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10-4ug和5.85×

10-4ug。

该实验体现了反相高效液相色谱法简便、快速、稳定，能准确测定化妆品中对羟基苯甲酸酯类防腐剂的含量的优势。

关健词：

反相高效液相色谱法；

化妆品；

防腐剂

DeterminationofpreservativesinCosmeticProductsbyReversed-PhaseHighPerformanceLiquidChromatography

Abstract：

Inthispaper,RP-HPLCwasusedtomeasurethecontentofpreservativesincosmetics.InRP-HPLCmethod,ontherelevantexperimentalconditionswereoptimized,suchas:

theuseofethylalcoholastheextractionsolventextractionofcosmeticspreservativeParabens;

columnsystemwasalkylShimpackVP-ODSC18column（4.6mmi.d×

150mm,5μm）;

Injectionvolumewas5ul；

Mobilephaseofacetonitrile：

2%aceticacidaqueoussolution=45：

35（v/v）；

Theflowratewas0.8ml/min；

Thecolumntemperaturewas30℃；

thedetectorwasUVdetectoranditswavelengthwas254nm.Theresultsshowthattheconcentrationintherangeof25~1000μg/mLpreservativecontentofeachchromatographicpeakareawithagoodlinearcorrelationandtheirLinearregressionequationwereMethylparaben（MP）y=2.556224×

Ethylparaben（EP）y=2.62564×

Propylparaben（PP）y=2.704263×

Butylparaben（BP）y=3.016108×

10-5x＋1.567237andtheircalibrationcoefficientswereabout0.9997、0.9999、0.9994、0.9999（n=5）.Methodrecoverieswereparabenscontentrecoverywas88.748%-115.042%andtheaveragerecoverywas98.448%.Experimentsshowthattherelativestandarddeviation（n=6）were4.56%、0.95%、2.56%、1.04%.Measuredthateachantiseptic'

slimitsunder3timeofnoiseslowestexaminationwere1.35×

10-4ugand5.85×

10-4ug.SotheRP-HPLCmethodissimple,fast,stableandaccuratedeterminationofParabensincosmeticspreservativecontentadvantage.

Keywords:

RP-HPLC；

cosmetics；

preservative

目录

I

II

1前言1

1.1目前化妆品使用的防腐剂1

1.2防腐剂的性质1

1.3防腐剂的危害2

1.4目前防腐剂检测方法及其不足2

1.5本文防腐剂检测方法的选择3

1.6本研究的目的与意义4

2实验部分5

2.1实验仪器5

2.2实验试剂5

2.3色谱条件6

2.4标准溶液的制备6

2.4.1标准储备液的配制6

2.4.2标准使用液的配制6

2.4.3标准混合使用液的配制6

2.5化妆品样品的选取及处理6

2.5.1化妆品的选取6

2.5.2化妆品萃取方法的选取6

2.5.3化妆品的处理6

3结果与讨论6

3.1检测波长的选择6

3.2固定相的选择7

3.3流动相的要求与选择8

3.4最佳色谱条件下各标准防腐剂样品的色谱图9

3.5对羟基苯甲酸酯类标准曲线的制作及检出限10

3.5.1对羟基苯甲酸酯类标准曲线的制作10

3.5.2对羟基苯甲酸酯类的检测限11

3.6精密度实验11

3.7准确度实验12

3.8实际化妆品样品的测定13

3.9某些化妆品样品的测定色谱图13

4结论14

参考文献16

致谢18

1前言

1.1目前化妆品使用的防腐剂

随着国内外化妆品原料的日新月异,技术的日趋尖端，21世纪美容化妆品行业也发生了空前绝后的发展。

然而，化妆品里含有水分、胶质、脂肪酸、类脂物、蛋白质、激素与维生素等均易引起微生物繁殖变质，为使化妆品质量得到保证必须加入防腐剂。

常用的防腐剂有以下几种：

a.对羟基苯甲酸酯类具有中性、无毒性、不挥发、稳定性好等特点，在酸性、碱性介质中均有效，而色、味对化妆品无影响，其用量为产品总量的0.2%左右，因此是应用最广泛的化妆品防腐剂。

b.醇类乙醇是醇类防腐剂中应用最广泛的一种。

在PH=4~6的酸性溶液中其浓度为15以下的有抑菌作用；

在PH=8~10的碱性溶液中其浓度为17.5以上的有抑菌作用。

异丙醇的抑菌效果与乙醇相当，二元醇或三元醇抑菌效果较差，一般浓度在40以上，所以不常用。

c.香料类如丁香酚、香兰素、柠檬醛、橙叶醇、香叶醇和玫瑰醇等。

d.酚类氯化酚是较多采用的化妆品防腐剂。

如3-甲基-4-氯代酚，3,5-二甲基-4-氯代酚，二氯间二甲酚，甲基氯代麝香草酚，六氯二烃基二苯甲烷等。

【1】

其实国内应用的防腐剂有60种以上,我国《化妆品卫生标准》中对66种防腐剂在化妆品组份中限制了含量和使用生产化妆品的种类及条件【2】。

但随着化妆品生产量的增长和品种的不断变化,防腐剂的使用也在不断改变。

传统的防腐剂一般为有机酸或其钠盐类、醇、醛、酚、酯及有机汞等,现已较少使用【3】。

目前化妆品防腐剂使用最多的是对羟基苯甲酸酯类（尼泊金酯类）【4】,氨基酸类衍生物作为一类较新的防腐剂逐渐被应用。

特别是对羟基苯甲酸酯（Paraben）又称尼泊金酯，因其低毒、非挥发性、良好的杀菌能力和稳定性而被用作防腐剂，是一类低毒高效防腐剂。

1924年首次被报道具有抗菌活性【5】，1932年被用作食品的防腐剂【6】。

下面介绍本实验测定的对羟基苯甲酸酯类中的四种防腐剂见图1

图1四种对羟基苯甲酸酯类防腐剂

1.2防腐剂的性质

防腐剂是指天然或合成的化学成分，用于加入食品、药品、化妆品、颜料、生物标本等，它可以延迟微生物生长或化学变化引起的腐败变质从而延长保质期。

防腐剂的防腐原理，大致有如下3种：

一是干扰微生物的酶系，破坏其正常的新陈代谢，抑制酶的活性。

二是使微生物的蛋白质凝固和变性，干扰其生存和繁殖。

三是改变细胞浆膜的渗透性，抑制其体内的酶类和代谢产物产物的排除，导致其失活。

不同的防腐剂有不同的生理功能：

在食品中，防腐剂能抑制微生物活动，防止食品因物理因素、化学因素和有害微生物等引起的腐败变质，从而保持食品原有品质和营养价值并延长食品的保质期；

在纤维和木材中使用的防腐有矿油、煤焦油、丹宁，因其具有优异的杀菌效力和良好的环保性能，因此能有效地延长木制品的使用周期，还可以起到环保作用；

在生物标本中用甲醛、升汞、甲苯、对羟基苯甲酸丁酯、硝基糠腙衍生物或香脂类树脂，既可以使得生物标本的原色保持不变，机体新鲜柔软，不萎缩，不变形，又能达到了永久保存，长期保色、保鲜的目的；

在化妆品中，防腐剂的作用是保护产品，使之免受微生物污染，延长产品的货架寿命，确保产品的安全性，防止消费者因使用受微生物污染的产品而引起可能的感染【7】。

1.3防腐剂的危害

防腐剂是由人工合成，使用不当会有一定负效应，长期过量摄入亦会对消费者的身体健康造成一定损害。

儿童、孕妇等属于身体发育特别时期的特殊人群，在化妆品的摄取方面应该重点予以保护，建议不要给他们使用那些含有过多防腐剂的化妆品。

目前，各式各样的化妆品在人们日常生活中越来越受欢迎了，每天的摄入量非常大，如果长期或过量摄入防腐剂对人体的危害是非常大的，因此，选择购买化妆品的时候要尽可能选择不含防腐剂的化妆品，购买时可以留意产品的保质期。

因为长期使用含防腐剂过多的化妆品，会破坏皮肤的细胞，影响皮肤的新陈代谢，血液循环，药物毒素积累，毛孔堵塞严重，如果是油质皮肤，皮脂腺分泌的脂肪不容易排除，会形成皮肤炎，容易长粉刺、暗疮，甚至引起皮肤溃烂。

比如：

食用含有过量苯甲酸和山梨酸的食品会影响人体对维生素和钙的吸收，加重人的肝脏负担，并引起毒性反应或诱发癌症【8】。

有报道说：

连目前使用最广泛的对羟基苯甲酸酯类会引起接触性皮炎【9-12】。

近期研究在很多体外实验和动物模拟体内试验表明对羟基苯甲酸甲、乙、丙、丁醋都拥有雌激素活性。

Routledge【13】等首次报道了对羟基苯甲酸酯的雌激素活性，说明它们在新方面的毒性，并暗示必须重新评价对羟基苯甲酸酯的安全性。

oishi也报道了对羟基苯甲酸酯显现出雌激素活性。

还有水杨酸：

功能是去角质、祛斑、嫩肤，危害是刺激皮肤，使皮肤免疫能力降低；

激素：

功能是去红斑、抗过敏等等，但同时却可能引起内分泌紊乱。

1.4目前防腐剂检测方法及其不足

近年来，防腐剂的检测一直是食品、化妆品分析中必不可少的环节，并且只单一的检测某一种防腐剂己经满足不了各行业的要求，因此建立一种同时快速、准确确定防腐剂种类与含量的方法就会显得尤为重要。

国内外学者都在积极地开发检测防腐剂的快速、准确、有效的方法。

采用毛细管电泳【14-16】，凝胶电泳【17】的报导。

国内外测定化妆品中防腐剂、防晒剂含量的方法有:

薄层色谱法【18】、气相色谱法【19】和高效液相色谱法【20-23】，还有其他报道【24,25】，王萍等【26】采用胶束电动毛细管色谱成功测定了化妆品中的重氮烷基脲和对羟基苯甲酸酯类防腐剂等。

但是从检测方面的数量和精度上都不能满足当前化妆品检测的需要，必须应用最新的仪器分析手段，如光谱、色谱、有机质谱等技术提高分析方法的准确性和精确性。

具体方法如下：

（1） 

吸光光度法多用于原料分析，例如4-氨基安替比林比色法适用含有羟基化合的定量。

但是吸光光度法的主要缺点是准确度不高，标准系列不能久存，需要在测定时临时配制。

（2） 

毛细管电泳法是近十几年来研究较多的新方法，它具有快速、溶剂消耗和样品需求量小等特点。

最近，Mahusie:

PE等【27】首次报道了一种微乳化电动色谱法检测对羟基苯甲酸酯及其杂质，该方法可以选择性定量对羟基苯甲酸酯和对羟基苯甲酸。

（3） 

气相色谱法在用于测定含有羟基和羧基等极性物质时，一般需经过甲基硅烷化、衍生化后再用气相色谱定性，定量。

因此，气相色谱法分析对羟基苯甲酸酯时操作往往很费时，在防腐剂检测中受到一定限制。

（4） 

薄层色谱法是防腐剂分析中最广泛应用的方法之一，用以进行药品的鉴别、杂质检查或含量的测定。

薄层色谱法是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，也用于跟踪反应进程。

本法最大特点是能进行多种组分的定性，并且不需要特殊仪器设备，便于推广。

（5）高效液相色谱法是当前使用最广泛的方法。

因为防腐剂大多是大分子有机物，并且有紫外吸收特性，最适于用高效液相色谱分析。

而且现代高效液相色谱配有计算机，不仅能够自动处理数据，绘图和打印分析结果，而且能够对仪器的全部操作包括流动相选择，流量，柱温，检测器波长的选择，进样等度洗脱方式等进行程序控制，实现了仪器的全自动化。

该法具有操作简便、分离效能高、选择性高、灵敏度高、分析速度快等优点。

1.5本文防腐剂检测方法的选择

高效液相色谱法（HighPerformanceLiquidChromatography\HPLC）又称“高压液相色谱”（highpressureliquidchromatography）、“高速液相色谱”（highspeedliquidchromatography）、“高分离度液相色谱”（highresolutionliquidchromatography）、“近代柱色谱”等。

它是本世纪60年代末期，在经典液相色谱法（俄国植物学家茨维特M.S.Tswett提出的经典液相色谱法）和气相色谱法的基础上，发展起来的新型分离分析技术。

它在分析速度、分离效能、检测灵敏度和操作性自动化方面，都达到了和气相色谱法相媲美的程度，并保持了经典液相色谱对样品适用范围广、可供选择的流动相种类多和便于作制备色谱等优点。

由于使用高压泵输送流动相，采用洗脱装置，可在柱后直接检测出液成分，高效液相色谱法完成分离的时间只需几分钟，比经典色谱法快数百倍。

至今，高效液相色谱法已在生物工程、制药工业、食品工业、环境监测、石油化工、农学、商检和法检等领域获得广泛的应用。

【28】

现代高效液相色谱配有计算机，不仅能够自动处理数据，绘图和打印分析结果，而且能够对仪器的全部操作包括流动相选择，流量，柱温，检测器波长的选择，进样梯度洗脱方式等进行程序控制，实现了仪器的全自动化。

目前高效液相色谱已成为化学、药学、医学、生物化学、环保等学领域中重要的分离、分析技术。

高效液相色谱法具有以下优点：

（1）分离效能高。

由于新型高效微粒固定相填料的使用，液相色谱填充的柱效可达2×

103~5×

104块/m理论塔板数，远远高于气相色谱填充柱103块/m理论塔板数的柱效。

（2）选择性高。

由于液相色谱柱具有高柱效，并且流动相可以控制和改善分离过程的选择性。

因此，高效液相色谱法不仅可以分析不同类型的有机化合物及同分异构体，还可以分析在性质上极为相似的旋光异构体，并已在高疗效的合成药物和生化物的生产控制分析中发挥了重要作用。

（3）检测灵敏度高。

在高效液相色谱法中使用的检测器大多数都具有较高的灵敏度。

如被广泛使用的紫外吸收检测器，最小检出量可达10-9g；

用于痕量分析的荧光检测器，最小检出量可达10-12g。

（4）分析速度快。

由于高压输液泵的使用，相对于经典液相色谱，其分析时间大大缩短，当输液压力增加时，流动相流速会加快，完成一个样品的分析时间仅需几分钟到几十分钟。

高效液相色谱法除具有以上特点外，还有它的色谱柱可反复使用、样品不被破坏、应用范围广、易回收等优点。

由于它使用了非破坏性检测器，样品被分析后，在大多数情况下，可除去流动相，实现对少量珍贵样品的回收，亦可用于样品的纯化制备【29】。

1.6本研究的目的与意义

近些年来，随着国内外化妆品原料的日新月异,技术的日趋尖端，21世纪美容化妆品行业也发生了空前绝后的发展。

然而，化妆品里含有水分、胶质、脂肪酸、类脂物、蛋白质、激素与维生素等均易引起微生物繁殖变质，使得化妆品销售不好。

那么受利益驱使，有些不法企业在化妆品当中添加过多的防腐剂（苯甲酸、山梨酸等）后投入市场，牟取暴利，严重危害了消费者的权益。

目前化妆品中允许使用的防腐剂多达60种以上，过量使用防腐剂可引起过敏性皮炎和接触性皮炎，包括目前应用最广泛、最安全的对羟基苯甲酸酯类防腐剂也可引起接触性皮炎。

国外已有很多关于对羟基苯甲酸酯类防腐剂检测的报道，国内也有少量报道，但尚无对羟基苯甲酸酯类的标准检验方法。

本文通过建立一个简单、快速、稳定，能准确测定化妆品中对羟基苯甲酸酯类防腐剂的含量的检测方法，对于保护人们身体健康，完善现有化妆品质量与安全检测方法体系，促进美容业快速健康发展有着重要意义。

因为发现目前采用液相色谱检测防腐剂的报道中：

某些研究人员在样品前处理方法中，他们一般用正己烷、乙醚等非极性溶剂萃取，然后再用甲醇或乙腈等极性溶剂进行液——液分配，取极性溶剂进行旋蒸浓缩定容过膜进行测定；

而流动相选择方面也选取甲醇、乙腈等其他费用高、耗量大、毒性大的试剂；

在流速、柱温方面也选择不当等，这些工作对检测化妆品中防腐剂的分析有一定的限制作用。

因为这样用液相色谱检测防腐剂既发挥不了液相色谱的优势还消耗时间长、费用高，甚至对人的身体健康造成威胁。

比如甲醇、乙腈对操作人员的健康危害大。

本实验建立了反相高效液相色谱法测定化妆品中几种防腐剂的含量，并对相关的实验条件进行了优化：

采用乙醇作为提取剂提取化妆品中的对羟基苯甲酸酯类防腐剂，流动相为乙醇：

柱温为30℃。

无论在选材方面，选用价格低廉又对环境无污染的乙醇，还是在操作方面能够自动地对仪器的全部操作包括流动相选择，流量，柱温，检测器波长的选择，进样等度洗脱方式等进行程序控制，还充分体现了反相高效液相色谱法在准确测定化妆品中对羟基苯甲酸酯类防腐剂的含量的过程中操作简便、分离效能高、选择性高、灵敏度高、分析速度快等优点。

并且对完善化妆品质量与安全检测方法体系，促进美容业快速健康发展有着重要意义，还对探索化妆品中防腐剂的探讨也有非常重要的意义。

2实验部分

2.1实验仪器

LC-20AT型高效液相色谱仪（LC-20AT送液泵（日本岛津公司）

SPD-20A紫外检测器、CBM-20Alite系统控制器（日本岛津公司）

ShimpackVP-ODS4.6mmi.d×

150mm，5μm色谱柱（日本岛津公司）

kromasilPhenyl苯基柱4.6mmi.d×

YMC-Pack胺基柱4.6mmi.d×

250mm，5μm色谱柱（日本岛津公司）

CTO-20A柱温箱（日本岛津公司）

KHB单道可调移液器（上海科华实验系统有限公司）

SK2510HP型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）

FA1004电子分析天平（苏州江东精密仪器有限公司）

YXJ-2型高速离心机（江苏省金坛市环宇科学仪器厂）

C20孔玻璃仪器气流烘干器（上海羌强仪器设备有限公司）

SHZ-95型循环水式多用真空泵（河南巩义市英屿予华仪器厂）

DGX-9143BC-1型鼓风干燥器（上海福玛实验设备有限公司）

755B紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司制造）

0.45um滤膜（上海亚东核级树脂有限公司）

定性滤纸（杭州新华纸业有限公司）

10uL微量注射器

UP-90超纯水器（南京前沿仪器设备有限公司）

2.2实验试剂

乙醇（一级色谱纯，天津市四友精细化学品有限公司出品）。

2%醋酸水溶液（由10mL的醋酸+490mL的二次蒸馏水）

对羟基苯甲酸甲酯（C8H8O3，色标5g,含量不少于99.5%，天津市光复精细化工研究所）

对羟基苯甲酸乙酯（C9H10O3，色标5g,含量不少于99.5%，天津市光复精细化工研究所）

对羟基苯甲酸丙酯（C10H12O3，色标5g,含量不少于99.5%，天津市光复精细化工研究所）

对羟基苯甲酸丁酯（C11H14O3，色标5g,含量不少于99.5%，天津市光复精细化工研究所）

2.3色谱条件

色谱柱：

ShimpackVP-ODS（4.6mmi.d×

150mm，5μm）C18烷基柱

35（v/v）

流速为0.8ml/min

进样体积5uL

柱温为30℃

检测波长254nm

2.4标准溶液的制备

2.4.1标准储备液的配制准确称取对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯各0.05g，分别用乙醇溶解后移至并定容于4只50mL棕色容量瓶中，配制成浓度为1000ug/mL的各防腐剂标准储备液，再用SK2510HP型超声波清洗器超声脱气15min，待用。

2.4.2标准使用液的配制分别准确移取上述四种防腐剂标准储备液100uL置于4只10mL棕色容量瓶中，用乙醇定溶后配制成浓度均为10ug/mL的四种酯类化合物的标准使用液，摇匀备用。

2.4.3标准混合使用液的配制分别准确移取上述四种防腐剂标准储备液100uL置于同1只10mL棕色容量瓶中，用乙醇定溶后配制成浓度为10ug/mL的四种酯类化合物的标准混合使用液，摇匀备用。

2.5化妆品样品的选取及处理

2.5.1化妆品的选取任意选择平时人们所使用的化妆品（膏霜类、固体类、水类、乳液类）。

2.5.2化妆品萃取方法的选取由于超声波提取能够持续均匀地作用于样品，是一种较好的提取方式，而离心处理有利于提取和分离，故实验选择了运用超声离心相结合处理化妆品样品的方式。

2.5.3化妆品的处理称取1.000g的化妆品于小烧杯中，加入少量的乙醇及适量的无水硫酸钠，摇匀，超声萃取15min，取上清液经5000r/min离心10min，残渣加入少量乙醇洗涤再提取，合并上清液，取上清液经0.45nm滤膜过滤后，装进10mL棕色容量瓶中，再加乙醇定溶后待用。

3结果与讨论

3.1检测波长的选择

选取1000ug/mL的4种防腐剂标准储备液经过755B紫外分光光度计在220、230、254、260、280nm波长下进行扫描处理。

经试验证明，220nm、230nm波长时，在等度洗脱过程中，基线不稳定，流动相响应信号基线本底值较高，各防腐剂的灵敏度不高；

260nm、280nm时，流动相响应信号很差，各防腐剂的灵敏度同样也不高；

然而，根据各防腐剂成分的吸收光谱，选择检测波长为254nm时，各组分均可获得较高的灵敏度。

所以考虑到应使每个组分成分的测定灵敏度尽可能大，通过比较4个组分成分分离和灵敏度，选