比浊法操作手册文档格式.docx
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精密称取标准品或供试品适量（制剂产品可根据剂型选择适当的方法）于容量瓶中，配制成浓度为1000u/ml的溶液，选择适当的方法稀释至规定浓度。
二、比浊法操作过程：
1、标准品溶液及供试品溶液的制备
可按各品种的具体规定，稀释制备，也可以进行预试验，选择合适的浓度比，如果试验菌的灵敏度高可以选择低的剂间比，如1.25:
1；
如果试验菌的灵敏度低则可选择较高的剂间比，如2:
1或4:
1等。
2、标准品溶液及供试品溶液的分装
取备好的大试管16支，分配dS14支，dS24支，dT14支及dT24支，分别作好标记，按照拉丁方顺序排列。
将标准品溶液dSl、dS2及供试品溶液dT1、dT2各1.0毫升按编号加入相应的大试管中。
注意：
加入溶液时，均在有标记处沿管壁移入，以便在分装培养基时，可沿此处管壁流入，将沾在试管壁上的抗生素充分洗入培养基内（如有自动加样装置，则可免去此手工法操作）。
比浊法大试管拉丁方排列示意图
3、比浊法试验用培养基的接种
接种试验菌的量，需作预测试验，使S1、S2管，经培养后（37℃，一般4小时），吸收度A（D光密度）以0.3～0.7为适当。
4、培养基的分装
比浊法试验用的培养基，接种试验菌后用大口吸管或其他自动加样器，分装至大试管中，每管分装9.0ml，每管分装量应尽量一致，其差异越小试验的精密度越高。
移入培养基时，按加入样品溶液的标记处稍上方，沿管壁流入，立即振摇，使抗生素溶液与培养基混合均匀。
5、培养
按照各品种规定的条件进行培养。
6、测量
取同条件下接种的比浊试验用培养基9.0ml，加稀释剂lml，12％甲醛液0.5ml摇匀，作为空白，使用分光光度计进行测量。
使用WBS-100微生物比浊仪可进行恒温振荡培养并在线快速测量，在波长530nm处，测量各大试管内培养物的吸收度。
短时间内完成的在线测量，既能保证更高的精度，又避免了与甲醛的过多接触。
7、计算结果及误差统计分析
比浊法效价测定二剂量法结果的计算，可照管碟法效价测定二剂量法结果的计算方法计算，并用误差统计分析方法进行可靠性检验，求出效价、偏离平行及可信限率等，以检验试验结果的可靠性。
使用WBS-100微生物比浊仪可进行自动计算
比浊法操作注意事项
1、防止抗生素污染：
比浊法测定抗生素效价抗生素溶液的浓度非常低，抗生素在培养基中的最终浓度约为0.01～0.1u/ml，因此测定时所用的实验器具应严防抗生素残留和污染。
比如，培养用比色皿至少用自来水冲洗6次、用纯化水冲洗三次，洗涤比色皿和大口吸管的水池与洗涤抗生素溶液的水池分开。
2、防止微生物污染：
微生物污染对比浊法测定效价有很大影响，若实验用器具、材料被微生物污染，将导致生物反应紊乱，各管形成的吸收度精密度变差，可信限率显著增高，测定结果的精密度和准确度变差，所以实验过程中应严防微生物污染。
因此，实验用比色皿、大口吸管、培养基、缓冲液等应灭菌后使用，稀释用精密计量器具必要时进行灭菌。
3、菌种：
实验用菌种应保持新鲜、纯净，对抗生素反应应灵敏。
菌种对测定影响很大，若菌种不适合，将得不出正确结果甚至得不出结果。
若菌种不新鲜，其生长速度慢，在规定时间内浊度（吸收度）达不到要求；
若菌种不纯，各管形成的吸收度精密度差，可信限率高；
若菌种对抗生素反应不灵敏，高低剂量抗生素形成的吸收度距离减小，测定结果可信限率显著增高。
4、培养基：
实验用培养基的灵敏度应高，应严格控制培养基的pH值。
若培养基的灵敏度不高或培养基的pH值不适合，细菌生长速度慢，在规定时间内浊度（吸收度）达不到要求。
硫酸庆大霉素培养基消毒后pH值最好控制在7.15～7.20。
5、抗生素溶液的配制、稀释与加入：
配制、稀释抗生素溶液时应准确、精密；
加入1.00ml抗生素溶液时应精密，从某一记号处加入，目的是用培养基将粘在管壁的抗生素溶液冲下；
加入9.0ml带菌培养基应精密。
6、培养：
培养温度应均匀，应按照随机排列的方式进行培养（二剂量法和三剂量法按照拉丁方排列），以消除局部培养温度不均匀对结果的影响。
7、培养时间：
培养时间不可过长，吸收度不可过高，高低剂量吸收度达到0.3以上即可。
若发现某种剂量下细菌生长缓慢或停止生长应停止实验，否则测定结果变化较大。
比浊法常见的异常现象及其解决方法
异常现象
原因
解决办法
1
细菌生长的浊度大，阳性对照、高低剂量距离小，可信限率高
菌种不纯；
抗生素的浓度不适宜（低）
更换菌种；
提高抗生素溶液的浓度
2
阳性对照、高低剂量细菌生长的浊度值均小。
菌种不新鲜，活力差；
培养基不灵敏
更换或纯化菌种；
更换培养基
3
阳性对照浊度大，高低剂量浊度小
抗生素的浓度不适宜（高）
降低抗生素溶液的浓度
4
阳性对照浊度大，阳性对照、高低剂量浊度均符合要求，阳性对照、高低剂量间的距离符合要求，各管间的浊度值精密度差，可信限率高
比色皿被抗生素污染；
菌种不纯或器具被杂菌污染；
加样不精密
清洗比色皿；
更换菌种或对器具进行清晰灭菌；
提高加样的精密度
5
阳性对照、低剂量浊度值符合要求，高剂量浊度值低，高低剂量距离过大
抗生素的浓度不适宜（剂间比过大）
降低剂间比
6
阳性对照、高低剂量浊度值均符合要求，阳性对照与低剂量距离符合要求，高低剂量距离过小
抗生素的浓度不适宜（剂间比过小）
提高剂间比
7
某一管或几管异常过高或过低
漏加或错加溶液；
比色皿方向放置错误；
抗生素污染
加强操作，减少错误；
器具清洗消毒
8
结果明显不正确，偏离平行异常高
四组剂量按照拉丁方排列放置时位置错误
加强操作，减少错误
操作实例分析
1、以下是一组有问题的实验报告：
由其中的一些实验数据我们可以得出一些问题。
具体分析如下：
品名：
硫酸庆大霉素原料编号：
00005实验日期：
2005.11.16
碟号
ds1
ds2
dt1
dt2
ym
No.1
0.492
0.479
0.497
0.488
1.956
No.2
0.484
0.469
0.482
0.463
1.898
No.3
0.495
0.474
0.470
1.932
No.4
0.489
0.476
0.491
1.927
No.5
0.507
0.512
0.486
1.996
No.6
0.503
0.477
0.499
0.471
1.950
No.7
0.481
0.487
0.500
0.485
1.954
No.8
0.496
0.504
0.480
1.964
yk
3.946
3.838
3.978
3.814
15.576
阳性对照：
0.521培养时间：
3.5小时试管型号：
2㎝
试品间F1=0.0695回归F2=78.3748偏离平行F3=3.1699
剂间F6=27.2044组间F7=7.0663
组数m=8估计效价At=100
剂间比r=1.5浓度比D=1对数值I=0.1761
t表t=2.08样品方差S^2=0自由度f=21
R的对数M=－0.0052回归系数g=0.0552标准误差Sm=0.0205
对数比值R=0.9880R上限Rh=1.089R下限Rl=0.8951
测定效价Pt=98.8002Pt上限Ph=108.9019Pt下限Pl=89.5091
平均可信限率Pt的FL%=9.81
实验说明：
菌液：
III号培养基培养18个小时。
溶液配制：
由1000单位→100单位→5单位→0.4单位和0.6单位。
培养过程：
在WBS-100微生物比浊仪中37℃恒温振荡培养3小时30分。
问题与讨论:
符合第一条异常现象。
该结果可信限没有通过，回归数值太小，主要原因是高低剂量没有拉开，另外阳性对照数值基本上和低剂量之间的差异不是很大，其原因主要是：
①细菌年龄老化，细菌老龄化造成了对抗生素不敏感，高低剂量之间的距离过小。
出现这种情况只能更换菌种，下次做实验时最好用新鲜的菌种。
②选择的抗生素溶液浓度过低，应提高溶液的浓度，必要时提高剂间比。
2、以下是某药品检验所用WBS-100微生物比浊仪做出的一份实验结果：
实验数据如下：
00006实验日期：
2005.11.2
0.252
0.099
0.242
0.095
0.688
0.228
0.089
0.237
0.091
0.645
0.226
0.087
0.085
0.635
0.234
0.232
0.646
0.256
0.246
0.692
0.255
0.090
0.249
0.092
0.686
0.253
0.088
0.675
0.094
0.694
1.957
0.737
1.938
0.729
5.361
0.436
试品间F1=0.7115回归F2=5758.2777偏离平行F3=0.1181
剂间F6=1919.7024组间F7=4.5630
t表t=2.08样品方差S^2=0.0032自由度f=21
R的对数M=－0.0052回归系数g=0.0552标准误差Sm=0.0205
对数比值R=1.0045R上限Rh=1.0158R下限Rl=0.9934
测定效价Pt=100.4517Pt上限Ph=101.5752Pt下限Pl=99.3413
平均可信限率Pt的FL%=1.11
菌液：
III号培养基培养18个小时。
加样操作：
符合第三条异常现象
1、测定效价准确，可信限也非常低；
但是高低剂量浊度值低而且差距太大，主要是因为抗生素对细菌的抑制太明显，细菌生长缓慢。
2、造成这种情况的原因是抗生素浓度过高。
3、左右效价差距大约在一个效价单位左右，精度很好。
3、以下是本公司实验室工作人员做出的一些报告：
硫酸庆大霉素原料（自身对照）编号：
2005.11.2
0.558
0.375
0.554
0.379
1.866
0.551
0.372
0.365
1.839
0.539
0.367
0.532
0.358
1.796
0.550
0.357
0.556
0.368
1.831
0.565
0.404
0.559
0.391
1.919
0.536
0.374
0.381
1.823
0.549
0.382
0.380
1.869
0.569
0.581
0.383
1.912
4.417
3.010
4.423
3.005
14.855
0.692培养时间：
4小时试管型号：
1㎝
试品间F1=0.0004回归F2=3369.3252偏离平行F3=0.0511
剂间F6=1123.1250组间F7=7.0663
t表t=2.08样品方差S^2=0.0001自由度f=21
R的对数M=－0.0001回归系数g=0.0013标准误差Sm=0.0205
对数比值R=0.9999R上限Rh=1.0145R下限Rl=0.9854
测定效价Pt=99.9856Pt上限Ph=101.4499Pt下限Pl=98.5425
平均可信限率Pt的FL%=1.45
斜面培养基培养20小时，加2毫升菌液。
在WBS-100微生物比浊仪中37℃恒温振荡培养4小时。
问题与讨论：
1、总体结果良好，高低剂量之间的差距拉开明显，并且符合药典规定吸光度的范围。
估计效价及可信限率均不错。
2、只要每个比色皿中加入的抗生素准确、精密，菌液及培养基加入也准确，这种做法培养出来的结果可以达到不错的效果。
4、以下实验是在某省所做出的回收率实验报告：
该报告左半部分拉丁方阵是测定90%的含量，右半部分是测定110%的含量。
硫酸庆大霉素原料（自身对照）编号：
2005.11.29
左侧：
90%含量测定
0.428
0.279
0.450
0.314
1.480
0.432
0.270
0.438
0.310
1.450
0.411
0.265
0.315
1.461
0.403
0.301
0.445
0.318
1.467
0.562培养时间：
3小时50分试管型号：
试品间F1=23.7193回归F2=375.4530偏离平行F3=0.0048
剂间F6=133.0591组间F7=0.1892
组数m=8估计效价At=100
t表t=2.2620样品方差S^2=0.0002自由度f=21
R的对数M=－0.0425回归系数g=0.0136准误差Sm=0.0094
对数比值R=0.9067R上限Rh=0.9511R下限Rl=0.8621
测定效价Pt=90.6721Pt上限Ph=95.1124Pt下限Pl=86.2056
平均可信限率Pt的FL%=4.91
左侧测得的效价与90%非常接近,高低剂量之间基本上也已经拉开一定的距离，可信限也能控制在5%以内，偏率平行也通过，表明该结果符合要求。
右侧：
110%含量测定
0.412
0.258
0.385
0.219
1.274
0.275
1.303
0.398
0.241
0.352
1.219
0.400
0.261
0.390
0.231
1.282
试品间F1=33.8013回归F2=664.1970偏离平行F3=0.1525
剂间F6=232.7171组间F7=2.4152
t表t=2.2620样品方差S^2=0.0001自由度f=21
R的对数M=－0.0415回归系数g=0.0077标准误差Sm=0.0070
对数比值R=1.1002R上限Rh=1.1421R下限Rl=1.0614
测定效价Pt=110.0165Pt上限Ph=114.2058Pt下限Pl=106.1382
平均可信限率Pt的FL%=3.67
高剂量抗生素吸收度稍微偏低
右侧测得的效价与110%非常接近，高低剂量之间也拉开了距离，可信限也控制在5%以内，偏率平行也通过，表明该结果也符合要求。
综合讨论：
由以上的左右两组拉丁方阵测得的结果可以看出：
在比浊仪上同时测得两组含量不同的样品，结果也能达到非常好的效果。
5、以下是某药品检验所做出的实验结果：
该硫酸庆大霉素注射液含量不符合规定
硫酸庆大霉素注射液编号：
00003实验日期：
2005.11.04
初试结果：
0.453
0.312
0.335
1.569
0.448
0.325
0.458
0.354
1.585
0.455
0.319
0.478
0.342
1.594
0.459
0.323
0.349
1.613
0.440
0.341
1.577
0.320
0.472
0.362
1.599
0.447
0.328
0.466
1.582
0.433
0.305
0.348
1.556
3.580
2.550
3.773
2.772
12.675
试品间F1=90.5336回归F2=2168.3692偏离平行F3=0.4421
剂间F6=753.1149碟间F7=1.3384
组数m=8估计效价At=100
剂间比r=2浓度比D=1.0016对数值I=0.3010
t表t=2.08样品方差S^2=0.0059自由度f=21
R的对数M=－0.0608回归系数g=0.0020标准误差Sm=0.0066对数比值R=0.8693R上限Rh=0.8970R下限Rl=0.8420
测定效价Pt=86.9329Pt上限Ph=89.7018Pt下限Pl=84.2023
平均可信限率Pt的FL%=3.16
复试结果：
0.568
0.599
0.361
1.882
0.579
0.605
0.405
1.937
0.582
0.611
0.418
1.973
0.347
0.594
1.885
0.575
0.612
0.415
1.967
0.562
0.359
0.602
0.409
0.567
0.364
0.614
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