国家自然基金申请成功范本.pdf

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2006年3月8日国家自然科学基金委员会您现在不能检查保护文档或打印文档，请根据以下三个步骤操作：

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/位名称代码在此录入修改合作单位信息合作单位信息在此录入修改项目名称松弛素（relaxin）抗心肌纤维化的机制研究资助类别面上项目亚类说明青年科学基金项目附注说明申请代码C030204:

病理生理学C010701:

循环生理学基地类别预计研究年限2007年1月2009年12月研究属性基础研究项目基本信息项目基本信息摘要摘要（限400字）：

（限400字）：

心肌纤维化是导致心功能不全、心律失常及慢性心衰难以逆转的最主要病理损伤之一。

本项目在我们前期工作观察到调节肽松弛素（relaxin）能有效抑制心肌纤维化的基础上，拟于在体和离体大鼠心肌纤维化模型上，观察内源性relaxin1/3及其受体LGR7的表达和功能的变化；以纤维母细胞的增殖与表型转变和心肌胶原代谢的MMPs/TIMPs系统的表达及活性变化为主要指标，观察relaxin处理对心肌纤维化发展的影响；观察relaxin对心肌内源性促纤维化系统血管紧张素/醛固酮系统的拮抗作用及其作用机制，以论证relaxin是机体抗纤维化的重要内源性防御因子的假说，探讨其抗心肌纤维化的细胞分子机制，以期探寻心肌纤维化发病的新机制和防治的新策略。

关键词关键词（用分号分开，最多5个）松弛素；心肌纤维化；肾素血管紧张素醛固酮系统国家自然科学基金申请书第3页版本1.000.000项目组主要成员项目组主要成员（注:

项目组主要成员不包括项目申请者，国家杰出青年科学基金类项目不填写此栏。

）编号姓名出生年月性别职称学位单位名称电话电子邮件项目分工每年工作时间（月）1耿彬1973-6-14男讲师硕士北京大学010-82802851分子生物学及放免测定102潘春水1976-3-19女博士生硕士北京大学010-82802851分子生物学及病理染色83肖洋1982-10-10男博士生学士北京大学010-82802851放免检测及生化检测64赵晶1980-11-4女技术员其他北京大学010-82802851细胞培养105庞永政1945-5-23男主管技师其他北京大学010-665511222374实验技术指导66在此录入修改7在此录入修改8在此录入修改9在此录入修改总人数高级中级初级博士后博士生硕士生0说明:

高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请者负责填报（含申请者），总人数自动生成。

国家自然科学基金申请书第4页版本1.000.000经费申请表经费申请表（金额单位：

万元）科目申请经费备注（计算依据与说明）一.研究经费一.研究经费23.00001.科研业务费9.0000

（1）测试/计算/分析费5.0000生化指标和分子生物学指标测定

（2）能源/动力费1.0000（3）会议费/差旅费1.0000会议注册和差旅费（4）出版物/文献/信息传播费2.0000论文发表、文献检索和复印（5）其它2.实验材料费14.0000

（1）原材料/试剂/药品购置费13.0000购买活性肽、分子生物学和生化试剂

（2）其它1.0000动物实验3.仪器设备费0.0000

（1）购置

（2）试制4.实验室改装费5.协作费二.国际合作与交流费二.国际合作与交流费1.00001.项目组成员出国合作交流1.0000参加国际会议2.境外专家来华合作交流三.劳务费三.劳务费4.5研究生劳务费四.管理费四.管理费1.5000合计合计30.0000国家其他计划资助经费其他经费资助（含部门匹配）与本项目相关的其他经费来源其他经费来源合计其他经费来源合计0.0000国家自然科学基金申请书第5页版本1.000.000查看报告正文撰写提纲报告正文报告正文（一一）立项依据与研究内容立项依据与研究内容1项目的立项依据项目的立项依据心肌纤维化是指在心肌的正常组织结构中胶原纤维过量积聚、心脏组织中胶原浓度显著升高或胶原成分发生改变。

这种病理变化在多种心血管疾病中存在，现认为其与心律失常、心功能障碍甚至心脏性猝死密切相关。

心肌纤维化是一种连续变化的过程，根据有无心肌细胞缺失、坏死和瘢痕形成可分为反应性纤维化和修复性纤维化，前者根据病变特点又分为间质纤维化和血管周围纤维化，引起心脏结构重塑（remodling），并由此引起舒张、收缩功能不全，最终导致心力衰竭；后者主要表现为心肌细胞坏死和瘢痕形成，并可有心脏功能的异常。

基于心肌纤维化已成为慢性心功能不全难以逆转的原因之一，常导致严重的后果，因此研究切实有效的防治措施受到高度关注。

心肌纤维化是胶原合成代谢和降解代谢失衡的结果，如心衰时心肌细胞及心肌间质细胞的丢失、心肌成纤维细胞活化包括增殖及表型转变、心肌成纤维细胞合成和分泌的胶原蛋白成分改变引起的I型和III型胶原含量的比值变化等因素，均促进了心肌胶原的大量沉积，再加上促胶原蛋白降解的基质金属蛋白酶的表达和活性下降，共同作用导致胶原的合成大大增加而降解大大降低，导致心肌纤维化的发生。

心肌纤维化的形成机制非常复杂，长期的压力过负荷、炎症反应、氧化应激等都参与了心肌纤维化的形成，而上述刺激因素均会引起内源性的心脏旁/自分泌系统的调控紊乱，其中研究较清楚的包括内源性的肾素血管紧张素醛固酮系统（renin-angiotensin-aldosteronsystem,RAAS）、内皮素（endothelin，ET）一氧化氮（nitricoxide，NO）系统、血小板衍生的生长因子（plateletderivedgrowthfactor,PDGF）血栓素2（thromboxane,TxA2）系统等，心脏的这些旁/自分泌系统不仅诱导心肌损伤，也是心肌纤维化的促进因子，但至今为止内源性的抗心肌纤维化防御体系则研究甚少，作用尚不清楚，近年来引起了高度关注。

近年来研究发现一种古老的多肽，松弛素，是迄今发现的最强的内源性抗纤维化物质之一，是最具前景的内源性抗纤维化物质。

松弛素（relaxin，RLX）是1926年，Hisaw从怀孕的猪黄体细胞中提取的妊娠相关激素，能松弛耻骨韧带、软化宫颈，促进分娩。

Relaxin是胰岛素样生长因子超家族的一员，在人及其他一些高等灵长动物体内有3种类型，分别为H1，H2，H3，其中H2是组织储存及血液循环中存在的主要形式；在啮齿国家自然科学基金申请书第6页版本1.000.000动物存在两种RLX类型，分别为RLX-1（相当于H2）和RLX-3（相当于H3）。

后来研究发现，在非妊娠期的妇女及男性体内多种组织都有relaxin的表达，推测relaxin不仅是一种生殖激素，可能还具有多种生物学效应。

但直至2000年，人们利用同源分析的方法发现并克隆了孤儿受体LGR7（leucinerichrepeatcontaining,Gproteincoupledreceptors,LGR），随后证实RLX为其内源性配体，这一发现使relaxin的功能研究进入了一个崭新的阶段，就此2002年，Science杂志就曾发表社评文章，指出对relaxin功能的重新认识有着深远的影响。

Relaxin是体内广泛分布的多功能活性多肽，不仅调节生殖系统功能，还参与神经垂体激素的分泌、大脑发育和心血管系统功能稳态等广泛生理过程的调节，在肿瘤的发展和转移及其心血管疾病发病中均具有重要的病理生理意义，其中relaxin强大的抗纤维化效应尤为受人关注。

在relaxin基因敲除的小鼠及其受体LGR7基因敲除的小鼠全身各脏器均出现严重的纤维化，早期补充使用relaxin可阻止肺纤维化、肺泡实质化、支气管上皮肥厚等病理变化发生；在溴化乙胺诱导的小鼠出现肾脏间质纤维化、肾小球滤过率下降及蛋白尿，补充relaxin有效的抑制了间质纤维化，改善肾功能。

在肝脏，relaxin同样减弱了I型胶原的合成。

既往的研究认为在心肌细胞relaxin及其受体的表达很低，心肌局部旁/自分泌的relaxin在心肌纤维化中的作用不被关注。

2005年，我们课题组首先在国外杂志上报道了relaxin对心血管疾病的保护作用：

在亚急性异丙肾上腺素（isoproterenol,ISO）（Peptides，2005Sep；26：

1632-1639）诱导的大鼠心肌坏死、纤维化的模型上，心脏内源性的relaxin表达、合成显著增加，外源性给予relaxin可以明显改善心功能，减轻心肌缺血损伤，抑制心肌纤维化，据此我们认为relaxin是一种内源性的心脏保护物质。

我们的工作虽然发表时间不长，但已受到了学术届的高度关注，当年即被SCI文献引用。

但relaxin的抗心肌纤维化的机制远未阐明。

目前研究认为relaxin可能是通过下列途径发挥作用的：

1、relaxin能显著的抑制纤维母细胞的增殖；2、relaxin抑制胶原的合成、分泌及在组织中的沉积；3、relaxin抑制纤维形成过程中其他基质成份的表达上调，如纤维结合蛋白、弹性蛋白纤维、原纤维蛋白2及氨基葡聚糖等；4、relaxin刺激多种基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinase,MMP）的表达和活性，抑制金属蛋白酶组织抑制剂（tissueinhibitorsofmetalloproteinase,TIMPs）的表达和活性。

但在不同的种属、不同的组织器官、不同病因诱导的纤维化中，relaxin抗纤维化的作用及机制均不相同。

与其他组织器官的纤维化的发病不同，心肌纤国家自然科学基金申请书第7页版本1.000.000维化的发生与其自身的旁/自分泌活性物质AngII、醛固酮的功能紊乱关系更为密切，在多种因素诱导的心肌纤维化中都伴随心肌AngII、醛固酮基因表达和活性的增强。

Relaxin是一种心血管活性物质，心肌能合成和分泌relaxin1、relaxin3，并且在心室和心房均富含LGR7受体。

有文献报道在中枢系统，relaxin抑制AngII的表达，参与中枢渗透压的调节，但内源性的relaxin对心肌旁/自分泌的AngII及醛固酮有何影响及相应的作用靶点尚未见报道。

我们的假说是我们的假说是relaxin可能通过作用于心脏旁可能通过作用于心脏旁/自分泌的自分泌的AngII及醛固酮系统，拮抗心肌纤维化，是机体抗纤维化的内源性防御体系。

及醛固酮系统，拮抗心肌纤维化，是机体抗纤维化的内源性防御体系。

本项目拟于在体和离体大鼠心肌纤维化模型上，观察内源性relaxin1/3及其受体LGR7的表达和功能的变化；以纤维母细胞的增殖与表型转变和心肌胶原代谢的MMPs/TIMPs系统的表达及活性变化为主要指标，观察relaxin处理对心肌纤维化发展的影响；观察relaxin对心肌内源性促纤维化系统血管紧张素/醛固酮系统的拮抗作用及其作用机制，以论证relaxin是机体抗纤维化的重要内源性防御因子的假说，探讨其抗心肌纤维化的细胞分子机制，以期探寻心肌纤维化发病的新机制和防治的新策略。

本项目拟于在体和离体大鼠心肌纤维化模型上，观察内源性relaxin1/3及其受体LGR7的表达和功能的变化；以纤维母细胞的增殖与表型转变和心肌胶原代谢的MMPs/TIMPs系统的表达及活性变化为主要指标，观察relaxin处理对心肌纤维化发展的影响；观察relaxin对心肌内源性促纤维化系统血管紧张素/醛固酮系统的拮抗作用及其作用机制，以论证relaxin是机体抗纤维化的重要内源性防御因子的假说，探讨其抗心肌纤维化的细胞分子机制，以期探寻心肌纤维化发病的新机制和防治的新策略。

参考文献：

参考文献：

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637-638.2项目的研究内容、研究目标及拟解决的关键问题2项目的研究内容、研究目标及拟解决的关键问题研究目标研究目标：

本项目拟于在体和离体大鼠心肌纤维化模型上，观察内源性relaxin1/3及其受体LGR7的表达和功能的变化；以纤维母细胞的增殖与表型转变和心肌胶原代谢的MMPs/TIMPs系统的表达及活性变化为主要指标，观察relaxin处理对心肌纤维化发展的影响；观察relaxin对心肌内源性促纤维化系统血管紧张素/醛固酮系统的拮抗作用及其作用机制，以论证relaxin是机体抗纤维化的重要内源性防御因子的假说，探讨其抗心肌纤维化的细胞分子机制，以期探寻心肌纤维化发病的新机制和防治的新策略。

研究内容：

研究内容：

1、以ISO诱导的大鼠亚急性心衰及腹主动脉结扎诱导的大鼠慢性心衰分别作为修复性心肌纤维化和反应性心肌纤维化的模型，分别观察心脏内源性的relaxin1/3的mRNA表达和放免活性、LGR7的mRNA和蛋白表达及受体亲和力的变化；观察分别外源性的给予relaxin1或relaxin3后，对心肌血管紧张素II、醛固酮表达和活性、对它们的受体表达和亲和力的影响；及心肌羟脯氨酸含量、I型及III型胶原蛋白的mRNA及蛋白表达、基质成分如纤维结合蛋白、弹性蛋白纤维、原纤维蛋白2及氨基葡聚糖等的表达、心肌MMP-1、2、9、13、TIMPs-1的mRNA及蛋白表达及活性的变化，以确定relaxin的抗心肌纤维化作用，并筛选其作用的靶分子。

2、在上述工作的基础上，分别以血管紧张素II、醛固酮处理原代培养的乳鼠心肌成纤维细胞，观察心肌细胞relaxin1/3的mRNA表达和放免活性、LGR7的mRNA和蛋白表达及受体亲和力的变化；观察分别予以relaxin1或relaxin3预处理及心肌成国家自然科学基金申请书第9页版本1.000.000纤维细胞转染表达relaxin的腺病毒，内源性的高表达relaxin后，心肌成纤维细胞的增殖及上述整体试验中初步确定的靶分子的表达和活性的变化，及血管紧张素II受体和醛固酮受体的表达和亲和力的改变，进一步确定relaxin的抗心肌纤维化作用及其作用的靶分子。

3、为了进一步阐明relaxin为抗纤维化的内源性防御体系，在血管紧张素II处理原代培养的乳鼠心肌成纤维细胞，观察relaxin预处理后，AngII诱导心肌纤维化发生的分子信号如MAPK/ERK、原癌基因C-fos、活素蛋白AP-1、转化生长因子TGF的mRNA和蛋白表达及活性的变化；在醛固酮处理原代培养的乳鼠心肌成纤维细胞，观察relaxin预处理后，醛固酮诱导心肌纤维化发生的分子信号如血管紧张素受体I（AT1）、AP-1、核转录因子NF-B、碱性成纤维细胞生长因子bFGF的mRNA和蛋白表达及活性的变化，确定relaxin抑制RAAS诱导心肌纤维化的分子靶点。

4、在上述研究的基础上，进一步观察relaxin抑制心肌纤维化的细胞内信号转导机制。

在原代培养的乳鼠心肌成纤维细胞，分别利用腺苷酸环化酶（adenylcyclase,AC）、PKA、过酪氨酸激酶（tyrosinekinase,TK）、磷酸二酯酶（phosphodiesterase,PDE）、Erk1/2及PI3K/Akt的激动剂和拮抗剂，以上述试验中确定的靶分子的表达和活性的变化为指标，确定relaxin抑制心肌纤维化的信号转导机制。

拟解决的关键问题：

拟解决的关键问题：

确证Relaxin为机体抗纤维化的内源性防御体系，探讨relaxin抗心肌纤维化的机制及分子信号转导通路。

（1）在整体、离体的纤维化模型上，观察内源性relaxin及其受体的变化，及外源性补充relaxin的抗心肌纤维化效应。

（2）确定relaxin抗心肌纤维化的作用靶点及相应的信号通路。

（3）确定relaxin对心肌RAAS系统的影响及其抑制RAAS作用的分子靶点。

3拟采取的研究方案及可行性分析拟采取的研究方案及可行性分析拟采取的研究方案拟采取的研究方案1、确定relaxin的抗心肌纤维化作用，筛选其作用的靶分子。

大鼠腹腔注射ISO诱导大鼠亚急性心衰，大鼠腹主动脉结扎诱导的大鼠慢性心衰，分别复制修复性心肌纤维化和反应性心肌纤维化的模型。

通过组织切片、天狼星红染色国家自然科学基金申请书第10页版本1.000.000观察心肌纤维化，利用生化方法测定心肌羟脯氨酸含量。

采用Real-TimePCR或NorthernBlot方法检测心肌relaxin及其受体LGR7的mRNA表达；采用放射免疫方法测定心肌组织relaxin的放免活性，用同位素标记的relaxin进行受体Binding实验，测定LGR7受体的亲和力。

利用免疫组化及WesternBlotd方法检测平滑肌actin（-SMA）的表达和组织分布；利用Real-TimePCR、WesternBlot的方法测定I型及III型胶原蛋白的mRNA及蛋白表达、基质成分如纤维结合蛋白、弹性蛋白纤维、原纤维蛋白2及氨基葡聚糖等的表达、心肌MMP-1、2、9、13、TIMPs-1的mRNA及蛋白表达，利用放射性同位素109Cd测定MMPs酶的活性。

采用Real-TimePCR或NorthernBlot方法检测心肌AngII、醛固酮及其受体的mRNA表达；采用放射免疫方法测定心肌组织AngII、醛固酮的放免活性，用受体Binding实验，测定AngII、醛固酮受体的亲和力。

上述测定方法本课题组均熟练掌握。

2、确定relaxin的抗心肌纤维化作用及其作用的靶分子。

分别以血管紧张素II、醛固酮处理的原代培养的乳鼠心肌成纤维细胞为心肌纤维化模型，采用3H-胸腺嘧啶（TdR）入测定心肌成纤维细胞的增殖，免疫组化及WesternBlotd方法检测平滑肌actin（-SMA）的表达和细胞定位说明成纤维细胞表型的改变，天狼星红染色观察心肌成纤维细胞胶原含量。

采用Real-TimePCR或NorthernBlot方法检测心肌relaxin及其受体LGR7的mRNA表达；采用放射免疫方法测定心肌组织relaxin的放免活性，用同位素标记的relaxin进行受体Binding实验，测定LGR7受体的亲和力。

构建relaxin表达质粒，进行重组腺病毒的包装、克隆化、扩增、纯化和滴定测定后，转染乳鼠心肌细胞，造成r