生化设计 恢复.docx

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生化设计恢复

西北农林科技大学动物科技学院

《动物生物化学》实验设计报告

学年：

2010-2011学年第一学期

实验设计类型：

设计性实验

实验项目名称：

p53蛋白质的分离和制备

专业：

动物医学

年级：

动物医学096

实验设计人：

吴昌龙

指导教师：

王建刚

实验设计时间：

2010-12-20

癌症是一种基因病，是人体细胞在外环境因素作用下，内在多种前癌基因被激活和抑癌基因失活的多阶段长期演变的过程。

癌症是严重威胁人类健康和生命的杀手，我国每年新发癌症患者250万以上，每年在治患者不下600万，治疗费用超过1500亿元。

目前肿瘤的主要治疗手段是手术、放疗和化疗，尽管医学家们不断完善这3大治疗手段，但许多癌症患者仍然难以得到治愈。

人们越来越关注通过“治本”的方法来提高肿瘤治愈率，基因治疗是21世纪人类攻克肿瘤的必由之路。

基因治疗是指以改变人类遗传物质为基础的生物医学治疗。

是通过一定方式将人的正常基因或有治疗作用的DNA顺序导入人体靶细胞，去纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用。

因此基因治疗针对的是疾病的根源—异常的基因本身。

P53基因及蛋白质简介

抑癌基因是一类抑制细胞过度生长、增殖从而遏制肿瘤形成的基因。

对于正常细胞，调控生长的基因（如原癌基因等）和调控抑制生长的基因（如抑癌基因等）的协调表达是调节控制细胞生长的重要分子机制之一。

目前定论的抑癌基因有10余种，p53基因就是其中较为出名的一个，由于p53蛋白在维持细胞正常生长、抑制恶性增殖中起着重要作用，因而被冠以“基因卫士”称号。

在短短的十多年里，人们对P53基因的认识经历了癌蛋白抗原，癌基因到抑癌基因的三个认识转变，现已认识到，引起肿瘤形成或细胞转化的P53蛋白是P53基因突变的产物，是一种肿瘤促进因子，它可以消除正常P53的功能，而野生型P53基因是一种抑癌基因，它的失活对肿瘤形成起重要作用。

P53蛋白还分布于线粒体、核仁等结构，并且与细胞骨架有相互作用关系。

P53蛋白质的表达和作用机理

P53基因在人类、猴、鸡和鼠等动物中相继发现后，对其进行了基因定位，人类P53基因定位于17P13.1，鼠P53定位于11号染色体，并在14号染色体上发现无功能的假基因，进化程度迥异的动物中，P53有异常相似的基因结构，约20Kb长，都由11个外显子和10个内含子组成，第1个外显子不编码，外显子2、4、5、7、8、分别编码5个进化上高度保

守的结构域，P53基因5个高度保守区即第13～19、117～142、171～192、236～258、270～286编码区.P53基因转录成2.5KbmRNA，编码393个氨基酸蛋白，分子量为53KD，P53基因的表达至少受转录及转录后二种水平的调控.在停泊生长或非转化细胞中P53mRNA水平很低，但刺激胞液后mRNA显著增加.持续生长的细胞，其mRNA水平不随细胞周期而出现明显变化，但经诱导分化后mRNA水平降低，部分是转录后调控.P53基因的转录由P1、P2二个启动子控制.P1启动子位于第一外显子上游100～250bp，P2位于第一内含子内，在启动子中包含1个NF1蛋白结合位点和一个转录因子AP1相关蛋白的结合位点，对正常P53基因的转录，不仅需要二个启动子的平衡作用，而且P53基因内含子也起作用，如内含子中有正调控作用，其调控有组织特异性.

P53基因表达的产物有两种，第一是野生型，这种P53蛋白主要分布于细胞核浆，能与DNA特异结合，其活性受磷酸化、乙酰化、甲级化、泛素化等翻译后修饰调控。

正常P53的生物功能好似“基因组卫士（guardianofthegenome）”，在G1期检查DNA损伤点，监视基因组的完整性。

如有损伤，P53蛋白阻止DNA复制，以提供足够的时间使损伤DNA修复；如果修复失败，P53蛋白则引发细胞凋亡。

第二重是突变型，当突变型产生时，细胞分裂失去节制，发生癌变，人类癌症中约有一半是由于该基因发生突变失活。

目前发现的有肝癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌、软组织肉瘤、卵巢癌、脑瘤、淋巴细胞肿瘤、食道癌、肺癌、成骨肉瘤等，人类肿瘤中P53突变主要在高度保守区内，以175、248、249、273、282位点突变最高，不同种类肿瘤不同，如结肠癌和乳腺癌有相似的流行病学（包括地区分布和危险因素），但P53突变谱并不一致.结肠癌G:

CA:

T转换占79%，而且多数CpG，二核苷酸位点，50%以上转换突变发生在第3～5结构域的CpGC位于码子175、248、273）;在乳腺癌中，只发现13%的转换在CpG位点.此外，G-T颠换在乳腺癌占1/4，但在结肠癌T分罕见.淋巴瘤和白血病的P53，突变方式与结肠癌相似，即大部分突变为CPG位点的转换，G→T颠换较低，A:

T→G:

C在A:

T位点突变较高.佰基特淋巴瘤与其它B细胞淋巴瘤和T淋巴细胞恶性病变的P53突变谱相似，但佰基特淋巴瘤的转换突变较高.在非小细胞肺癌中G:

C→T:

A最普遍，食道癌颠换率很高，与肺癌不同的是，G:

C和A:

T位点有相似的突变率.我国启东地区50%为249癌码子的G→C、G→T颠换，而南非肝癌80%为G→T颠换.骨肉瘤中P53突变率为75%，主要集中在5～9外显子.

P53基因治疗方法的前景

p53基因是研究最透彻，功能最强大的一种抑癌基因。

野生型p53对细胞周期和凋亡起关键性作用，尤其是对受照射、细胞毒制剂、热疗打击的癌细胞，起更大的杀伤作用。

其主要作用为：

抑制并杀灭肿瘤细胞；与放、化疗手段协同，增强其杀灭癌细胞的功效，达到

1+1大于2的效果；

抑制肿瘤血管生成，有效防止肿瘤的复发、转移。

提高人体自身的免疫功能；

国产的重组人p53腺病毒注射液（商品名今又生），经过5年艰苦的临床试验，由北京肿瘤医院张珊文教授带领放疗科医护人员，在Ⅰ期临床安全性试验完成的基础上，又顺利完成了头颈鳞癌的Ⅱ期临床试验，充分证实对治疗头颈鳞癌是安全有效的。

2003年10月16日，国家食品药品监督管理局批准重组人p53腺病毒注射液新药证书，意味着世界上第一个癌症基因治疗药物在中国诞生，标志着我国基因治疗癌症临床和基因药物产业化方面都走在世界前列。

重组人p53腺病毒是一种基因工程改造过的活病毒，在结构上由两部分组成：

一是抑癌基因p53，二是载体。

载体是改造过的无复制能力的腺病毒。

就像火箭携带卫星上太空一样，这种携带p53的腺病毒特异感染肿瘤细胞，它能有效地将治病的p53基因转入肿瘤细胞内，而对正常细胞无害。

今又生结合放疗治疗53例头颈鳞癌，肿瘤完全消失率比单纯放疗的46例提高2倍。

结合放疗治疗45例鼻咽癌，肿瘤完全消失率比单纯放疗的41例提高1.7倍。

结合放疗治疗了4例不能手术的Ⅲ期子宫颈癌都达到肿瘤完全消失。

结合放疗、化疗或热疗治疗各种软组织肉瘤、消化系统腺癌、卵巢癌都取得一定的疗效，而这些病例都是经3大手段治疗失败的病人。

使用今又生治疗恶性肿瘤，除出现暂时性自限性发烧外，未发现其他毒副反应。

今后，全面的临床试验将在其他三级甲等医院有序展开，p53基因治疗已从实验室走向临床，走向产业化。

　　p53基因治疗肿瘤只是开了一个好头，为人类征服癌症带来了新的希望和曙光

p53表达产物在制备治疗肿瘤药剂中的应用

ｐ５３基因编码产物是一种转录调控因子可通过调节下游的靶基因而诱导细胞凋亡或细胞周期阻滞。

ｐ５３过度表达可以非常有效地诱导肿瘤细胞凋亡。

减毒鼠伤寒沙门氏菌可作为载体介导ｐ５３在肿瘤细胞中表达并杀伤肿瘤细胞。

开发以携带ｐ５３的沙门氏菌为口服基因治疗新药不仅解决了蛋白质多肽药物的非注射给药途径的难题更重要的是将会为肿瘤治疗提供一种安全、有效、特异及经济的方法。

P53蛋白质的分离与制备

P53蛋白粗制品的制备：

收集数份经冰冻切片P53含量丰富的肺组织，仔细剔除正常组织、纤维，并剪成1mm×1mm×1mm，加入4倍体积的冰冷0.1mol/LTris盐酸缓冲液（内含0.1%苯磺酰氯，1.0%triton-100）高速匀桨，4℃搅拌过夜，次日再超声粉碎（0℃15s×8次），10000r/min离心15min，弃沉淀，上清液经生理盐水透析平衡［3］。

另取预经对0.1mol/LNaHCO3透析平衡的P53MoAb1ml与1gCNBr-Sepharose4B按说明书交联，即为亲和层析柱，将上述肿瘤上清液流穿此柱，经解吸后即可获。

加0.1%NaN3置2～8℃保存

按以下方法提取：

动物肺组织（剔除纤维，剪成1*1*1mm大小）

将组织加入4倍体积的冰冷0.1mol/LTris盐酸缓冲液（内含0.1%苯磺酰氯，1.0%triton-100）高速匀桨

4摄氏度搅拌过夜。

次日再超声粉碎（0℃15s×8次）

另取预经对0.1mol/LNaHCO3透析平衡的P53MoAb1ml与1gCNBr-Sepharose4B按说明书交联

亲和层析柱

10000r/min离心15min，弃沉淀，上清液经生理盐水透析平衡

P53粗制品

实验材料与试剂

市售新鲜肺，0.1mol/LTris盐酸缓冲液（内含0.1%苯磺酰氯，1.0%triton-100），P53MoAb1ml与1gCNBr-Sepharose4B，0.1%NaN3

仪器及设备

台式离心机（上海安亭科学仪器厂，型号：

TGL-16G）、低速离心机（北京医用离心机厂，型号：

LD4-2）、水浴箱（天津市泰斯特一起有限公司，规格编号420）、亲和层析柱