兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗安全性及效力试验.docx

兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗安全性及效力试验.docx

《兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗安全性及效力试验.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗安全性及效力试验.docx（9页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。

兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗安全性及效力试验

兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗安全性及效力试验

　　摘要：

本研究旨在对实验室制备的兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗的安全性和效力进行全面系统的研究。

实验室制备了5批次兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗，按照现行《中国兽药典》附录对疫苗进行了性状、无菌检验、甲醛残留量、安全及效力试验。

结果显示，5批次疫苗无菌检验、甲醛残留量均合格；疫苗对肉兔、獭兔、毛兔3个品种家兔均安全，接种疫苗后30、60d，剖检注射部位未见炎症反应，疫苗吸收良好，并且疫苗对怀孕母兔、未断奶仔兔、断奶幼兔也安全；对肉兔各项生产性能也没有影响，说明该疫苗具有较好的安全性。

疫苗免疫21d后，易感家兔和母兔均能抵抗兔出血症强毒攻击，说明该疫苗免疫原性良好。

　　关键词：

兔出血症病毒杆状病毒；灭活疫苗；安全性试验；效力试验

　　中图分类号：

S852.65；S858.291.53文献标志码：

A文章编号：

1002-1302（2015）11-0272-03

　　收稿日期：

2015-07-02

　　基金资助：

现代农业产业技术体系建设兔体系病毒病预防与控制岗位（编号：

CARS-44-C-1）；公益性行业（农业）科研专项（编号：

201303046）；江苏省农业科技自主创新资金[编号：

CX（14）4048]。

　　作者简介：

范志宇（1982―），男，山西太谷人，博士，助理研究员，主要从事家兔疾病防治与兽医生物技术研究。

Tel：

（025）84390337；E-mail：

fanzhiyu2007@。

　　通信作者：

王芳，博士，研究员，主要从事家兔重要疫病的病原学、快速诊断、流行病学、致病机理、疫苗研制、综合防控技术等方面的研究。

Tel：

（025）84390337；E-mail：

rwangfang@。

兔出血症，又称兔瘟，是由兔出血症病毒（rabbithaemorrhagicdiseasevirus，RHDV）引起的一种以急性、高度传染性、大面积死亡为特征的兔传染病，主要临床特征为呼吸系统出血、肝变性、实质器官瘀血及出血性变化[1-3]。

本病常呈暴发性流行，发病率和病死率极高，感染兔通常于48～72h死亡，给养兔业造成极大的经济损失。

该病自然感染只发生于兔，主要危害40日龄以上幼兔、育成兔和成年兔，40日龄以下幼兔和部分老龄兔不易感，哺乳仔兔不发病[2-4]。

带毒兔及病死兔的内脏器官、肌肉、毛、血液、分泌物、排泄物是主要的传染源，带毒兔和被病毒污染的饲料、饮水、用具也是重要的传染源或传播媒介。

目前该病的主要预防措施是使用组织灭活疫苗免疫，然而传统组织灭活苗的制备存在诸多的缺陷和不足，因此，需要探索新的生产疫苗的途径[5-6]。

　　RHDV是杯状病毒科成员，结构简单，仅有1个主要结构蛋白VP60，在诱导抗病毒感染的免疫反应中起重要作用，是病毒免疫保护性抗原，用杆状病毒系统表达RHDV的VP60能够自发地组装成病毒样粒子（VLPs），其在形态和抗原性上都与天然的病毒粒子无异但不包含病毒RNA基因组。

研究发现RHDVVLPs在兔体内可以诱导机体产生很强的体液免疫应答、细胞免疫应答和黏膜免疫应答。

此外，RHDVVLPs具有成本低、获取方便等优势，已经成为应用性预防治疗中可靠的分子工具[3-7]。

在前期研究的基础上，于实验室用RHDV重组VP60制备了5批次疫苗，并对疫苗开展了系统的研究。

　　1材料与方法

　　1.1种毒

　　重组兔出血症病毒VP60杆状病毒，由江苏省农业科学院兽医研究所构建并保存[5]。

攻毒用毒种为兔出血症病毒皖阜株肝毒。

Sf9昆虫细胞，由江苏省农业科学院兽医研究所保存。

　　1.2试验兔

　　2～3月龄健康易感肉兔、獭兔、毛兔（兔出血症病毒抗体HI效价不高于1∶2），健康怀孕20～25d母兔，20～30日龄未断奶仔兔、35日龄已断奶幼兔（未免疫兔出血症及相关疫苗），均由金陵种兔场提供。

　　1.3试剂

　　Sf-900TMⅡSFM培养基，购自GIBCO公司。

硫乙醇酸盐培养基（TG）、酪胨琼脂（GA）、葡萄糖蛋白胨培养基（GP）、氢氧化铝胶溶液由南京天邦生物科技有限公司制备并检验。

　　1.4抗原制备及红细胞凝集效价的测定

　　将重组兔出血症病毒VP60杆状病毒接种Sf9昆虫细胞，于27～28℃培养，连续观察，待细胞病变达85%以上时，收获细胞培养物。

将收获接种种毒的细胞培养物反复冻融3次，取50μL于50孔板，用PBS作2倍比稀释，加入等体积1%人O型红细胞悬液，振荡均匀，置于2～8℃作用45min，观察结果，检测表达蛋白的HA效价[8-9]。

　　1.5灭活及灭活检验[9]

　　向细胞培养物中加入甲醛溶液（终浓度为0.2%），37℃灭活24h。

取灭活细胞培养物，接种生长良好的Sf9细胞，于27～28℃条件下培养，同时设立未灭活的细胞培养物为阳性对照，按上述方法接种Sf9细胞，连续5d观察细胞病变，收获细胞培养物，置-20℃以下反复冻融3次，接种生长良好的Sf9细胞盲传1代，培养5d，观察细胞病变，并测定其血凝性。

　　1.6疫苗制备

　　将检验合格的细胞培养物和氢氧化铝胶按9∶1充分混匀振荡，定量分装，加盖密封，贴签。

　　1.7成品检验

　　1.7.1性状取疫苗瓶上下颠倒混匀，观察外观及颜色，然后将疫苗瓶于2～8℃静置24h，再次观察外观及颜色。

　　1.7.2无菌检验按2010版《中国兽药典》附录进行检验。

　　1.7.3甲醛残留量测定按2010版《中国兽药典》附录进行检验。

　　1.8安全试验[10]

　　1.8.1单剂量安全试验

　　1.8.1.1单剂量安全试验实验室制备的5批次疫苗（批号：

101、102、103、104、105）各用2～3月龄健康易感家兔5只，分别皮下注射1mL/只，同时以相同条件家兔作为对照，不接种疫苗，观察家兔精神状态、饮食、粪便、局部及全身反应等，连续观察14d。

　　1.8.1.2单剂量重复安全试验5批次疫苗各用2～3月龄健康易感家兔5只，分别皮下注射1mL/只，14d后，重复皮下注射相同剂量的灭活疫苗，以相同条件家兔作为对照，不接种疫苗，观察家兔精神状态、饮食、粪便、局部及全身反应等，连续观察14d。

　　1.8.2超剂量安全试验

　　1.8.2.1不同品种家兔安全试验实验室制备的5批次疫苗各用2～3月龄健康易感肉兔、獭兔、毛兔各5只，分别皮下注射2mL/只，同时以相同条件家兔作为对照，不接种疫苗，观察家兔精神状态、饮食、粪便、局部及全身反应等，连续观察60d，并于30d每组取2只、60d每组取3只安乐死后进行剖检，观察疫苗注射部位局部组织疫苗吸收和炎症反应情况。

　　1.8.2.2怀孕母兔安全试验5批次疫苗各用怀孕20～25d母兔5只，分别皮下注射2mL/只，以相同条件不接种疫苗家兔作为对照，观察精神状态、饮食、粪便、局部及全身反应等，并观察怀孕母兔妊娠、分娩及胎儿健康状况，观察期14d。

　　1.8.2.3其他日龄家兔安全试验5批次疫苗各用35日龄断奶未免疫兔出血症疫苗的幼兔5只，并各用20～30日龄未断奶未免疫兔出血症疫苗的仔兔5只进行安全试验，处理方法同“1.8.2.2”节。

　　1.8.2.4对肉兔生产性能的影响5批次疫苗各用35～40日龄的健康肉兔5只，分别皮下注射2mL/只，以相同条件家兔作为对照，不接种疫苗，每日10：

00测量并记录14d内家兔的体温，观察45d内家兔生长发育情况，记录注射疫苗时和观察期结束时家兔的体质量，观察期内饲料消耗的重量，观察期结束时出栏家兔数量，并计算家兔增重、饲料报酬（料肉比）、出栏率等。

　　1.9效力试验

　　1.9.1易感家兔效力试验实验室制备的5批次疫苗各用2～3月龄健康易感家兔5只，分别皮下注射1mL/只，21d后，连同相同条件对照兔5只，各皮下注射兔出血症病毒皖阜株肝毒1mL，连续观察7d，记录死亡与保护的动物数量，对死亡兔剖检观察并取肝脏进行人“O”型红细胞凝集试验。

　　1.9.2怀孕母兔效力试验实验室制备的5批次疫苗各用健康怀孕母兔5只，处理方法同“1.9.1”节。

　　2结果与分析

　　2.1抗原红细胞凝集效价

　　经测定，5批次细胞培养物红细胞凝集效价在1∶512～1∶1024之间，分别为1∶1024、1∶512、1∶512、1∶1024、1∶512。

　　2.2灭活检验

　　用甲醛溶液对细胞培养物进行灭活，结果显示，接种灭活细胞培养物的Sf9昆虫细胞及正常Sf9昆虫细胞生长状况良好，细胞分裂正常。

收获接毒细胞培养物，于-20℃以下反复冻融3次，取适量再次接种生长良好的Sf9细胞，于27～28℃培养5d，结果显示，接种灭活细胞培养物的Sf9昆虫细胞及正常Sf9昆虫细胞生长状况良好，细胞分裂正常；而加入未灭活细胞培养物的细胞病变明显，细胞培养物具有血凝性。

说明接毒细胞培养物灭活完全。

　　2.3疫苗配制

　　按“1.6”节的方法制备试验用疫苗5批次，约4000mL/批次，批号为101、102、103、104、105。

　　2.4性状、无菌检验、甲醛残留量测定

　　对5批次疫苗进行性状、无菌检验、甲醛残留量测定，结果显示，5批次疫苗（101、102、103、104、105）外观为浅黄色均匀混悬液，静置后上层为浅黄色的澄清液体，下层有少量沉淀。

TG小管、GA斜面在37℃培养7d，TG小管、GA斜面、GP小管在25℃培养7d均无菌生长，无菌检验合格。

经检验，疫苗甲醛残留量在0.042%～0.087%之间，符合质量标准。

　　2.5安全试验

　　2.5.1单剂量安全试验用5批次疫苗对家兔进行单剂量安全试验，连续观察14d，结果显示，免疫兔和对照兔的精神状态、饮食、粪便等均正常，免疫兔未见疫苗接种引起的异常临床症状，说明疫苗对2～3月龄健康易感家兔单剂量接种及单剂量重复接种均是安全的。

　　2.5.2超剂量安全试验

　　2.5.2.1不同品种家兔安全试验用5批次疫苗进行不同品种家兔安全试验，结果显示，观察期60d，2～3月龄肉兔、獭兔、毛兔3个品种家兔的精神状态、饮食、粪便等均正常；免疫兔未见疫苗接种引起的异常临床症状，疫苗接种后30d及60d，剖检注射部位未见炎症反应，疫苗吸收良好，说明疫苗对不同品种的家兔是安全的。

　　2.5.2.2怀孕母兔安全试验用5批次疫苗进行怀孕母兔安全试验，结果显示，观察期14d，免疫兔和对照兔的精神状态、饮食、粪便等均正常；免疫兔未见疫苗接种引起的异常临床症状，母兔均正常妊娠、分娩，免疫兔和对照兔生产的仔兔数量没有差异，胎儿健康，未见异常，说明疫苗对怀孕母兔是安全的。

　　2.5.2.3其他日龄家兔安全试验用5批次疫苗对其他日龄家兔进行安全试验，结果显示，观察期14d，未断奶仔兔、已断奶幼兔的免疫兔和对照兔精神状态、饮食、粪便等均正常，仔兔正常断奶，并且生长良好；免疫兔未见疫苗接种引起的异常临床症状，说明该疫苗对未断奶仔兔和已断奶幼兔均是安全的。

　　2.5.2.4对肉兔生产性能的影响用5批次疫苗进行肉兔生产性能影响试验，结果显示，观察期14d，免疫兔和对照兔体温处于38.5～39.5℃的正常范围内，免疫兔与对照兔相比较，体温没有明显差异（图1）。

观察期45d，免疫兔和对照兔生长发育均良好，免疫组各5只家兔共增加体质量分别为6207、6367、6314、5960、6068g，对照组5只家兔共增加体质量6108g，由此计算饲料报酬（料肉比），免疫组与对照组相比较，差异不显著（P>0.05）；出栏率均为100%（表1）。

结果说明该疫苗对肉兔生产性能没有影响。

　　2.6效力试验

　　用5批次疫苗进行效力试验，结果（表2）显示，5批疫苗免疫易感家兔全部健康存活，对照兔死亡5只，死亡兔出现兔出血症典型的病理变化，对死亡兔肝脏悬液作人“O”型红细胞凝集试验，均为RHDV阳性。

另一组攻毒结果显示，5批疫苗免疫母兔全部健康存活，对照兔死亡4只，死亡兔出现兔出血症典型的病理变化，对死亡兔肝脏悬液作人“O”型红细胞凝集试验，均为阳性。

结果说明该疫苗可以对母兔和易感家兔提供完全保护。

　　3讨论

　　目前，由于兔出血症病毒不能在兔体以外的组织或细胞上增殖，因此，只能通过用强毒接种易感兔，收获含毒组织制成乳剂，用甲醛灭活后制成疫苗[6，11]。

这种生产方式主要存在以下缺陷和不足：

易感兔来源少、生产成本高、污染物安全处理困难且易造成散毒、动物福利难以保障等。

利用基因工程技术开发新疫苗是解决当前传统疫苗问题的有效途径，国内外已经用大肠杆菌、酵母、昆虫细胞等多种表达系统对RHDV的免疫蛋白VP60进行了表达，并且多数表达系统都表现出良好的免疫原性[3，12]。

杆状病毒系统表达的RHDV重组衣壳蛋白能够很好地自聚形成能够凝集人“O”型红细胞的病毒样颗粒（VLPs），由于VLPs结构与成熟病毒相似，但不含病毒核酸，不具有感染性，所以在体内这种空壳结构VLPs不会引发感染，因此作为疫苗非常安全[13]。

而且VLPs能够在很低剂量的抗体情况下引发有效的保护性反应，这将大大降低疫苗的成本，同时该表达系统具有低成本、高表达和易于规模生产等特点[14，15]。

　　本研究在完成重组兔出血症病毒VP60杆状病毒毒种的构建及特性研究的基础上，实验室试制了5批次疫苗（批号101、102、103、104、105），共计约20000mL。

按照现行《中国兽药典》附录对5批次疫苗进行性状、无菌、甲醛残留量检验及安全、效力试验，结果显示，5批次疫苗无菌检验、甲醛残留量均合格。

安全性结果表明，该疫苗可以用于怀孕母兔，优于目前市售组织灭活疫苗，并且对20～30日龄未断奶仔兔、35日龄已断奶幼兔都非常安全，对肉兔的各项生产性能也没有影响。

本研究的安全性试验是使用5批次疫苗免疫3个品种家兔的多次试验完成的，试验结果说明该疫苗对各个年龄段的家兔均是安全的。

疫苗免疫21d后2～3月龄家兔和母兔用致死剂量的兔出血症病毒攻击保护率都达100%，说明该疫苗免疫原性良好。

该疫苗具有较高的安全性和良好的免疫原性，市场前景乐观。

　　参考文献：

　　[1]陆承平.兽医微生物学[M].北京：

中国农业出版社，2007：

457-458.

　　[2]谷子林，秦应和，任克良.中国养兔学[M].北京：

中国农业出版社，2013：

509-511.

　　[3]AbrantesJ，vanderLooW，lePenduJA.Rabbithaemorrhagicdisease（RHD）andrabbithaemorrhagicdiseasevirus（RHDV）：

areview[J].VeterinaryResearch，2012，43：

12-21.

　　[4]MarquesRM，TeixeiraL，guasAP，etal.ImmunosuppressionabrogatesresistanceofyoungrabbitstoRabbitHaemorrhagicDisease（RHD）[J].VeterinaryResearch，2014，45

（1）：

1-6.

　　[5]王芳，胡波，任雪枫，等.兔出血症病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及对家兔的免疫保护效果[J].畜牧兽医学报，2008，39（10）：

1382-1387.

　　[6]HuangHB.Vaccinationagainstandimmuneresponsetoviralhaemorrhagicdiseaseofrabbits：

areviewofresearchinthePeople’sRepublicofChina[J].RevueScientifiqueetTechnique，1991，10

（2）：

481-498.

　　[7]MarínMS，MartínAJ，PérezOGL，etal.ImmunogenicpropertiesofrabbithaemorrhagicdiseasevirusstructuralproteinVP60expressedbyarecombinantbaculovirus：

anefficientvaccine[J].VirusResearch，1995，39（2/3）：

119-128.

　　[8]王启明，董亚芳.NY/T572―2002兔出血病血凝和血凝抑制试验方法[S].

　　[9]中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典：

三部[M].北京：

中国农业出版社，2011.

　　[10]唐应华，陆吉虎，吴培培，等.免疫增强剂对禽流感疫苗免疫持续期、安全性和鸡淋巴细胞转化的影响[J].江苏农业学报，2014，30（4）：

821-825.

　　[11]宁宜宝.兽用疫苗学[M].北京：

中国农业出版社，2008：

390-391.

　　[12]MikschofskyH，SchirrmeierH，KeilGM，etal.Pea-derivedvaccinesdemonstratehighimmunogenicityandprotectioninrabbitsagainstrabbithaemorrhagicdiseasevirus[J].PlantBiotechnologyJournal，2009，7（6）：

537-549.

　　[13]LudwigC，WagnerR.Virus-likeparticles-universalmoleculartoolboxes[J].CurrentOpinioninBiotechnology，2007，18（6）：

537-545.

　　[14]Perez-FilgueiraDM，Resino-TalavanP，CubillosC，etal.Developmentofalow-cost，insectlarvae-derivedrecombinantsubunitvaccineagainstRHDV[J].Virology，2007，364

（2）：

422-430.

　　[15]FernándezE，ToledoJR，ChiongM，etal.Singledoseadenovirusvectoredvaccineinducesapotentandlong-lastingimmuneresponseagainstrabbithemorrhagicdiseasevirusafterparenteralormucosaladministration[J].VeterinaryImmunologyandImmunopathology，2011，142（3/4）：

179-188.董亚青，朱文斗，王琳琳，等.鸡α-干扰素在毕赤酵母中的表达及其表达条件优化[J].江苏农业科学，2015，43（11

　　：

275-277.