弹性纤维染色方法.docx

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弹性纤维染色方法

改良Masson三色染色法在胶原纤维中的应用

中华首席医学网    2006年05月24日11:

05:

41Wednesday  

648

作者：

王珏,朱礼国，唐幕湘,张健

《郧阳医学院学报》2006年2月25卷1期实验技术 

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【关键词】 胶原纤维

   [关键词] 改良；Masson三色染色法；胶原纤维

    目前，Masson三色染色法仍是胶原纤维染色的主要方法之一。

它在临床外检和科研教学等方面有着重要的意义。

在实际工作中，我们认为传统的Masson三色染色法[1]操作程序多，染色效果欠佳，且不太稳定，对其做了改进，现将做法介绍如下。

　　1 方法

　　1.1 染液的配制

　　Harris苏木素、1%盐酸酒精、丽春红酸性品红、1%磷钼酸、2%苯胺蓝.

　　1.2 染色方法

　　石蜡切片3~4μm脱蜡至水,Harris苏木素染3min流水冲洗,1%的盐酸酒精分化3~5s流水冲洗,温水返蓝1min流水冲洗,丽春红酸性品红加温染3min，蒸馏水冲洗,1%磷钼酸分化1min，不洗，擦净载玻片上的磷钼酸残液，2%苯胺蓝复染1min，95%的酒精冲洗，95%酒精及无水酒精脱水，冷风吹干，中性树胶封片。

　　2 结果

　　胶原纤维呈蓝色，肌纤维胞质呈红色，细胞核呈蓝褐色。

　　3 讨论

　　通过长期实践探索，我们摸索出一种程序更简洁、组织着色效果更好，且性能稳定的改良Masson三色染色法。

其原理是利用苏木素，酸性品红和苯胺蓝对结缔组织和神经嗜银颗粒、胶原纤维等组织染色，使时间缩短，步骤简便。

改进后的方法，将传统的Masson三色染色法作了如下调整和改动：

Bowin氏液由10%中性固定液[2]代替，省略了0.5%碘酒精作用10min，5%硫代硫酸钠作用5min和1%冰醋酸处理1min及地衣红染30~60min等过程，然后将原丽春红酸性品红，1%磷钼酸，2%苯胺蓝的染色时间分别由15min，5min,5min,缩短为加热3min,1min,1min.通过对以上各步的调整和改进，使染色时间由原来的近3h，缩短为30min左右，且颜色对比度好，层次清楚，胞核胞浆着色均匀。

值得注意的是：

在经过1%磷钼酸分化后的几步禁止用水冲洗，直接用95%酒精洗，然后脱水，透明封片，这样可防止切片脱色，染出的组织切片效果更好。

   [参 考 文 献]

　　[1]    凌启波.实用病理特殊染色和组织化学[M].广东高等教育出版社.1989,7.    

　　[2]    龚志锦,詹洲.病理组织制片和染色技术[M].上海:

上海科学技术出版,1994,10.

　　（郧阳医学院形态学实验室;郧阳医学院附属太和医院病理科,湖北十堰 442000）

网状纤维

网状纤维是一种纤细的纤维。

它沿着网状细胞和突起分支，并互相交织成网，因而被称为网状纤维，又因这种纤维对银的浸染着色特别显著。

故又称为嗜银纤维。

它主要由III型胶原蛋白构成，也具有642nm周期性横纹[1]。

它主要分布于骨髓、脾、淋巴结、肝和肺等脏器。

癌组织中间未见有网状纤维，但在其边缘可见有大量的网状纤维，但在其边缘可见有大量的网状纤维围绕，俗称癌巢。

一、网状纤维的形成

它的形成主要是在纤维母细胞的粗面内浆网中，合成可溶性胶原。

在醛糖、类脂的作用下，形成可溶性胶原，随后它被分泌到细胞外，在基质中（或在细胞的表面）通过原胶原蛋白分子间的交联，聚合成为不溶性的胶原原纤维即网状纤维。

二、网状纤维在组织化学上的反应

网状纤维的主要成分是网硬蛋白，在组织化学上，网状纤维和胶原纤维是容易区别的。

网状纤维是分支纤细的纤维。

VanGieson氏染色不显色或微红色。

PAS反应呈现红紫色，银浸染为黑色。

胶原纤维用VanGieson氏染色为红色，PAS反应呈微粉红色。

银浸染为黄*色或棕黄*色。

三、网状纤维的显示

1．染色染料技术：

从网状纤维的显示，区别和效果等方面，这种技术被认为是不可靠的，其原因是它只能跟胶原纤维区别开来。

2．金属浸染技术：

这种技术对于显示网状纤维被认为是十分可靠和广泛使用的方法，它不但能够区别网状纤维和胶原纤维，而且可显示纤细的网状纤维。

嗜银反应（Argyrophilreaction）嗜银细胞与亲银细胞所不同的是需要一种附加的还原剂来还原，它们比亲银细胞数量多。

必须注意：

亲银反应中将找不到任何的嗜银细胞。

亲银反应（Argentaffinreation）亲银细胞有能力，直接地，不靠外加试剂，将银液中的银还原为一种不溶性的黑色金属银沉淀的细胞称为亲银细胞。

（Cellsthathavetheabilitytodirectlyreducesilversolutionproducinganinsolubleblackmetallicsilverprecipitatearetermed-angentaffincells）。

四、网状纤维的显示方法

有Gomori's法、Godonandsweet's法、Wilder's法、Foot's法

（一）Gomori's法

1、试剂的配制：

取10%硝酸银3份，加入10%的氢氧化钾1份，混合后产生大量的黑色沉淀物，倒去表面的液体，保留下沉淀物，加入10-20倍或更多的蒸馏水进行冲洗，连续冲洗3次。

待沉淀物清晰则可。

用浓氨水逐滴加到溶液中。

使沉淀物逐步溶解。

待见沉淀物剩少数几颗时，再取10%的硝酸银液加入数滴，至溶液再现浑浊为止。

再用氨水将其溶解，然后稀释10-15倍。

即可使用。

平时保存于4℃冰箱中。

2、操作步骤：

（1）、切片脱蜡至水，蒸馏水洗，

（2）、用0.5%高锰酸钾氧化5min，

（3）、自来水洗，继用蒸馏水洗，

（4）、用2%草酸漂白切片2min，

（5）、自来水洗，蒸馏水洗，

（6）、2%硫酸铁铵媒染5min，

（7）、水洗，蒸馏水洗，

（8）、滴入氨性银溶液浸染3-5min，

（9）、蒸馏水洗数次，

（10）、10%甲醛液还原5-10min，

（11）、水洗2min，

（12）、用核固红染色10-15min，

（13）、水洗10min，各级酒精脱水，

（14）、常规透明，中性树胶封固。

结果：

网状纤维黑色，核红色，胶原纤维黄棕色。

（二）.Gordon和sweets氏法

试剂的配制：

取10%硝酸银水溶液5ml,逐滴加入浓氨水，至形成沉淀物，再逐滴加氨水，将初次形成的沉淀物溶解。

注意氨水不能加入过多。

取3%过氧化钠5ml加入，即可能产生沉淀，再逐滴加入氨水至沉淀再度被溶解。

加入数滴10%硝酸银，加入蒸馏水制成50ml溶液，即可使用，贮藏于4℃冰箱中。

1、切片脱蜡至水。

2、1%高锰酸钾氧化5分钟。

3、水洗。

4、2%草酸漂白1-2分钟。

5、水洗。

6、2%硫酸铁铵媒染切片10分钟。

7、蒸馏水洗。

8、氨银溶液浸染2分钟。

9、蒸馏水冲洗数次。

10、10%福尔马林还原2分钟。

11、自来水洗。

12、5%偏重亚硫酸钠处理3分钟。

13、自来水洗。

14、0.2%氯化金调色3分钟。

15、自来水洗。

16、如果有要求，可做对比染色，如用核固红染核。

17、脱水，透明，封固。

结果：

网状纤维显示黑色，如有对比染色，细胞核显示红色，胶原纤维不着色。

（三）．Wilder氏法。

1、切片脱蜡至水。

2、1%高锰酸钾氧化5分钟。

3、流水洗。

4、2%草酸处理1-2分钟。

5、流水洗。

6、1%硝酸铀10秒钟。

7、蒸馏水洗。

8、氨银溶液浸染1分钟。

9、95%酒精速洗。

10、于显影液内显色1分钟。

11、蒸馏水洗。

12、0.2%氯化金调色1分钟。

13、蒸馏水洗。

14、5%亚硫酸钠处理1-2分钟。

15、水洗。

16、如有需要，可作对比染色。

17、常规脱水，透明，封固。

结果：

网状纤维：

黑色，其余着对比染色，胶原纤维不着色。

（四）.Foot氏法

1、切片脱蜡至水。

2、1%高锰酸钾氧化5分钟。

3、自来水洗。

4、2%草酸处理1-2分钟。

5、自来水洗，蒸馏水洗。

6、于碳酸氨银液中，在56℃烤箱内浸染40-60分钟。

至切片呈黄棕色。

7、速洗蒸馏水。

8、20%福尔马林还原5分钟。

9、水洗。

10、0.2%氯化金水溶液调色1-2分钟。

11自来水洗。

12、、5%硫酸钠固定切片1-2分钟。

13、如果需要，可作对比染色。

14、脱水，透明，封固。

结果：

网状纤维显示黑色，其它着染对比染色，胶原纤维不着色。

五、银染注意事项：

1、所使用的玻璃仪器，须用清洁液处理。

2、配制氨银溶液时，氨水加入的量不能过多或不足，过多感应下降，会使液体过碱，滴染时，切片容易脱落，过少则感应上升，浸染效果不佳，不好掌握。

3、配制氨银液时，有可能用玻璃蒸馏水。

4、使用的化学试剂应尽量用分析纯以上。

5、切片氧化漂白应彻底，不能使残存的福尔马林留于片上，否则将导致过早还原而使浸染不均匀。

6、如果有某种原因而导致切片脱落时，应使用涂胶的载片，以增加附贴性，

7、如有可能，氨银溶液以新配为佳，但也可保存于4℃冰箱中达一个月左右，这种液体易挥发，用后即须盖紧，当沉淀物出现时，该溶液应抛弃，

8、20%福尔马林还原5分钟。

9、应秀氯化金调色时，可将胶原纤维着染的黄棕色去除掉。

10、上述四种方法，根据各单位个人的需要或爱好选择，没有什么区别。

六、临床应用

1、可用于区别癌和肉瘤的诊断，

例如：

网织细胞肉瘤和转移于淋巴结内的未分化癌，这两者在HE的染色切片都较难区别，前者可产生网状纤维，后者不产生网状纤维。

鼻咽部活柱，应将网染作为常规，给予使用，可增加诊断的准确性。

2、可用于区别血管内皮瘤（肉瘤）和血管外皮瘤（肉瘤），它的瘤细胞在网状纤维膜内，而血管外皮瘤则在网状纤维膜外，血管内皮肉瘤的瘤细胞呈泡巢状，周围多被网状纤维包绕；而血管外皮肉瘤的瘤细胞可见较多的网状纤维。

3、可用于神经系统方面肿瘤的区别，

如：

交感神经母细胞，脑的髓母细胞瘤，这些肿瘤的形态有时象肉瘤，但银染时，神经系统的网染为阴性，不过脑的原发性肉瘤有较多的网状纤维。

4、可用于观察癌组织的发生发展过程。

如：

原位癌，可见有完整的基底膜，而浸润性癌则可见到被破坏的基底膜。

5、可用于区别淋巴系统方面的肿瘤，

如：

淋巴肉瘤和网织细胞肉瘤，前者瘤细胞间的网状纤维比正常稍减少，后者则比正常时增多。

6、可用于急性骨髓纤维化的鉴别诊断，该病的网状纤维增多，纤维可以是致密和融合性的。

胶原纤维染色通常呈阴性，尽管偶尔有的病例可能显示胶原纤维化。

弹性纤维

弹性纤维主要由弹性蛋白（一种黄*色硬蛋白，它是黄*色弹性纤维组织的主要成分，干燥时易脆，而湿润时呈弯曲并富弹性）构成。

它广泛分布于全身的各个部位，尤以循环系统，呼吸系统和皮肤系统为甚。

新鲜时它呈黄*色，固又称为黄*色纤维。

弹性纤维较细，直径0.2-1.0um，有分支，不成束。

但可交织成网。

它富有弹性，容易拉长，但不能拉到超过它的极限，外力除去后又恢复原状。

弹性纤维与胶原纤维交织在一起，在HE染色的标本上，含量少时不易与胶原纤维区别，含量多时呈折光性强的淡粉红色。

由弹性蛋白构成弹性纤维的鞘，并非完全的密封，在其周围有许多微细孔，这些微细孔可作为营养物及排除废物的场所。

弹性纤维主要来源于带有平滑肌特征的间胚叶细胞，少量可由脉管的内皮细胞产生，先形成前——弹性蛋白（pro-elastin），这时在电镜下可见到直径为200nm的电子密度微纤维，在成熟的弹性纤维蛋白，电密度减少或丧失，较为均匀一致。

弹性纤维与胶原纤维，网状纤维不同，它极难容于有机或无机的溶液里。

一、弹性纤维的变形和病理变化

随着年龄的增长，特别是到了老年的时候，弹性纤维可发生生理性的变化，这时可观察到弹性纤维的纵行分裂，断成碎片，最后成为颗粒，这些变化同时也伴有化学变化，氨基酸和钙的含量有所增加，这些变化在皮肤是最明显的。

当有病变的时候，我们便可在切片观察到有的弹性纤维增生，有的被破坏，断裂、崩解，失去弹性。

如主动脉瘤，就可见到瘤壁上的弹性纤维已经失去了弹性。

这是由于主动脉壁的弹性纤维受到内压的不断冲击，弹性纤维过度牵拉，超过它的极期，再也恢复不了原状，因此在切片标本上（特殊染色）只能见到其痕迹或反应物。

二、弹性纤维的染色方法

（一）.Weigert氏雷锁辛品红法（1898）（Weigertsresorcin-fuchsinmethod）

试剂的配制：

 Wergert氏雷锁辛品红液：

 碱性品红2g

 雷锁辛4g

 蒸馏水200ml

 30%三氯化铁25ml

取500ml的烧瓶加入蒸馏水和雷锁辛，用玻棒搅拌均匀，加热直至沸腾，持续1-2min，再加入30%的三氯化铁水溶液继续搅拌直至煮沸2-3min后，此时溶液的颜色变为紫罗蓝色，冷却后过滤。

倒去滤液，将滤纸和沉淀物一起放入烤箱中一起烤干。

取200ml95%酒精，将滤纸与沉淀物一起放入加热溶解，除去滤纸，冷却后过滤，用95%酒精凑足200ml，再加入4mlHCL。

即可使用，保存于4℃冰箱，可长期使用。

操作方法：

1、切片脱蜡至水，

2、0.5%高锰酸钾水溶液氧化5min，

3、水洗，

4、2%草酸漂白1-2min，

5、水洗，

6、入95%酒精，

7、入Weigert氏雷锁辛液，室温染1-2h，

8、95%酒精分化至背景清晰为止，

9、VanGiesson氏液或核固红作对比染色，

10、脱水透明，封固。

结果：

弹性纤维：

深蓝或深黑色，其余成分视用何种对比染色而定。

特点：

1、可将微细弹性纤维显示出来。

2、方法可靠，颜色鲜红色，切片可保存。

3、配制好的染液可使用较长时间。

注意事项：

11908年Hart应用该法，将1%HCl酒精稀释了Weigert氏原液。

即原液5-20ml。

酸酒精30-40ml。

结果弹性纤维显示蓝色——黑色。

2、1929年French改良了这种方法，用Weigert氏原液中的2g品红，改为1g结晶紫。

结果弹性纤维显示深蓝——绿色。

3、1929年Sheridan改良了该法，Weigert氏原液中的2g品红改用为2g结晶紫。

结果弹性纤维显示为绿色。

4、在溶化沉淀物时，应隔水溶化，不要直接于明火上加热熔解。

5、配制后的染液用小磨口瓶装，以防溶液挥发，影响染色效果。

6、该溶液虽可保存较长时间，但仍以新鲜配制为好。

7、切片在透明时，有人提出切片不要经过苯酚二甲苯。

其原因之一是对已染色的切片有影响。

（二）．Gomori's醛品红法（1950）（Gomrori’saldehyde-fuchsinmethod）

试剂的配制：

碱性品红1g

70%酒精98ml

三聚乙醛1ml

浓盐酸1ml

将品红溶于酒精里，再加入HCl和三聚乙醛，混合后于室温放置2-3天后即可成熟，保存于4℃冰箱内，使用期1-2个月。

操作方法：

1、切片脱蜡至水，

2、0.5%高锰酸钾水溶液氧化5min，

3、水洗，

4、2%草酸漂白1-2min，

5、水洗，

6、入70%酒精稍浸泡1min，

7、入染液中浸染10-15min，

8、70%酒精分化，至无余色脱下为止，

9、0.5%橙黄G做对比染色，20-30s，

10、脱水，透明，封固。

结果：

弹性纤维深蓝色，背景不同程度的黄*色。

特点：

1、可把较细的弹性纤维给予显示出来。

2、它不但染弹性纤维，也可染胰腺的B细胞，肥大细胞，神经细胞的尼氏小体，表面肝炎抗原（HBsAg）粘蛋白等。

3、方法可靠安全，操作得当，可获满意结果。

4、颜色鲜艳，利于摄影。

注意事项：

1、醛品红液在成熟之后方可使用，染色最佳时间一般在7-10天，

2、分化时应随时观察切片，防止褪色过度，可改用95%酒精为分化剂。

（三）.地衣红技术（orceintechique）（Unna.1891）

染液配制：

地衣红1g

70%酒精99ml

浓HCL1ml

将地衣红溶于酒精中，也可以用水浴锅加热以助其溶解，冷却过滤后加入HCL于室温放置1-2天。

操作方法：

1、切片脱蜡至70%酒精，

2、入上述染液中浸染3h（室温）或1-2h（37℃）

3、70%酒精分化，

4、脱水，透明，封固。

结果：

弹性纤维棕红色或深棕色。

（四）.Verhoff氏酒精苏木素技术（1908）（Verhoff'salcoholichematoxylinted）

染液的配制：

A.5%酒精苏木素.

B.10%三氯化铁水溶液.

C.lugol's碘.

溶2g碘片于少数的蒸馏水中，再溶1g的碘化钾，两者总量为100ml。

操作方法：

1、切片脱蜡至水，

2、用上述染液（A.2分，B.4分，C.4分）染色10-15min，

3、水洗，2%的三氯化铁分化至弹性纤维清晰为止，

4、水洗，95%酒精除去沉淀于切片的碘，

5、水洗，用VanGiesson或中性红作对比染色，

6、脱水，透明，封固。

结果：

弹性纤维黑色，背景据不同的对比染色而定。

特点：

1、操作简单，易掌握。

2、染色的时间短，适宜于临床活检。

注意事项：

1、苏木素为储存液，但每次以新配为佳，

2、混合后的染液须当次用完，不能保存，

3、分化时应于镜下控制，以免过染或淡染。

三、弹性纤维染色的临床应用

1.用于区别正常的动脉和静脉以及观察动脉有病变时血管壁各层的情况，如动脉粥样硬化时的各类变化。

2.用于区别观察各种疾病对弹性纤维的影响及变化，如原发性或继发性高血压可见主动脉弹力纤维增生，老年弹力纤维增多症。

心内膜弹力纤维增生症常都可见到弹力纤维断裂，梅毒性主动脉炎和皮肤的环状肉芽肿，动脉粥样硬化均可见到裂解，崩解的弹力纤维。

3.用于弹力纤维性假黄瘤的诊断。

该病镜下见真皮中下部结缔组织变性，呈团块状或条索状，弱嗜碱性用弹力纤维染色法可以鉴别。

四、对染好弹力纤维的总结和体会

1.这种方法对固定液没有特殊要求，一般福尔马林固定液即可，但时间不宜过长，过长可影响染色。

另外，不要用含有铬酸盐如Zonker氏固定液固定。

2.认真配制好各种试剂。

试剂配制的好坏，直接关系到染色的成败，因此要获得好的染色结果，就必须先配制好试剂，每一种试剂都必须认真仔细操作。

在这些方法中，有的可配为储存液，有的则应在临用前配制。

应注意的是，在配制Weigert氏雷琐辛品红时，可产生大量的气体，因此要用较大的容器来配制。

3.切片的氧化，漂白。

上述的四种方法，作者都作了大量的对照。

取同一病例，分为甲乙两组，甲组的切片的颜色比乙组的鲜艳，这是为什么呢？

我们都知道，所有的组织经甲醛固定后，都形成了醛键，这些醛键的存在，影响了组织跟染液发色基团的更好结合。

为了使组织能更有效的显示出来，利用某些试剂进行氧化，把这些醛键打开，然后再对切片进行漂白，使切片不含有其它的杂质，着色更纯正，实验证明效果很好。