异丙醇：

放入棕色瓶。

（4）氯仿：

放入棕色瓶。

（5）Trizol：

100ml/瓶存放于4℃。

4.抽提RNA工作台面准备

1.在仅用于RNA抽提的超净工作台抽提RNA

2.工作台面用用RNAase失活剂处理。

（二）总RNA提取步骤：

1.采样

样品采集需均一，迅速，组织样品避免血液污染，样品采集后迅速置于液氮或是-70℃.

2.样品的研磨:

先用少许液氮将研钵冷却,然后取少许组织样放于盛有液氮的研钵内迅速研磨成细粉末，取约少100mg样品于预先加入1mlTrnzol的EP管中,用力颠倒混匀，室温静置5分钟,充分裂解细胞。

3.加入氯仿

向每管中加0.2ml氯仿。

盖紧管盖，用漩涡振荡仪振荡15s（也可用手用力振荡1分钟左右），使其充分混匀，静置2-5min。

4.离心分离

4℃下12000g离心15分钟,样品会分成三层：

黄色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中，把水相（约500μl）转移到新管中，注意不要吸取到蛋白层。

5.转移上清

将含有RNA的上层清液转移到新的1.5mlEP管中后（约500ul）,再加入0.5ml异丙醇,轻轻混匀后静置10分钟

6．RNA沉淀

然后4℃12000g离心10分钟,弃上清。

离心前RNA沉淀经常是看不见的，离心后在管侧和管底形成白色胶状沉淀。

7.RNA洗涤

加入1ml75%乙醇（4摄氏度预冷），轻轻洗涤沉淀,4℃，7500g×5min，弃上清。

注意在倒出液体时不要倒出沉淀，剩余的少量液体短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要吸弃沉淀。

此步可重复.

8. 晾干

室温放置晾干（不要晾的过干，RNA过分干燥后会很难溶解，大约晾干2－3分钟左右，见乳白色沉淀变成透明胶冻状即可）

9.溶解

根据实验需要及得到RNA量的多少，加入30-100μl无RNase水，反复吹打、混匀，充分溶解RNA。

为了保证RNA的浓度在可用范围，可使用20-30μl水溶解。

若浓度过大可再稀释。

预防RNase污染，应注意以下几方面：

1．经常更换新手套。

因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。

2．使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。

3．RNA在TRNzol试剂中时不会被RNase降解。

但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。

玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料器皿可在0.5MNaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除

RNase。

4．配制溶液应使用无RNase的水。

（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%（v/v），放置过夜，高压灭菌）。

TRnzol法抽提总RNA流程图

液氮研磨组织并取样约100mg,加入预先盛有1mlTRnzol的EP管中

振荡混匀后，室温5分钟

↓

加氯仿1/5体积（0.2ml）（必须按总体积的1/5）

旋涡仪振荡混匀15S，（用手使劲摇动1分钟替代）室温静置2-5分钟

↓

4℃，离心12000g，15分钟

↓

转上层水相（约400-500μl）于另一新1.5mlEP管中

加等体积异丙醇（约400-500μl），混匀后室温10分钟

↓

4℃，离心12000g，10分钟

↓

弃上层清液后，加4度预冷的75%乙醇（用高压后的DEPC水配）1ml

4℃离心7500g，5分钟

↓

弃上清，可短暂离心后，用枪吸取多余的液体，空气干燥约30分钟（不能完全干燥）

↓

溶于DEPC处理水中至30μl（20μl-30μl）

（可在55-60℃水中，<10分钟助溶）

↓融解RNA

立即保存于-70℃超低温冰箱中，或立即用于逆转录

注意:

1.样品量和Trizol的加入量一定要按组织100mg,1mlTRIzol的比例，不能随意增加样品量或减少Trizol量，否则会使内源性RNase的抑制不完全，导致RNA降解

2.实验过程必须严格防止RNsae的污染。

二．RNA质量和浓度检测

分别采用1.0%琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白检测仪检测所抽提的总RNA的质量和浓度。

1琼脂糖凝胶电泳检测抽提的RNA的质量：

⑴取10×TBE缓冲液20ml加水至180ml，配成1×TBE缓冲液；

⑵称取1.0g琼脂糖置于200ml锥形瓶，加入100ml1×TBE缓冲液，加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀；

⑶待琼脂糖胶液冷却至50~60℃（手感容器能耐受）时，加入5µlGoldview，摇匀；⑷倒胶：

迅速放好梳子后将凝胶缓缓倒入制胶膜中。

凝胶的厚度在3~5mm之间。

避免产生气泡，尤其梳子周围不能有气泡，若有气泡可用吸管小心吸去。

凝胶通常需要在室温中放置30~45min。

凝胶完全凝固后，将凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，液面应高出凝胶表面1mm小心移去梳子和隔离板，保持点样孔完整；

⑸加样：

用移液枪将RNA液和6×载样液在无RNA酶的离心管中混匀，点样于样品孔中，并同样加DNAMarker于点样孔；

⑹电泳：

加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源，观察正负两极是否有气泡出现，如负极气泡比正极多，则证明电泳槽已经接通电源。

100V电泳0.5h，当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳；

⑺观察和照相：

在波长为254nm的长波长紫外灯下，观察是否出现两条完整的条带：

28S和18S，分别为4800bp和1900bp，如果完整，则说明RNA质量可靠，并在凝胶成像系统下照相保存图片。

2核酸蛋白检测仪检测RNA的浓度：

取5µl总RNA和45µl1×TE于比色杯，用枪头混匀，在RNA程序下测样品相应数值，即：

样品号，260nm吸光度，280nm吸光度，320nm吸光度，260/208nm吸光度比值，样品稀释倍数，样品中RNA的含量（µg/ml，ng/µl）。

3.DNaseⅠ处理用无RNase的DNaseⅠ处理，消除总RNA中痕量DNA的污染，操作步骤如下：

⑴在微量离心管中配制下列反应液，总量50µl；

总RNA30µg

10×DNaseⅠBuffer5µl

DNaseⅠ（RNase-Free,5U/µl）2µl

RNaseinhibitor（40U/µl）0.5µl

DEPCH2O12.5µl

⑵37℃反应20~30分钟；

⑶加入50µl的DEPCH2O；

⑷加入100µl（等量）的苯酚/氯仿/异丙醇（25:

24:

1），充分混匀；

⑸13，200rmp离心5min，取上层（水层）移至另一微量离心管中；

⑹加入100µl（等量）的氯仿/异丙醇（24:

1），充分混匀；

⑺13，200rmp离心5min，取上层（水层）移至另一微量离心管中；

⑻加入10µl（1/10量）的3M醋酸钠（PH5.2）；

⑼加入250µl（2.5倍量）的冷无水乙醇，-20℃放置30~60分钟，以沉淀RNA；

⑽13，200rmp离心15min，弃上清；

⑾缓慢加入75%乙醇200µl，13，200rmp离心5min以清洗沉淀，弃上清。

重复清洗一次，弃上清，用离心机短暂离心10s，用Tip头吸干残留乙醇；

⑿空气干燥10min（注意：

切勿过分干燥，否则RNA将会很难溶解且A260/280会小于1.6），加30µlDEPCH2O溶解10min，样品保存于-80

三．反转录

（一）准备工作

1实验器具与材料：

（1）移液枪：

200ul、10ul

（2）吸头：

200ul、20ul

（3）EP管1.5ml、200ul

2，实验器具的处理与准备

塑料制品：

（包括吸头、EP管等）

将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中（必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水）37℃过夜，然后送至高压至少30分钟，后在60-70℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小时左右烘干），试验前将枪头放入吸头台。

优级耗材可直接使用.

3，试剂配制和准备：

（1）DEPC水：

泡实验器具的DEPC水的配制：

1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。

逆转录中所用的DEPC水的配制：

100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC，37℃过夜，送至高压，后分装到几个1.5mlEP管中，-20℃中保存备用。

（2）RT中所需要的各种试剂

1,RT试剂盒.

2,DEPC处理水或生化专用的RNase-free水.

3,10uM浓度的引物.

（二）RT步骤

用RT试剂盒进行转录（10ul体积）。

1，准备200u的EP管

2，冰上操作：

按试剂盒说明书进行反应体系的配制.

3，配制好后,轻轻振荡以混匀样品,用小离心机将所有样品都离至管底。

4，按说明书上的反转录条件在普通PCR仪上进行反转录.

5，　反转录完成后,其管内产物即为PCR的模板.以10UL的反应体系来说,每次反应所需的模板量仅为1UL.

6，分装处理并做好标记,为了保证模板的完整性,应对反转录后的模板进行分装.分装后-20℃保存,PCR进再单管取样,减少模板冻融次数。

1.按下列组分配制RT反应液（在冰上进行，总体系10µl）

5×PrimescriptTMBuffer2µl

PrimescriptTMRTEnzymeMixⅠ0.5µl

OligodTPrimer（50µM）0.5µl

Random6mers（100µM）0.5µl

TotalRNA4µl

RNaseFreedH2O2.5µl

2.轻轻混匀后7500rmp离心3~5sec；

3.在下列条件下进行反转录反应：

37℃，15min，（反转录反应）；85℃，5sec（反转录酶的失活）；

4.反转录产品-20℃保存待用。

四．普通PCR

（一）引物的稀释

在引物合成回来后，立即存放于－20冰箱内。

由于引物合成的量很少，稀释前先用离心机高速离心（10,000rpm，1min），将DNA制品的粉末都离心至管底，然后加上引物nmol*10体积的无菌水，轻轻上下振荡5-10分钟，再次离心10,000rpm，1min，制成100uM的保存液，再取少许别稀释成10&20uM工作液，原液或工作液－20保存。

这样即可以减少引物被污染的机会，又可以减少因多次冻融而使引物降解或断裂，进而影响实验结果。

在溶解DNA制品是，我们是先将其制备成100uM的保存液，然后再稀释成实验浓度。

配制100uM的保存液的方法。

灭菌水的使用量：

体积（ul）＝nmol数*10.

1umol=1000nmol=1000000pmol

1uM=1umol/L=1nmol/ml=1pmol/ul

（二）PCR准备

1、实验器具与材料：

（1）移液枪：

200ul、10ul

（2）吸头：

200ul、20ul

（3）枪头盒：

放置200ul和20ul的吸头一个

（4）EP管1.5ml、200ul

2，实验器具的处理与准备

塑料制品：

（包括吸头、EP管等）送至高压30分钟次，试验前将枪头放入吸头台。

3,试剂配制和准备：

（1）超纯水：

100ml盐水瓶内装40ml超纯水，送至高压，后分装到几个1.5mlEP管中，-20℃中保存备用。

（2）PCR中所需要的各种试剂:

Master-mix，cDNA模板，Ｐrimer，无ＲＮＡase水．

（三）PCR步骤

1，准备200ulEP管

2，确定各成分的添加量（参照试剂盒说明）.

3，在冰上操作,并放置在设定程序的PCR仪．

4，再电泳检测结果

5，1.取0.2mlPCR管，依次加入下列试剂（PCR总反应体系为10µl）：

第一链cDNA1µl

上游引物（10µM）0.5µl

下游引物（10µM）0.5µl

2×TaqPCRMasterMix5µl

ddH2O3µl

五．荧光定量

1、实验器具与材料：

（1）移液枪：

200ul、10ul、1000ul

（2）吸头：

200ul、10ul、1000ul

（3）枪头盒：

1000ul、200ul、10ul（2个）

（4）EP管：

1.5ml、200ul

（5）白管：

低位白色八联管

2.反应体系

1.取0.2mlPCR管，依次加入下列试剂（PCR总反应体系为10µl）：

第一链cDNA1µl

上游引物（10µM）0.5µl

下游引物（10µM）0.5µl

2×TaqPCRMasterMix5µl

ddH2O3µl

反应体系（总体系为12.5µl）：

SYBRPremixExTaqTM（2×），6.2.5µl；上游引物（10µM），0.25µl；下游引物（10µM），0.25µl；第一链cDNA，1µl；ddH2O，4.75µl。

其中SYBRPremixExTaqTM（2×）内含MgCl2、TaqHS（HotStarTaqpolymerase，热启动酶）、dNTP、SYBRGreenⅠ等。

3.反应程序

反应程序：

①预变性：

95℃，1min；②扩增：

95℃，5s；60℃，30s；共40个循环；③融解曲线：

95℃，0s；50℃，30s；95℃，0s（温度变化速率为0.5℃/s）。

反应结束后确认RealTimePCR的扩增曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。

采用双标准曲线法计算各基因mRNA的相对表达量。