反向PCR法扩增沙门菌第一类整合子旁翼基因序列.pdf

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中国抗生素杂志2008年2月第33卷第2期文章编号：

10018689（2008）02-0111-03反向PCR法扩增沙门菌第一类整合子旁翼基因序列张宏梅1石磊2李琳2（1广东工业大学轻化工学院。

广州510006；2华南理工大学食品与生物工程学院，广州510641）摘要：

目的第一类整合子在介导细菌耐药中起重要作用。

本研究采用反向PCR方法对第一类整合子旁翼序列进行分析。

方法以具有典型第一类整合子结构的茨昂威沙门菌（S如hongwe）S191为研究对象，分别用EcoRV和HindIII两种限制性内切酶对基因组DNA进行酶切。

并对酶切产物进行自身环化，通过设计第一类整合酶基因的反向引物来扩增第一类整合子的旁翼序列。

结果分别扩增得到1500和6000bp左右大小的第一类整合子旁翼序列。

结论进一步明确了第一类整合子的结构，并为第一类整合子调控因子的分析和克隆奠定研究基础。

关键词：

反向PCR；整合子；整合酶中图分类号：

R3782+2文献标识码：

A。

AmplificationofneighborDNAsequenceofclass1integronusingreversePCRZhangHong-meil，ShiLeizandLiLin2（1DepartmentofFoodandBiologicalEngineefing，GuangdongUniversityoftechnology，Guan屏hou510006；2CofiegeofFoodandBiologicalEIlgineefing，SouthChinaUniversityofTehnologyG呦gzlOU510641）ABSTRACTObjectiveTheneighborDNAofclass1integronwasinvestigatedusingreversePCRMethodIntegronpositiveStshiongweS191wasthesampleChromosomalDNAofStshiongweS191wasdigestedbyHind111orEcoRVandwaseyclizateditselfInverseprimersweredesignedforamplificationofclass1integraseResultAmpliconsof1，500bpand6，000bpwereobtainedConclusionThestructureofclass1integronWasdemonstratedwellandtheexperimentalresultswerealsolaidafoundationforcontrollingtheexpressionofantibioticresistanceamongbacteriaKEYWORDSReversePCR；Integron；Integrase整合子对细菌耐药性的介导作用，已经引起研究人员的广泛注意，尤其第一类整合子在耐药菌中分布最广泛，占有重要地位。

在以往研究中，对沙门菌第一类整合酶基因阳性菌株的指纹图谱及其检测方法都已有探讨fI引，但是对第一类整合酶基因及耐药基因盒的调控序列研究报道却极少。

现已知，一个基因的表达在很大程度上是由它的旁侧序列调控的，克隆基因的旁侧序列已经成为分子生物学研究中的常规工作之一。

在测定已知基因片段的旁测基因序列方法上，常用的有染色体DNA步移、锚定引物PCR、加人衔接头等方法”。

l，其中应用染色体DNA步移的方法以其准确性高而常用。

反向PCR技术可以对一个已知序列DNA的两侧未知序列进行扩增和研究，也称染色体步移。

该方法常用于检测病毒、转座子等在基因组中的整合位点，建立基因组步移文库及研究基因的上游调控元件，在分子生物学研究中有广泛应用。

本文以第一类整合子阳性菌株茨昂威沙门菌（Stshiongwe）S191为研究对象，采用反向PCR方法扩增第一类整合子的旁翼序列。

1材料和方法11菌株茨昂威沙门菌S191由广州市东山卫生防疫站提供。

霍乱弧菌（驴cholerae）Ol群SK10第一类整合子阳性对照菌株，大肠埃希菌（Ecoli）C600第一类整合收稿日期：

20071017基金项目：

国家自然科学基金（项目批准号：

20707003）。

作者简介：

张宏梅，女，生于1975年，讲师。

通讯作者。

Email：

leishiscuteducn万方数据反向PCR法扩增沙门菌第一类整合子旁翼基因序列张宏梅等子阴性对照菌株，日本大阪府立大学国际防疫学研究室惠赠。

12基因组DNA的提取对茨昂威沙门菌S191基因组DNA为模板DNA，参照革兰阴性菌DNA提取方法f61进行。

13第一类整合子结构的检测扩增第一类整合子5保守端整合酶基因intll的上、下游的引物分别为INT1U（5-GITCGGTCAAGGTrCTG-3）和INTID（57一GCCAACTITCAGCACA7r（3）。

扩增3保守端的上、下游的引物分别为qacEAI-F5ATCGCAA7rACTTGGCGAAGl-37和sullB5GCAAGGCGGAAACCCGCGCC3（弓J物均由TAKARA生物工程公司合成）。

在50山反应总体积中加入10PCR缓冲液5斗l，dNTP4p,l，上、下游引物各51xl，无菌去离子水25751xl，DNA模板5pl，025斗lTaqDNA聚合酶（5UIM，TAKARA生物工程公司）。

应用LifeExpressThermalCycler系统，intll扩增循环条件：

裂解温度945rain，每个循环为94cc05rain，5005min，7215rain，30个循环，最后延伸72cc7min。

对3保守端的扩增条件为：

9405rain，56lmin，72lmin，30个循环，最后延伸72qC7min。

14反向PCR扩增intll的旁翼序列141茨昂威沙门菌S191基因组DNA的限制性酶切在灭菌、洁净的PCR反应管中加人如下组分：

基因组DNAIOv,I，10缓冲液2斗l去离子水7山，胁以或EcoRVl斗l，轻混后37放置2h，最后用酚氯仿将酶切的基因组DNA进行抽提纯化。

142DNA自身环化反应同样，在灭菌、洁净的PCR反应管中加入酶切DNA201M，T4DNA连接酶1斗l，10T4DNA缓冲液25trl和无菌水151xl，放入PCR仪中，10反应24rain，之后在94反应15min终止反应。

143反向PCR反应根据扩增第一类整合酶基因intll的引物INT1U和INT1D设计，反向引物为I-INTu（5-CAGAACCrlTGACCGAAC一37）和I-INTD（57一CATGTGCCTGAAAGTTGGC一3）由上海生工生物工程公司合成。

在50恤l反向PCR反应体系中加人10ExTaq缓冲液5txl，dNTP4恤l，I1NTU5斗1，I-INTD5txl，环化DNA1斗l，Ex细酶（TAKARA生物工程公司）025t上1和灭菌水2925txl。

循环条件：

94预变性5min，94变性lmin，55cc退火1min，?

2延伸3min，共30循环，最后72延伸10rain。

15扩增产物的检测取PCR产物5“l，以l或07浓度（反向PCR产物）的琼脂糖凝胶上100V电泳20rain，在EB溶液染色lOmin，水洗10min，在BIORADGelDoc2000凝胶成像系统检验结果，其中反向PCR产物（即第一类整合子的旁翼序列DNA）使用QIAquickPCRPurifica-tionKit和QIAquickGelExtractionKit（QIAGEN）进行纯化，纯化后的产物用20mTE稀释并在一20贮存，以备以后进一步克隆和分析使用。

16扩增产物的纯化、测序及序列分析反向扩增得到的产物使用QIAquickPCRPufificationKit和QIAquiekGelExtractionKit（QIAGEN）进行纯化，方法按照指导说明的进行；使用dRhodamineTerminatorCycleSequencingFSReadyReactionKil在ABIPRISM310测序仪（AppliedBiosystems公司）上对DNA序列；使用DNAtools软件以m哪ncbinlmnihgov网站对序列进行分析，应用StandardnueleotidenucleotideBLAST对获得的基因片段进行同源性检索2结果与讨论21StshiongweS191第一类整合子的检测结果通过对5保守端第一类整合酶基因的扩增，得到923bp的扩增产物。

通过引物qacEA1-F、sullB扩增3CS出现800bp的扩增产物，与茨昂威沙门菌$191整合子结构和文献报道第一类整合子结构特点一致171。

如图1和图2所示。

茨昂威沙门菌S191的整合子结构符合第一类整合子的一般结构特点，即5保守区含有第一类整合酶基因，3保守区域为对季铵盐类及磺胺类药物的抗性基因。

22反向扩增第一类整合子的旁翼基因片断常规PCR技术是扩增两个引物之间的DNA片段，而反向PCR是用反链的互补引物来扩增两引物之外的DNA片段，其目的是扩增一般已知目的顺序旁侧的DNA。

由于反向PCR可用于研究与已知DNA片段相连的未知染色体序列，因此又被称为染色体步移。

此法所选择的引物虽与已知DNA序列互补，但两引物37端是反向的。

反向PCR扩增前，先用限制性内切酶酶解DNA，然后用连接酶使带有粘性末端的靶片段自I：

茨昂威沙门菌S191；2：

霍乱弧菌ol群SKlO（阳性对照）；3：

大肠埃希菌C600（阴性对照）；4：

100bpDNA分子量标准图linalPCR反应产物电泳结果万方数据中国抗生紊杂志2008年2月第33卷第2期-113l：

qbXl74RFDNAHaeIII片段；2：

大肠埃希菌0500（阴性对照）；3：

霍乱弧菌01群SK10（阴性对照）；4：

茨昂威沙门菌S191图23CSPCR反应产物电泳结果身环化，最后用一对反向引物进行PCR扩增，得到的线性DNA将含有两引物外侧的未知序列。

根据以上反应原理，首先将目的菌株的染色体DNA进行纯化，纯化后的染色体DNA分别用EcoRV和Hind进行限制性酶切，由于第一类整合酶基因intll的基因序列上无EcoRV和Hind的酶切位点，这样可确使酶切片段含有完整第一类整合酶基因，同时兼含其两端相邻的基因序列。

酶切后的染色体DNA经过酚氯仿再次纯化后进行自身DNA环化反应，因为酶切后的DNA片段两端为黏性末端，在I4DNA连接酶的作用下可以自身环化，并以环化产物为PCR模板，进行反向PCR反应。

反向扩增DNA片段的凝胶电泳如图3所示。

由EcoRV和HindllI两种限制性内切酶酶切后的DNA为模版的反向扩增产物的大、小分别为6000和1500bp左右。

这两个反向PCR产物，含有整合子的上游序列比例和下游序列比例不同，这和限制性酶切的选择和整合子旁翼DNA序列有关，可以通过克隆产物的鉴定进一步分析和选取。

23反向扩增产物的基因序列分析目前质粒载体的大、小在3000bp左右，为了将来进一步深人研究基因的重组和转化具有可行性，同时根据以往研究中整合酶基因的调控因子位于旁翼序列中可能的范围，选择1500bp左右的片段进行测序hDNA1500020000分子址标准；2：

EcoRV酶切摸板扩增产物；3：

Hind酶切DNA模版扩增产物；4：

Hid酶切DNA模版扩增产物的凝胶纯化产物图3反向扩增DNA片段的凝胶电泳和序列分析，结果表明，在1502bp的DNA片段上（包括76bp片段）为第一类整合酶基因intll部分片段，1052bp为未知基因片断，175bp为耐药基因盒aadA2的部分片段，两端为限制性内切酶HindIII酶切位点。

在第一类整合酶上游未知DNA片段中含有2个解离酶的结合位点，解离酶结合位点I和解离酶结合位点。

该区域序列与编码解离酶的tnpR（1052bp）有88同源性，序列分析结果表明含有1个开放阅读框ORF，其编码172氨基酸，判断其可能是编码解离酶的基因，同时也可能作为第一类整合酶基因的调控因子，通过其蛋白表达的分析实验验证是否为调控基因是今后研究展开的方向。

3小结目前，对于整合子介导机制已经基本明确。

整合子主要依赖整合酶基因intll的作用，捕获各种耐药基因盒，致使细菌发生耐药性甚至是多重耐药性。

因此，如何对细菌耐药基因盒的表达和整合酶基因进行调控，是控制细菌耐药性产生和传播的关键。

研究整合子的旁翼序列，使第一类整合子的结构可以更加清晰及明确，有助于进一步分析整合子的调控因子，控制细菌耐药基因的捕获和表达。

参考文献【l】张宏梅，石磊，李琳APPCR法沙门氏菌第一类整合子鉴定指纹图谱分析【J】中国抗生索杂志，2006，31（8）：

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13J5一1321万方数据反向PCR法扩增沙门菌第一类整合子旁翼基因序列反向PCR法扩增沙门菌第一类整合子旁翼基因序列作者：

张宏梅，石磊，李琳，ZhangHong-mei，ShiLei，LiLin作者单位：

张宏梅,ZhangHong-mei（广东工业大学轻化工学院,广州,510006），石磊,李琳,ShiLei,LiLin（华南理工大学食品与生物工程学院,广州,510641）刊名：

中国抗生素杂志英文刊名：

CHINESEJOURNALOFANTIBIOTICS年，卷（期）：

2008，33

（2）引用次数：

0次参考文献（7条）参考文献（7条）1.张宏梅.石磊.李琳AP-PCR法对沙门菌第一类整合子鉴定指纹图谱分析期刊论文-中国抗生素杂志2006（8）2.张宏梅.石磊.李琳.郭祀远细菌耐药基因盒的捕获和表达机理的研究进展期刊论文-中国抗生素杂志2003（11）3.TammeR.CampE.KortschakRDNompecifie,nestedsuppressionPCRmethodforisolationofunsownflankingDNA2000（5）4.RudiK.FossheimT.JakobsenKSRestrictioncuttingindependentmethodforcloninggenomieDNAsegmentsoutsidetheboundariesofknownsequenees1999（6）5.肖月华.罗明.方卫国.罗克明.侯磊.罗小英.裴炎利用YADE法进行棉花基因组PCR步行期刊论文-遗传学报2002

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本文对第三代头孢菌素和氟喹诺酮同时耐药的志贺菌、多重耐药的非01、非0139霍乱弧菌、对哌拉西林/他唑巴坦等含酶抑制剂抗菌药物，以及头孢哌酮耐药而对头孢噻肟敏感的大肠埃希菌等菌株进行了研究，并把耐药基因与其遗传环境有机地联系起来，研究其耐药性转移的机制。

一、产超广谱-内酰胺酶福氏志贺菌中质粒介导的喹诺酮耐药基因qnrS的发现和研究目的：

明确一株对第三代头孢菌素和氟喹诺酮同时耐药的福氏志贺菌的分子机制，了解质粒介导喹诺酮耐药基因的结构特征。

方法：

通过接合试验了解耐药性是否由质粒介导；用PER分别扩增染色体和质粒介导的喹诺酮耐药基因并进行序列分析，检测染色体介导耐药的突变位点和质粒介导耐药的基因型；用PER扩增CTX-M各组ESBLs基因并进行序列分析，检测RJ506所携带ESBL的基因型；对耐药质粒进行“鸟枪法”随机克隆实验并对插入到