单克隆抗体电荷异构体分离方法优化.pdf

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中国医药生物技术2014年10月第9卷第5期ChinMedBiotechnol,October2014,Vol.9,No.5385DOI:

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.05.014技术与方法单克隆抗体电荷异构体分离方法优化程洪杰，马珂，秦国宏，张道平，张弢，王旻单克隆抗体是复杂的四聚体糖蛋白，常呈现微观不均一性，即“异质性”，包括电荷、疏水、形态等相关的异构体1。

这些异构体可能来自于抗体分子复杂的生物合成途径，如细胞系及培养工艺2，也可能来自于纯化、制剂等制造过程以及贮存过程的任何阶段1。

其中由于抗体分子所带电荷差异造成的异质性称为电荷异构体，一般分为酸性异构体和碱性异构体，产生原因主要与翻译后修饰有关。

电荷异构体宏观表现为在等电聚焦电泳图上出现弥散或多个条带；离子交换色谱图主峰前后出现小峰。

由于这些异构体可能会影响抗体的稳定性、药效、免疫原性或药代动力学，特征性地识别和分离电荷异构体是至关重要的。

基因泰克公司曾对上市抗体及临床前抗体药物关于电荷变化产生的药效、药代等方面的影响做过一个总结，结果表明：

当电荷变异超过一个pH单位时，会影响药物的组织分布及药代动力学；增加正电荷，会提高药物的组织停滞，降低血液清除；降低正电荷，会减少药物的组织停滞，提高药物的全身清除3。

因而分离电荷异构体，得到均一性质的抗体是一个关键的挑战，尤其在生物类似物开发过程中应尽可能控制异构体含量与原研药保持一致。

在众多分离手段中，离子交换层析被认为是最有前景的方法4。

有研究表明，依赖pH变化的分离方式比依赖离子强度变化的分离方式效果更好5-6。

近年来不断有研究者通过pH梯度洗脱方式分离电荷异构体。

Pabst等7通过控制缓冲液中Tris、双Tris丙烷、组氨酸、乙醇胺的比例，而Farnan和Moreno8通过调节缓冲液中哌嗪、咪唑和Tris的比例，均实现了pH梯度洗脱，成功分离出抗体的电荷异构体，但整个工艺较为复杂，pH控制不稳定。

近些年，置换色谱凭借其出色的分离能力，已成功被应用于分离抗体电荷异构体、寡糖、多肽、小分子化合物。

但商品化的阳离子层析置换剂SachemExpellSP1成本较高，且伴随着碱性异构体的洗脱过程亦有部分置换剂被洗脱9，也带来一定的安全隐患，此外，置换序列的监测是一项耗时、难度较大的工作，这些均阻碍其应用到生产中。

本课题组经CHO细胞表达，ProteinA亲和层析、SP-FF阳离子层析已制备纯度达95%以上的单克隆抗体IgG1，但阳离子层析动态载量较小且洗脱样品酸性异构体含量偏高（20%），不符合质控标准（18%）。

本研究通过层析介质筛选得到动态结合载量高、分辨率好的层析介质。

依据酸性异构体pI（7.23）小于目的组分pI（7.34），参考pH梯度洗脱的原理，在原工艺上增加一步预洗步骤，特异性去除酸性异构体，从而降低最终样品的酸性异构体含量。

1材料与方法1.1材料1.1.1单克隆抗体溶液CHO细胞发酵液经ProteinA纯化，低pH值孵育，并用Tris中和至pH5.8，浓度约9.13mg/ml。

经毛细管等电聚焦电泳测定，酸性异构体pI=7.23，目的组分pI=7.34，碱性异构体pI=7.47。

1.1.2层析柱PorosXS购自美国ThermoFisherScientific公司；NuviaS购自美国Bio-Rad公司；HiTrapSP-FF购自美国GEhealth公司；EshmunoS、Fractogel-EMDSO3-（M）、Fractogel-SEHicap（M）均购自德国Merck公司；HPLC-SEC为美国Sepax-technologies公司产品，保护柱为ZenixSEC-300，50mm7.8mm，粒径3m；分析柱为300mm7.8mm，粒径3m；HPLC-IEC为美国ThermoFisherScientific公司产品，分析柱为PropacWCX-10，250mm4mm。

1.1.3试剂Tris购自美国Amresco公司；NaH2PO4H2O、Na2HPO412H2O、NaCl、HCl等为国产分析纯试剂；纯水由美国Barnstead公司超纯水仪制备。

1.1.4仪器KTApurifier蛋白纯化仪为美国GEHealthcare公司生产，检测波长为280nm；pH计为瑞士MettlerToledo公司产品；Agilent1260型高效液相色谱仪为美国Agilent公司产品；Genesys10UV紫外可见分光光度仪为美国ThermoFisherScientific公司产品；台式高速离心机为德国Eppendorf公司产品。

1.2方法1.2.1介质动态载量测定以20mmol/LPB（pH5.8）为上样缓冲液平衡层析柱，取ProteinA亲和后样品，20mmol/LPB（pH5.8）稀释至2mg/ml，先流经旁路使紫外吸收值达到平台期后，样品进入层析柱，以穿透样品紫外吸收值达到平台期的10%计算动态结合载量（DBC）。

流速与各层析柱体积匹配，使保留时间为1min。

DBC（mg/ml）=（VACO）/VCVA表示穿透样品紫外吸收值为平台期的10%的上样体积；CO表示样品蛋白浓度；VC表示总的柱床体积。

1.2.2各介质分辨率的考察取亲和样品用20mmol/L作者单位：

210009南京，中国药科大学生命科学与技术学院（程洪杰、王旻）；210042南京，江苏先声药业有限公司（程洪杰、马珂、秦国宏、张道平、张弢）通讯作者：

王旻，Email：

;张弢，Email：

zhangtao收稿日期：

2014-03-05386中国医药生物技术2014年10月第9卷第5期ChinMedBiotechnol,October2014,Vol.9,No.5PB缓冲液（pH5.8）稀释至7mg/ml，以20mmol/LPBpH5.8为上样缓冲液，基于方法1.2.1的结果选择SP-FF、PorosXS、NuviaS三种层析介质，上样量为各介质动态载量的80%，保留时间1min。

20mmol/LPB平衡，030%20mmol/LPB（pH5.8）、1mol/LNaCl线性洗脱20柱体积，保留时间3min。

洗脱峰分阶段收集，UV1001000mAU标记为“ELU-1”；1000mAU最高值标记为“ELU-2”；UV最高值下降至1000mAU标记为“ELU-3”；1000mAU降至100mAU标记为“ELU-4”。

各样品均进行HPLC-IEC/SEC检测。

1.2.3pH对抗体质量的影响取亲和样品，20mmol/LPB（pH5.8）稀释至7mg/ml，以20mmol/LPB（pH5.8）为上样缓冲液平衡柱子，上样量为80%DBC，线性流速200cm/h。

以pH分别为6.2、6.5、6.8、7.2的20mmol/LPB平衡后，030%20mmol/LPB、1mol/LNaCl线性洗脱20柱体积。

洗脱峰分阶段收集，进行HPLC-IEC/SEC检测。

1.2.4NaCl浓度预洗去除酸性异构体的影响取亲和样品，将pH9.0的1mol/LTris调pH至6.5，20mmol/LPB（pH6.5）稀释至7mg/ml，以20mmol/LPB（pH6.5）为上样缓冲液，分别用1.5%、2%、2.5%的20mmol/LPB（pH6.8）、1mol/LNaCl进行预洗，紫外上升至50mAU后收集预洗峰，030%20mmol/LPB（pH6.5）、1mol/LNaCl线性洗脱20柱体积，洗脱峰分阶段收集，进行HPLC-IEC/SEC检测。

1.2.5不同电导率PB（pH6.8）缓冲液预洗固定体积去除酸性异构体的影响20mmol/LPB（pH6.8）与200mmol/LPB（pH6.8）混合分别配制预洗缓冲液2.5、3.0、3.5mS/cmPB（pH6.8），同时配制2%20mmol/LPB（pH6.8）、1mol/LNaCl。

取亲和样品，1mol/LTris9.0调pH至6.5，20mmol/LPB（pH6.5）稀释至7mg/ml，以20mmol/LPB（pH6.5）为上样缓冲液，分别用上述预洗缓冲液预洗15柱体积，紫外上升至50mAU后收集预洗组分。

20mmol/LPB（pH6.5），200mmol/LNaCl直接洗脱，收集洗脱峰。

各样品进行HPLC-SEC/IEC检测。

1.2.6HPLC-SEC检测蛋白多聚体与碎片含量10样品经超滤换液至20mmol/LPB（pH5.8）中，用纯化水稀释至2mg/ml。

150mmol/LPB（pH7.0）平衡色谱柱，流速1ml/min。

待基线平稳，进样10l，紫外检测波长214nm，记录20min。

1.2.7HPLC-IEC检测蛋白电荷分布10样品经超滤换液至20mmol/LPB（pH5.8）中，用纯化水稀释至4mg/ml。

流动相A为20mmol/LPB（pH6.2），流动相B为20mmol/LPB（pH6.2）、0.3mol/LNaCl。

流动相B清洗色谱柱30min。

92%流动相A、8%流动相B平衡色谱柱至基线平稳，流速0.8ml/min，柱温为25。

进样10l，紫外检测波长为214nm，记录35min。

线性梯度洗脱：

8%35%B，029min；30min之后维持50%B。

1.2.8紫外吸收测定蛋白浓度将待测样品用纯水稀释合适倍数，使在280nm处吸收值处于0.20.8范围内。

蛋白浓度（mg/ml）=（A280nm稀释倍数）/消光系数2结果2.1介质动态载量测定如表1所示，PorosXS与NuviaS均显示出较高的动态载量，均在50mg/ml以上，而其他几种介质载量比较小，故选择PorosXS和NuviaS做为候选介质。

表1介质动态载量测定介质动态结合载量（mg/ml）粒径（m）SP-FF13.9590NuviaS51.7985EshmunoS21.957595Fractogel-SO318.394090Fractogel-SE17.314090PorosXS55.87502.2各介质分辨率的考察以原工艺中的SP-FF作为对照，通过洗脱峰的分段收集，考察各介质分离电荷异构体的差异。

三种介质均只有一个洗脱峰，各电荷异构体洗脱顺序与理论一致11，酸性异构体由于带电荷少最先被洗脱下来，而碱性异构体在目的组分之后被洗脱（图13），对照品HPLC-IEC分析图谱见A（mAU）时间（min）图1单抗对照品分析型离子交换色谱图A（mAU）酸性异构体比例（%）柱体积图2SP-FF层析图谱以及各洗脱组分中酸性异构体比例中国医药生物技术2014年10月第9卷第5期ChinMedBiotechnol,October2014,Vol.9,No.5387A（mAU）酸性异构体比例（%）柱体积图3PorosXS层析图谱及各洗脱组分中酸性异构体比例A（mAU）酸性异构体比例（%）柱体积图4NuviaS层析图谱及各洗脱组分中酸性异构体比例图1。

相比于其他两种介质，PorosXS的酸性异构体含量前后差异显著（图3），酸性异构体主要集中在出峰阶段，洗脱峰最后组分ELU-4约有2.11柱体积，约占整个洗脱峰的29.68%，酸性异构体已下降至8.64%，此外其相比于其他介质粒径更小，只有50m。

NuviaS洗脱样品电荷分布也呈现类似情况（图4），但是其在洗脱峰结束阶段，体积约3.01柱体积，占整个洗脱峰的36.13%，酸性异构体较多，仍保持18.82%。

根据以上结果，PorosXS展现出更好的分离效果，对于此单抗而言，分辨率更高，故以此介质开展后续探索。

2.3pH对抗体质量的影响目前已知，洗脱液成分的小幅度变化以及pH值的波动均能影响保留时间、分辨率、洗脱峰的组成。

研究表明在阳离子层析中伴随着盐离子浓度变化，pH值也发生着复杂变化。

因而利用盐离子梯度洗脱模式，样品的保留时间和分辨率不仅取决于可控的盐浓度，也受不可预知的pH值影响12。

通过不同pH下盐离子梯度洗脱，未能将酸性异构体单独分离出来。

图5中数据表明洗脱溶液pH值越高，越接近于抗体目的组分等电点（pI=7.34），酸性异构体与介质的结合力越弱，出峰阶段收集的组分（ELU-1）酸性异构体含量越多。

其中用pH6.8洗脱时，ELU-1中酸性异构体含量远高于其余两个pH。

而pH值为7.2时，由于太过接近pI，样品直接穿透。

据文献报道，碎片主要是Fab片含量百分比（%）6050403020100ELU-1、2、3、4依次表示洗脱峰分段收集的各个成分图5不同pH洗脱样品中酸性异构体以及碎片含量段或desFab片段，带电荷量少，显示出酸性异构体性质。

多聚体带电荷量多，与阳离子介质电荷作用更强，常显示碱性异构体性质9,13。

图5中数据与理论一致，碎片在出峰阶段含量最多，多聚体主要集中在洗脱峰末尾。

此外，pH6.5和6.8条件下，洗脱样品的多聚体和碎片总体含量明显低于pH6.2。

当pH6.5，样品偏离等电点较大，较不稳定，易发生分解形成碎片，因而今后可将样品保存在pH6.5平衡液中进行操作。

同时，在洗脱前增加用pH6.8缓冲液预洗步骤去除酸性异构体。

洗脱用pH6.5缓冲液，保证洗脱样品酸性异构体总含量较低。

2.4不同NaCl浓度预洗对去除酸性异构体的影响由上述实验可知紫外出峰时电导率约4.3mS/cm，换算成20mmol/LPB（pH6.8）、1mol/LNaCl比例为2%。

从图6可看到，用2%、2.5%20mmol/LPB（pH6.8）、1mol/LNaCl预洗去除的主要是酸性异构体，占60%以上。

洗脱阶段收集的组分相比样品，酸性异构体百分含量明显下降。

表明提高缓冲液pH并适当添加NaCl进行预洗确实能有效去除酸性异构体。

但是预洗过程中，紫外上升至某一值后A（mAU）酸性异构体比例（%）柱体积0：

原样品中酸性异构体百分含量；1：

20mmol/LPB（pH6.8），2%1mol/LNaCl预洗成分中酸性异构体百分含量；2：

20mmol/LPB（pH6.8）、2.5%1mol/LNaCl预洗成分中酸性异构体百分含量；3：

20mmol/LPB（pH6.8）、1mol/LNaCl线性洗脱各组分中酸性异构体百分含量图6不同NaCl浓度预洗去除酸性异构体的层析图谱以及各组分酸性异构体比例388中国医药生物技术2014年10月第9卷第5期ChinMedBiotechnol,October2014,Vol.9,No.5电荷分布百分比（%）回收率（%）1009080706050403020100原样品2.5-ELU3.0-ELU3.5-ELU2%NaCl-ELU9080706050403020100图7不同电导率的PB（pH6.8）预洗15柱体积后各洗脱峰电荷分布百分比维持平台期，无法下降，并未形成明显的酸性异构体峰。

且随着NaCl比例上升，预洗样品中目的组分比例也逐渐上升，影响了回收率。

在该条件下，酸性异构体与目的组分电荷性质接近，预洗过程中与介质结合、解离呈现一个动态平衡的过程，相互影响，并不能使得酸性异构体与目的组分完全分离。

但可以用预洗一定柱体积的方式去除部分酸性异构体。

2.5不同电导率PB（pH6.8）缓冲液预洗对去除酸性异构体的影响不同的离子影响蛋白与介质结合能力，磷酸根比氯离子盐析作用更强。

同时引入其他类型的盐离子，容易使pH值发生变化12。

通过探究不外加NaCl，利用不同浓度的PB缓冲液预洗，也能有效去除酸性异构体。

图7数据表明预洗过程PB缓冲液电导率越高，洗脱样品中酸性异构体百分含量越低，但回收率亦逐渐降低，这与之前的探索结果一致。

4个洗脱样品，纯度均在99%以上。

2.5mS/cm或3.0mS/cm预洗后收集到的洗脱样品（2.5-ELU表示2.5mS/cmPB预洗后洗脱的样品，3.0-ELU表示3.0mS/cmPB预洗后洗脱的样品）与原样品对比，酸性异构体含量有明显下降，由原先约20%下降至15%左右，符合质控标准（18%），回收率在80%左右。

而利用3.5mS/cm以及2%NaCl预洗后收集到的洗脱组分3.5-ELU表示3.5mS/cmPB预洗后洗脱的样品，2%NaCl-ELU表示2%20mmol/LPB（pH6.8）、1mol/LNaCl预洗后洗脱的样品酸性异构体比例下降十分显著，已降至2%以下，从侧面反映了该条件下预洗去除酸性异构体效果非常好。

但是回收率较低，低于50%。

对比外加NaCl和调节预洗缓冲液浓度以获得合适电导率两种方式进行预洗，即3.5-ELU与2%NaCl，结果显示无明显区别，考虑到大规模生产的实用性与简便性，采用调节预洗缓冲液浓度达到相应电导率的方法更可取。

同时通过线性梯度换算而来的200mmol/mlNaCl也足以将目的蛋白洗脱下来。

3讨论随着质量源于设计（QbD）理念逐步在生物制药产业的深入，分离、鉴定异构体性质成为生物药物生产过程设计时必须考虑的因素。

关键参数（CQA）的确立也有赖于这些异构体对于药物安全性、药效等方面的信息14。

前期的研究表明，酸性异构体含量过多会降低单抗的药效学活性，因而控制酸性异构体含量，使之保持在18%以下，成为整个产品生产过程中的关键参数之一。

单克隆抗体纯化过程，最为经典也是最常采用的为亲和层析-阳离子/阴离子层析-阴离子/阳离子层析。

其中阳离子交换层析为吸附模式，一般用于去除HCP、多聚体等杂质，近年来，控制电荷异构体含量愈发重要，研究者也开始利用阳离子层析分离电荷异构体。

但是电荷异构体由于理化性质与目的组分接近，其中酸性异构体一般是目的组分经唾液酸化、二硫键还原、非还原共价结合、糖基化、脱酰胺化等过程后产生的复合形态9，单纯通过常用盐浓度调节洗脱液难以达到理想的分离效果。

本文借鉴了pH梯度洗脱的原理，根据酸性异构体pI小于目的组分pI，酸性异构体与阳离子介质结合相对较弱的特点，在已结合状态下提高缓冲液pH和电导率将大部分酸性异构体先洗脱下来，建立一条新的阳离子层析纯化工艺。

考察了pH、盐浓度、平衡液电导率对于酸性异构体去除效果的影响，并进行条件优化，兼顾碎片与多聚含量，最终确定以20mmol/LPB（pH6.5）为上样缓冲液，用25mmol/LPB（pH6.8）（3.0mS/cm）预洗15个柱体积，用20mmol/LPB（pH6.5），200mmol/LNaCl洗脱的方案，最终回收率可达80%以上，纯度99%以上，酸性异构体含量降低至15%，低于18%，符合质控标准。

此方法相比于文献中用的pH梯度洗脱、等电聚焦层析、置换色谱，未引入其他缓冲液成分，更为简单实用，适合产业化。

纯化过程对一些参数进行精细调节，从而控制酸碱性异构体的比例，对于生物类似物的开发有重要的参考意义。

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