泡菜中耐盐细菌的16SRRNA基因序列分析Word格式文档下载.docx
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1.3分子生物学方法在微生物多样性研究中的应用9
1.4乳酸菌与泡菜10
1.5乳酸菌在泡菜生产中的作用10
1.5.1改善泡菜的风味10
1.5.2提高泡菜的营养价值10
1.5.3延长泡菜的保质期11
1.6泡菜中常见乳酸菌11
1.6.1乳杆菌属11
1.6.2链球菌属12
1.6.3肠球菌属12
1.6.4乳球菌属12
1.6.5片球菌属12
1.6.6明串株菌属13
1.7晌乳酸菌生长的因素13
1.7.1氧气13
1.7.2温度13
1.7.3pH14
1.7.4渗透压14
1.8适用于乳酸菌鉴定的方法14
1.8.1形态特征和生理生化特性分析14
1.8.2分子生物学鉴定15
2材料和方法15
2.1材料15
2.1.1供试样品从15
2.1.2样品采集15
2.1.3仪器设备与试剂15
2.1.4培养基17
3耐盐菌16SrDNA文库的建立及ARDRA分析17
3.1实验室分离纯化菌落17
3.2提取DNA17
3.3用PCR反应扩增16SDNA18
3.4用凝胶电泳检验16SrRNA是否扩增19
3.5对扩增后的16SrDNA纯化19
3.616SrDNA文库的建立19
3.7ARDRA分析20
4结论21
5总结与体会22
6致谢词23
【参考文献】24
摘要
泡菜最早始于中国，是入们喜爱的佐餐食品，它是利用蔬菜上附着的乳酸菌自然发酵而成。
研究表明，乳酸菌能够消耗亚硝酸盐，产生细菌素，积累维生素、有机酸等，并且赋予泡菜特别的风味。
乳酸菌是泡菜生产过程中的一个主要菌群，在整个发酵过程中起着积极的作用，加强对其生物多样性的了解，对于开发泡菜中的优良乳酸菌资源具有重要的意义。
研究16SrRNA基因序列分析泡菜中乳酸菌的多样性。
分子生物学方法近年来己被广泛应用于微生物多样性的研究中，也越来越多地应用予食品微生态的研究。
在今后的研究中，有必要利用多种分子生物学技术来检测特定环境中可能具有的微生物多样性，将经典微生物学方法与免培养方法结合起来，进行综合分析。
只有这样，才能更全面、充分地认识微生物天然存在的状况。
【关键词】：
泡菜；
多样性；
乳酸菌
ABSTRACT
PicklesmayoriginfromancientChina．Thistraditionalfoodisbasedonnaturalfermentationcarriedoutbytheepiphyticlacticacidbacteria（LAB）fromthevegetablesthatwereusedforrawmaterialsofpicklesLABplaysanimportantroleintheproductionofpickles．LABcanproduceorganicacids，bacteriocin，vitamins，andothernutrients，consumenitrite，andgiveaspecialflavortopickles．Lacticacidbacteria（LAB）ai'
ethedominantmicroorganismsinthefermentedvegetablesincetheypalyanactiveroleinthewholefermentation．StudyingonthebiodiversityCanhelptoexploittheLABresource，itwillworkwellinthepracticallyapplication．1heaimofthisstudyWaStoinvestigatethebiodiversityoflacticacidbacteriainthetraditionalfermentedvegetableby16SrRNAgenesequencing．
Molecularbiologicalmethodswerewidelyusedtostudythemicrobialdiversity，andintroducedintotheresearchonfoodmicroecologyinrecentyears。
Itsuggestedthatweshouldapplydifferentmolecularapproachesandthecombinationofculture—dependantandculture-·
independentmethodsintheanalysisofmicrobialdiversity，sowecanassessthemicrobialdiversitymoreadequatelyandobjectively．
KeyWords：
pickles；
biodiversity；
lacticacidbacteria
缩略词
缩写英文全名中文名
CTABCetyltrimethylammoniumbromide十六烷基三甲基溴化铵EDTAEthlenediaminetetraacetic乙二胺四乙酸SDSSodiumdodecylsulfate十二烷基硫酸钠PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应dNTPDeoxynucleosidetriphosphate脱氧核苷三磷酸
SecSecond秒
Mlnminute分钟
Mlmilliliter毫升
Epeppendorf离心管
1.文献综述
乳酸菌是一类能利用可发酵碳水化合物（主要指葡萄糖）产大量乳酸的革兰氏阳性细菌的通称，其种类多、资源丰富，并广泛应用于工、农、医、食品、饲料和化工等方面[1]。
乳酸菌在自然界分布广泛，是生物圈的重要组成部分，且具有特殊的生理活性和营养价值，乳酸菌的分离、特性和应用研究受到日益重视。
近年来乳酸菌发酵制品越来越受到大家的欢迎，特别是通过乳酸菌发酵得到的蔬菜加工品——泡菜。
蔬菜表面通常附生有细菌、酵母菌和霉菌等多种微生物，在泡菜的制作过程中乳酸菌最终成为优势菌，其代谢产物和低氧份的环境抑制了食品腐败菌的生长，从而保障了食品的品质和风味。
为了更全面的认识和研究泡菜中的乳酸菌，不仅必需了解乳酸菌发酵泡菜的机理，更要加强对泡菜中乳酸菌群的结构和多样性的了解，这对于开发泡菜中优良乳酸菌资源，揭示乳酸菌群结构与功能的联系，指导乳酸菌群落功能的定向调控具有重要意义[2]。
1.1微生物简介
微生物是一类丰富的生物资源，种类繁多，数量巨大，包括了从原核生物到真核生物的不同类群：
如细菌、真菌、放线菌、原生动物、部分藻类和病毒。
微生物作为地球生态系统中重要的一员，其多样性在维持生物圈生态平衡和为人类提供大量多种珍贵资源方面起着重要的作用，它们的价值是无法估量的。
微生物的多样性是指在一个集合群落中，众多不同类型微生物的变化及它们之间相对的丰度。
对微生物多样性的研究不仅将极大地推动生命科学的发展，也将有利于发现新的有用微生物资源，进一步造福人类。
与宏观生物不同的是，由于微生物本身所具有的个体微小、形态结构简单等特点，致使微生物的多样性在形态和分化上表现并不突出，而主要表现在物种和基因水平上，因此要对自然环境中的微生物多样性有一个客观的认识是一个非常艰巨的任务。
对微生物资源的认识、保护是整个生物圈保护中必不可少的内容，所以人们一直在努力探索研究、开发微生物资源，以期更加客观、真实地认识它们，从而更好应用微生物为人类造福。
近年来，对微生物多样性的研究闩益受到人们的重视。
研究微生物生态学有两个主要的趋向：
一是利用各种分子生物学技术或与传统方法的结合，以期更客观地认识研究环境中微生物的丰度、均度等自然存在状况：
二是加强对极端环境微生物的研究，以期发现新的特殊的微生物资源，了解其适应极端环境的机制。
1.2传统方法在微生物多样性研究中的应用
传统的研究方法是首先从特定自然生境（如土壤、水）中取样，采用模拟自然生境的各种培养基和条件进行分离培养，通过纯培养获得菌株后，再对其表型特征、细胞的性质（形态学、生理生化反应和细胞组成成分结构的观察）进行观察收集，能对其特性进行描述，这种方法又被称作经典方法。
经典方法需要进行一系列繁杂的形态特征和生理生化实验，相关的实验做得越多，得到的结果就更可靠一些。
它最大的缺点是，即使最复杂的实验组合也不能对分离物进行精确的鉴定，而且不能揭示分离物间的系统发育关系。
对乳酸菌而言，应用经典方法对其进行准确鉴定非常困难，因为不同的种在适应某一环境后就有相应的新的营养要求[3]。
人们不能利用传统的微生物技术获得微生物多样性的真正概貌，这首先在温泉、瘤胃和废水处理工厂[4]的微生态研究中得到证实，那里的许多微生物很难培养或者根本不能培养。
Suau等（1999）的研究结果表明，人类肠道中60．80％的微生物在目前是不能培（unculturable）。
实际上，我们已经知道，在自然环境中能够分离培养的微生物的数量还不到自然界微生物总数的1％（Norman．1996），还有相当多的微生物因无法培养而未被认识。
传统培养方法严重地限制了我们认识微生物的视野，由于缺乏再现环境条件的方法和培养基质，造成了大多数微生物难以被标准实验室方法复苏分离和培养。
这对于人们确认识微生物资源，开发并利用这些资源造成了严重的障碍。
因此，传统方法严重地制约了人们对微生物生态的认识。
虽然传统的依靠培养的方法制约了人们对微生物生态的客观认识，并存在着研究周期较长等缺点。
但是通过纯培养获得菌株后可以对其进行深入、全面的研究，最终确定其分类学地位并为人类所利用，此外还可以加强人们对微生物群落结构与功能的认识。
因而在微生物学的研究中，经典的微生物技术仍然将是一个不可替代的方法。
1.3分子生物学方法在微生物多样性研究中的应用
近十年来，分子生物学的发展使得我们可以摆脱依赖培养的传统方法的束缚，开辟了一条更客观的探索环境中微生物多样性的新思路、新途径。
Pace等（1986）首次将5SrRNA基因用于环境样品中总微生物的测定，随之很快被用于微生物多样性研究领域。
由于5SrRNA基因相对较小（约120个核营酸），携带信息相对较少，因而揭示微生物群落多样性的能力有限。
16SrRNA（约1．5kb）种类少，含量大（约占细菌RNA含量的80％），分子大小适中，存在于所有生物中，特别是其进化具有良好的时钟性质，在结构与功能上具有高度的保守性，素有“细菌化石”之称。
细菌的16SrRNA的可变区序列因不同细菌而异，恒定区序列基本保守，设计引物将16SrRNA基因扩增出来，利用可变区序列差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定，判定不同菌属、菌种的细菌的遗传关系远近，因而更适于微生物多样性的研究。
目前，16SrRNA基因序列分析己广泛应用于微生物多样性的研究。
比较微生物的相对进化关系，典型的方法是比较不同微生物的类似基因并计算它们碱基序列的不同，微生物间的碱基数相差越多，所比较微生物的进化关系越远，类似数据用于计算所比较微生物的进化距离并由此建立系统发生树或进化多样性图谱。
近年来，随着分子生物学技术的不断发展，DNA标记技术已成为探讨种群遗传变异的重要选择。
主要包括限制性片段长度多态性（Restrictionfragmenttengthpolymorphism，RFLP）、随机扩增多态性（RandomlyamplifiedpolymorphicDNA，RAPD）、扩增片段长度多态性（Amplifiedfragmentlengthpolymorphism，AFLP）、末端限制性片段长度多念性（Terminalrestrictionfragmentlengthpolymorphism，T-RFLP）、变性梯度凝胶电泳（Denaturinggradientgelelectrophoresis，DGGE）、荧光原位杂交（Fluorescenceinsituhybridization．FISH）等。
1.4乳酸菌与泡菜
根据国际公认的分类系统——伯杰氏系统，在《伯杰氏系统细菌学手册》第9版中，乳酸菌属于真细菌纲（Eubacteriac）真细菌目（Eubacteriales）中的乳酸细菌科（Lactobacillaceae）。
60年代之前，乳酸菌主要按细菌的形态、培养条件、碳水化合物的利用、代谢产物等特性来进行分类；
而60年代之后，很多研究采用了乳酸菌细胞DNA中（G+C）的百分含量的测定。
到90年代，增加了脂类分析和醌类分析技术、16SrRNA基因序列分析和基因探针等进行测定和分类。
核分子探针杂交技术和聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction，PCR）是乳酸菌目前分类和鉴定的最常用方法。
自从1875年巴斯德发现乳酸菌以来，130多年来己发现的乳酸菌有43个属，包括373个种和亚种。
而近年来，国内外对泡菜这一微生态系统进行了多方位的研究，利用不同的分析手段从各种泡菜样品中筛选出了许多具有优良性能的菌种，其中包括乳杆菌属（Lactobacillus）[5-7]、链球菌属（Streptococcus）[8]、肠球菌属（Enterococcus）、乳球菌属（Lactococcus）[9]、片球菌属（Pediococcus）[10]、明串株菌属（Leuconostoc）[11]等
1.5乳酸菌在泡菜生产中的作用
1．5.1改善泡菜的风味
首先乳酸菌经过发酵可以产生醋酸、丙酸等有机酸，它们赋予了制品独特的酸味，可以刺激人们的食欲。
另外，这些有机酸可与乳酸菌或其他微生物发酵过程中产生的醇、醛、酮等物质相互作用，形成多种新的呈味物质⋯具有芳香味的羧酸酯类，如乳酸与乙醇结合形成乳酸乙酯等，而这些呈味物质的产生就改善了制品风味[12-13]。
1．5.2提高泡菜的营养价值
当今用于乳酸发酵泡菜的乳酸菌一般不具有硝酸还原酶和氨基酸脱羧酶，因而不会使硝酸盐还原成亚硝酸盐，也不会产生胺，所以乳酸发酵蔬菜中一般不会产生亚硝酸胺。
相反，乳酸菌分泌的肽酶可产生多种氨基酸，这些氨基酸既可以提高食品的鲜味也具有一定的营养价值。
乳酸菌进入人体后参与调节人体肠道的微生态平衡，不仅可以利用代谢产物抑制有害菌群增长，还可促进有益菌群的增殖。
另外，乳酸菌进入人体后可促进胃肠道蠕动，帮助消化，还能刺激肠道免疫细胞产生抗体，预防疾病
1．5．3延长泡菜的保质期
一方面，乳酸菌通过竞争氧气及养分来抑制其它微生物的生长。
另一方面，乳酸菌在其代谢过程中，会产生一些具有抗菌活性的物质，如：
有机酸、双乙酰、过氧化氢、二氧化碳等，这些物质可以抑制泡菜中一些腐败菌的生长，延长泡菜的保质期。
更为重要的是很多乳酸菌都能产生细菌素，经研究表明这些物质在抑制病原菌上具有重要作用。
而细菌素本身具有许多优良性质：
易被人体消化道中的一些蛋白酶（如胰蛋白酶）所降解，不会在体内蓄积而引起不良反应，无副作用、无残留，同时也不污染环境；
具有热稳定性，并耐酸、耐低温贮藏：
对制品的口感、口味等无不良影响，因而不仅适用于泡菜，更被广泛用作于食品添加剂[14-16]，如：
nisin，plantaricin[17-18]，Sakacin等，其中研究较多的是nisin，nisin对革兰氏阳性菌具有广谱抗菌活性，所以被作为硝酸盐的替代剂广泛的应用于食品的保鲜[19]，减少或避免了亚硝胺类物质对人体健康的威胁，同时又延长了食品的储藏期。
1．6泡菜中常见乳酸菌
1．6．1乳杆菌属
杆菌，细胞形态多样，一般不运动。
以发酵代谢，专性的分解糖，在碳的终产物中至少50％是乳酸。
通常不发酵乳酸盐，副产物可能是乙醇、乙酸盐、琥珀酸盐、甲醇盐和C02，一般不会产生多于2个碳原子的挥发性酸。
氧化酶阴性，几乎没有菌株以假接触酶分解过氧化物。
接触酶阴性。
罕见产色素者，如有色素一般是黄或橙色到锈红。
通常不还原硝酸盐，只有pH值最终平衡在6．O以上才会还原硝酸盐。
不液化明胶，不产生吲哚和H2S。
营养需求复杂，需要氨基酸、肽、核酸衍生物、脂肪酸、可发酵的碳水化合物和盐类等，～般而言，每个种都有特殊的需求[20].
1．6．2链球菌属
现包括在链球菌属的细菌经修改后已限定为无芽孢的化能异养菌，是类球或者球杆状的细胞，排列成链或成对，不生成芽孢。
其中很少菌株可合成过氧化物酶。
不能合成血红素，由此在联苯胺试验中是阴性[21]。
发酵代谢过程中主要是产生乳酸，不产气，不能利用氧，但可在氧中生长，因而被认为是耐氧的厌氧菌。
1．6．3肠球菌属
肠球菌属最先由Schleifer和Kilpper-Balz在1984年提议的，多数成对排列或成短链，少数种有色素如Emundtii和Ecassliflavus。
化能异养菌，能量产生主要通过同型发酵乳酸的途径，利用碳水化合物发酵后的代谢产物主要是L．（+）哥L酸。
具有LancefieldD群抗原。
一般能在lO℃和45℃下生长，在pH9．6、40％胆汁同样可以生长，耐热，60。
C处理30min仍可存活[22]。
1．6．4乳球菌属
卵圆形细胞，成对或成短链状。
兼性厌氧菌，不运动，接触酶阴性，不产芽孢。
化能异养菌，营养需求复杂。
乳球菌一般能在4％NaCI中生长，而乳酸乳球菌乳脂亚种例外，只能耐受2％NaCI。
通常能在10℃下生长，但不能再45℃中生长。
1．6．5片球菌属
细胞球形，在特定条件下，以直角的两个平面方向交替分裂形成四联状。
化能异养菌，细胞生长需要含有复杂的生长因子和丰富氨基酸的培养基，都需要生物素、泛酸和烟酸，但不需要硫胺素。
生长依赖于可发酵的碳水化合物，发酵葡萄糖产生DL．或L．（+）．乳酸盐，产酸不产气。
一般不酸化和凝固牛奶，不分解蛋白，不还原硝酸盐，不产吲哚。
氧化酶阴性，接触酶也阴性。
1．6．6明串株菌属（23）
细胞常呈豆状，不运动，不产生芽孢，接触酶阴性，无细胞色素。
化能有机营养，生长通常需要丰富的生长因子和氨基酸，所有的菌种都需要生物素、硫胺素和烟酸，不需要泛酸或泛酸的衍生物。
最适生长温度一般为20℃～30℃。
均可发酵葡萄糖产酸产气，主要产物为D-（-）-乳酸、乙醇。
不还原硝酸盐，精氨酸不水解，不酸化和凝固牛奶，不产生吲哚[23]。
1.7晌乳酸菌生长的因素
1.7．1氧气
由于乳酸菌种类繁多，因此不同的菌对氧气的需求也不尽相同。
但各种乳酸菌通常以发酵方式代谢产能，且因普遍缺乏好氧的呼吸链酶，在与游离氧的关系上，一般是一些耐氧性厌氧菌、微好氧菌、兼性厌氧菌或是专性厌氧菌。
如乳杆菌属的菌种一般都是耐氧性厌氧菌，但有少数的是微好氧，当培养时充以5％～10％的C02或降低氧压可促进其生长[24]；
链球菌属、乳球菌属、片球菌属、肠球菌属等都是兼性厌氧菌；
双歧杆菌属则为专性厌氧菌。
氧气与培养液中的pH值，对乳酸的产量有一定的影响[25]。
在厌氧条件下，连续培养保加利亚乳杆菌，培养液的pH则由酸性变为碱性，同时原来的同型乳酸发酵也会转化为异型乳酸发酵，乳酸的产量也相应减少。
1.7．2温度
一系列的生物化学反应组成了各种微生物的正常生命活动，温度对这些生命活动的影响极其明显。
乳杆菌属一般生长温度范围为2～53℃，最适生长温度在30～40℃之间，如短杆菌最适生长温度一般为35℃，但其中发酵乳杆菌一般在15℃不生长，而植物乳杆菌在45℃也不生长[26]：
片球菌属最适生长温度通常为25-45℃一般培养温度为37℃；
链球菌属生长温度范围为25～45oct50J，一般最适生长温度为37℃；
乳球菌属的最适生长温度为30℃，可以在10℃下生长，但不能在45℃下生长；
肠球菌属最适生长温度为37℃，能在lO~45℃下生长。
1.7．3pH
乳酸菌通常以乳酸为唯一或主要代谢产物，所以它们对酸性环境十分适应，乳酸菌的几个主要属的生长pH如下：
乳杆菌属最适pH为5．5～6．2，pH为9．0的时候不能生长，一旦接种到初始pH为中性或碱性的培养基中时，生长速度明显很低：
明串珠菌属一般生长pH范围在5．O以上，一般在pH4．5可以生长[27]，在pH为9．6时不能生长；
肠球菌属的生长pH范围比较广，在中性和碱性条件下生长较好，可以在pH为9．6下生存；
链球菌属生长pH范围也较广，一般还可以生长在pH为9．6下。
1.7．4渗透压
不同乳酸菌对渗透压的适应能力有较大差别，例如大多数的乳球菌属只可以在4％NaCl中生长，也有研究证明在6％NaCI中生长良好，但在8％NaCI中则生长缓慢[28]；
生长肠球菌属和链球菌属的菌种能在6．5％NaCl环境下生长，植物乳杆菌对NaCI的耐受能力最强，能耐受9．1％的NaCl，而发酵乳杆菌只能耐受5．3％的NaCl。
1.8适用于乳酸菌鉴定的方法
1.8.1形态特征和生理生化特性分析
形态特征鉴定主要是依据乳酸菌菌落形态和细胞形态的不同进行初步鉴定，但不能作为独立的鉴定方法。
菌落形态主要包括菌落在培养基平板上的色泽、形状、大小等；
而细胞形态则是对菌落在进行革兰氏染色后，再进行显微镜观察。
生理生化特性鉴定则是依据菌株不同的生理生化特性进行分析，一般可以将菌株鉴定到属。
内容一般包括过氧化氢酶试验，精氨酸产氨试验，淀粉水解试验，七叶苷水解试验，石蕊牛奶试验，明胶液化试验，乙酰甲基甲醇试验（V．P试验），H2S的产生试验，精氨酸水解试验，葡聚糖的产生试验，脲酶的测定和碳水化合物发酵产酸试验等[29-30]。
商军等就利用了形态学和生理生化相结合的方法从泡白菜、泡萝卜和泡辣椒中分离出的11个乳酸菌株进行了初步鉴定。
目前也有很多研究是根据API细菌鉴定标准[31]，利用API50CH试剂条和APICHL培养基对分离菌株进行49种碳水化合物发酵反应，经APILABPlus软件对各菌株进行鉴定。
Dicks（32）等就采用了API50CH试剂条和APICHL培养基对从南非红酒中4分离得到的19株菌株进行了分析，经API系统鉴定11株菌为L．hilgardii，另外8株菌为短乳杆菌。
1.8．2分子生物学鉴定
越来越多的研究采用了分子生物学技术来进行菌种的分类鉴定，如扩增片段长度多态性分析技术（AFLP）（33）、随机扩增多态DNA技术（RAPD）（34-35）、变性梯度凝胶电泳（DGGE）和16SrRNA基因序列分析（36）等，这些技术显示出了特异、敏感、快速、简便、重复性好等优点。
2材料和方法
2.1材料
2.1.1供试样品从
四川成都采集自然发酵泡菜汁一份。
2.1.2样品采集
采集自然发酵泡菜汁于灭菌瓶中，放入4℃冰箱中保存备用。
于
2．1．3仪器设备与试剂
（1）仪器设备
超净工作台苏净安泰
电热恒温培养箱
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