ClonExpress一步法定向克隆无缝克隆试剂盒说明书.pdf

ClonExpress一步法定向克隆无缝克隆试剂盒说明书.pdf

《ClonExpress一步法定向克隆无缝克隆试剂盒说明书.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《ClonExpress一步法定向克隆无缝克隆试剂盒说明书.pdf（7页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。

使用说明书Vazymebiotechco.,网站/Web:

咨询热线/Tel:

400-600-9335销售/Sales:

技术支持/Support:

技术服务/Service:

VazymeBiotechCo.,LtdVersion3.2ClonExpressTMIIOneStepCloningKit产品概要产品组成贮藏条件实验方案参考实例注意事项常见问题与解决方案01/02ClonExpressTM快速克隆技术ClonExpressTM技术是一种简单、快速并且高效的DNA定向克隆技术，可将插入片段PCR产物定向克隆至任意载体的任意位点。

将载体在克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR引物5端引入线性化克隆载体末端序列，使得插入片段PCR产物5和3最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列（15bp20bp）。

这种两端带有载体末端序列的PCR产物和线性化克隆载体按一定比例混合后，在ExnaseTM的催化下，仅需反应30min即可进行转化，完成定向克隆。

克隆阳性率可达95%以上。

ClonExpressTMII是新一代的重组克隆试剂盒，该试剂盒中包含有重组反应所需缓冲液和重组酶ExnaseTMII。

和上一代产品相比，ExnaseTMII中添加了独特的重组增强因子。

一方面，这种增强因子可以显著提高重组克隆效率，即便使用低效率感受态细胞（107cfu/g）也可实现高效克隆（100cfu/ngVector）。

另一方面，ExnaseTMII还兼容常规酶切、PCR反应体系。

克隆载体酶切产物或PCR产物和插入片段PCR产物可以不进行DNA纯化直接用于重组克隆，极大的简化了实验步骤。

产品优点-简单、快速、高效-适用于向几乎任何载体的任何位点进行定向克隆-无需考虑插入片段自身携带的酶切位点-可高效克隆50bp10kb片段-不依赖于连接酶及磷酸酶，克隆阳性率可达95%以上-线性化克隆载体和PCR产物可不进行纯化直接克隆应用范围-快速克隆-高通量克隆-无缝克隆-DNA定点突变1/产品概要2/产品组成组分C112-01（25rxn）C112-02（50rxn）5CEIIBufferExnaseTMII500bpcontrolinsert（25ng/l）pUC19controlvector,linearized（50ng/l）100l50l5l5l200l100l5l5lCatalog目录03/044/实验方案4.1实验流程概览（图一）1）.线性化克隆载体制备（参见4.2）；2）.插入片段扩增引物设计（参见4.3）；3）.插入片段PCR扩增（参见4.4）；4）.进行重组反应（参见4.5）；5）.反应产物转化、涂板（参见4.6）；6）.克隆鉴定（参见4.7）。

4.2制备线性化载体选择合适的克隆位点，并对克隆载体进行线性化。

我们推荐您尽量选择无重复序列且GC含量均匀的区域进行克隆。

当载体克隆位点上下游20bp区域内GC含量均在40%60%范围之内时，重组效率将达到最大。

克隆载体线性化方式可以为限制性内切酶酶切消化，也可以为反向PCR扩增。

A线性化克隆载体由酶切制备双酶切线性化：

线性化完全，转化背景（假阳性克隆）低。

推荐使用。

单酶切线性化：

线性化程度较差。

可适当延长酶切时间以降低转化背景。

ClonExpressTMII重组反应体系兼容几乎所有的酶切反应体系。

克隆载体酶切产物加热失活内切酶（参见内切酶使用说明书，例如HindIII，65孵育20min完全失活）后可直接用于重组反应。

B线性化克隆载体由反向PCR扩增制备注：

ClonExpressTMII重组反应体系内无DNA连接酶，不会发生载体自连反应。

因此，即使是以单酶切方式制备的线性化载体也无需进行末端脱磷酸处理。

重组产物转化后出现的假阳性克隆（无插入片段）是由未线性化环状载体转化而形成的。

如这种假阳性克隆比例较高，应重新制备线性化克隆载体。

注：

直接使用酶切产物或扩增产物进行重组反应时，使用体积不应超过4l（重组反应总体积的1/5）。

克隆载体酶切产物或PCR扩增产物DNA纯度较低且有可能含有未线性化环状质粒，直接使用进行重组反应时，重组效率、克隆阳性率都会有所降低。

因此，在进行较大片段（5kb）克隆时，我们推荐您使用高质量的试剂盒对线性化克隆载体进行胶回收纯化，以提高DNA纯度并去除一部分未线性化的环状载体（其电泳位置不同于线性化克隆载体）。

不同方式制备的线性化克隆载体的使用方式可查阅表一。

我们推荐您使用高保真聚合酶进行载体扩增（PhantaTMSuper-FidelityDNAPolymerase,Vazyme,P501）以减少扩增突变的引入。

PCR扩增模板应尽量使用预线性化质粒，以防止残留环状质粒模板对克隆阳性率的影响。

ClonExpressTMII重组反应体系兼容常规PCR反应体系。

因此，如扩增模板为预线性化质粒且PCR产物电泳条带单一，扩增产物可以无需纯化直接用于重组反应。

表一：

线性化克隆载体的使用方式线性化载体制备方式快速实验方案最佳实验方案模板类型PCR制备有明显非特异性扩增环状质粒环状质粒预线性化质粒、基因组、cDNA加热失活内切酶后直接使用扩增特异DpnI消化后直接使用（降解扩增模板）直接使用酶切消化制备胶回收胶回收胶回收胶回收或DpnI消化后胶回收图一：

使用ClonExpressTMII进行基因克隆实验流程用于重组反应的克隆载体必须为线性化载体。

该线性化载体可通过内切酶消化环状载体获得，也可由反向PCR扩增环状载体获得（图，上左）。

插入片段由PCR扩增制备。

所用扩增引物在设计时需在其5端添加线性化克隆载体末端序列（图中以红色和蓝色标记）。

使用该引物对扩增插入片段，扩增产物5和3最末端的序列分别和线性化克隆载体两末端序列完全一致（图，上右）。

以线性化克隆载体和插入片段扩增产物配制重组反应体系，37反应30min即可完成重组反应，实现两线状DNA的体外环化（图，中）。

重组产物直接进行转化，平板上会形成数百个单克隆供后期阳性筛选（图，下）。

本产品应置于-20储存。

3/贮藏条件ClonExpressTMII引物设计总的原则是：

通过在引物5端引入线性化克隆载体末端同源序列，使得插入片段扩增产物5和3最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列（15bp20bp）。

以pUC18作为克隆载体为例，引物设计方案如图二所示。

4.3插入片段扩增引物设计05/06图二：

重组引物设计方案4.4插入片段PCR扩增4.5进行重组反应插入片段可用任意PCR酶（Taq酶或高保真酶）扩增，无需考虑产物末端有无A加尾（重组过程中将被去除，在最终载体中不会出现）。

我们推荐您使用高保真聚合酶进行扩增（PhantaTMSuper-FidelityDNAPolymerase,Vazyme,P501），以减少扩增突变的引入。

PCR结束后，取少量产物进行琼脂糖电泳以检验扩增产量和特异性。

ClonExpressTMII重组反应体系兼容常规PCR反应体系。

因此，如扩增模板不是与克隆载体抗性相同的环状质粒，且PCR产物电泳条带单一，扩增产物可以无需纯化直接用于重组反应。

PCR扩增产物DNA纯度较低，直接使用进行重组反应时，重组效率、克隆阳性率都会有所降低。

因此，在进行较大片段（5kb）克隆实验时，我们推荐您使用高质量的试剂盒对扩增产物进行胶回收纯化以提高DNA纯度。

插入片段扩增产物的使用方式可查阅表二。

于冰水浴中配制如下反应体系。

如果不慎将液体粘在管壁，可通过短暂离心使其沉入管底。

ClonExpressTMII重组反应体系最适克隆载体使用量为0.03pmol；最适克隆载体与插入片段摩尔比为1:

2，即最适插入片段使用量为0.06pmol。

这些摩尔数对应的DNA质量可由以下公式粗略计算获得：

最适克隆载体使用量=0.02克隆载体碱基对数ng（0.03pmol）最适插入片段使用量=0.04插入片段碱基对数ng（0.06pmol）例如，将长度为2kb的插入片段克隆至长度为5kb的克隆载体时，克隆载体的最适使用量应为：

0.025000=100ng;插入片段最适使用量应为：

0.042000=80ng。

注：

如最终引物长度超过40bp，我们推荐您在引物合成时选用PAGE纯化，可提高克隆成功率。

计算扩增引物退火温度时，只需计算基因特异性扩增序列的Tm值，载体末端同源序列不应参与计算。

ddH2O5CEIIBuffer线性化克隆载体插入片段扩增产物ExnaseTMIIUpto20l4l50200ng20200ng2表二：

扩增产物推荐使用方式注：

直接使用扩增产物进行重组反应时，使用体积不应超过4l（重组反应总体积的1/5）*当线性化克隆载体为酶切制备时，插入片段扩增产物经DpnI消化结束后应置于85加热20min将DpnI失活，以避免重组反应时残留DpnI对克隆载体的降解。

PCR扩增情况预线性化质粒、基因组、cDNA直接使用胶回收胶回收或DpnI消化后胶回收胶回收DpnI消化后直接使用*有明显非特异性扩增PCR模板类型快速实验方案扩增特异与克隆载体抗性相同的环状质粒最佳实验方案07/081.当插入片段长度大于克隆载体时，最适克隆载体与插入片段使用量的计算方式应互换，即将插入片段当做克隆载体/克隆载体当做插入片段进行计算。

2.线性化克隆载体的使用量应在50200ng之间；插入片段扩增产物的使用量应在20200ng之间。

当使用上述公式计算DNA最适使用量超出这个范围时，直接选择最低/最高使用量即可。

例如，插入片段长度为100bp，最适使用量计算值为4ng，实际反应体系内使用量应为插入片段扩增产物最少使用量20ng。

3.线性化克隆载体和插入片段扩增产物不进行DNA纯化直接使用时，加入总体积应不超过反应体系体积的1/5，即4l。

注意:

最方便快捷的方法是菌落PCR。

用无菌的枪头或牙签将单个菌落挑至2050lLB培养基中混匀，直接取1l作为PCR模板。

我们推荐您至少用一条通用测序引物进行菌落PCR，这样可以避免PCR假阳性的产生。

将PCR阳性菌落的剩余菌液接种至含有适当抗生素的LB培养基中培养过夜，提取质粒做后续的鉴定。

4.7克隆鉴定4.6反应产物转化、涂板注意:

我们推荐您使用转化效率108cfu/g的感受态细胞。

如果感受态转化效率5kb）克隆时、使用环状质粒作为扩增模板时、当扩增产物不特异时，DNA应进行胶回收纯化琼脂糖电泳检测在冰水浴中配制；根据实际浓度，按照重组反应所需最适DNA量以及比例配制在温控比较精确的仪器内（PCR仪或水浴锅），37反应30min反应完成后立即将反应管置于冰水浴中冷却5min冷却后的反应产物应在1hr内进行转化，转化之前应一直保持冰水浴低温。

如需储存，于-20进行使用至少一条载体通用引物进行扩增鉴定不应该这样做选择带有重复序列，或高GC、高AT区域的区域进行克隆载体末端同源序列少于推荐长度或者添加序列与线性化克隆载体末端序列不完全一致不完全线性化，有环状质粒残留扩增不特异，杂带较多在进行较大片段（5kb）克隆、使用环状质粒作为扩增模板时、或者当扩增产物不特异时，DNA未纯化直接使用吸光度法检测在室温下配制；不考虑DNA浓度随意配制反应温度偏离37太多、反应时间不足或者超过30min反应完成后室温放置冷却后的反应产物置于室温长时间放置后进行转化；4长时间储存后进行转化使用两条基因特异性引物进行扩增鉴定实验步骤载体克隆位点选择插入片段引物设计克隆载体线性化插入片段PCR扩增线性化载体/插入片段扩增产物DNA纯化线性化载体/插入片段扩增产物DNA浓度测定重组反应体系配制进行重组反应终止重组反应转化菌落PCR下表列出了使用ClonExpressTMII进行重组克隆时主要注意事项（表三）：

6/注意事项使用移液器上下吹打数次，轻轻混匀各组分。

置于37反应30min。

反应完成后立即将反应管置于冰水浴中，冷却5min。

5）反应体系配制及反应根据4.5进行重组反应章节中计算公式，计算重组反应所需DNA量：

pUC19线性化克隆载体最适使用量：

0.022700（2700bp）50ng插入片段PCR产物最适使用量：

0.04500（500bp）20ng图五：

转化后过夜培养的平板图七：

酶切产物琼脂糖电泳M：

MarkerIII；2-8,10-12，10个单克隆。

图六：

菌落PCR琼脂糖电泳6）重组产物转化、涂板参见4.6反应产物转化、涂板。

所用感受态转化效率为107cfu/g。

转化完成后，将培养菌液在5,000rpm离心3min收集菌体，用100lLB培养基重悬后全部涂板。

7）克隆鉴定过夜培养后，重组反应转化平板上形成数百个单克隆，而阴性对照反应转化平板上的克隆数应显著少于前者（图五）。

挑取重组反应转化平板上24个克隆进行菌落PCR鉴定（TaqMasterMix,Vazyme,P112），鉴定引物使用测序引物M13F，RV-M。

如果克隆正确，应有约650bpPCR条带出现。

经鉴定所挑24个克隆中有22个克隆（除1#和9#外）确认为阳性克隆（图六）。

挑取其中10个克隆提取质粒后经EcoRI和HindIII双酶切鉴定确认，全部为阳性（图七）。

为了方便体系配制时准确吸取，将pUC19酶切产物用ddH2O稀释至50ng/l；扩增产物用ddH2O稀释至20ng/l。

于冰水浴中配制以下反应体系：

ddH2OpUC19酶切产物（50ng/l）500bp插入片段扩增产物（20ng/l）5CEIIBufferExnaseTMIITotal*阴性对照反应可用来确认线性化克隆载体和插入片段扩增产物中有无环状质粒残留。

推荐进行。

重组反应12l1l1l4l2l20l阴性对照*18l1l1l0l0l20l11/121平板上长不出克隆或克隆数目很少a）.感受态效率低：

使用新制备或妥善冻存的感受态细胞，确保转化效率107cfu/g。

每次可设置一组转化质粒的对照实验，以检测感受态细胞的转化效率。

b）.线性化克隆载体和插入片段扩增产物的使用量不足/过量，或者比例不佳：

尽量按照推荐的量和比例配制反应体系。

在进行重组克隆时，如克隆载体使用量低于0.01pmol，或者克隆载体与插入片段摩尔比超出2:

11:

5的范围时都会严重降低克隆效率。

所以，反应体系应尽量按照最适DNA需求量进行配制。

请务必预先检测线性化克隆载体和插入片段PCR产物的浓度。

常用的吸光度测量法极易受DNA纯度、DNA稀释液pH等因素影响，测定值和DNA实际浓度往往偏差非常大。

因此，我们强烈推荐您通过琼脂糖电泳来测定样品中的DNA浓度（测定方法参见5/参考实例）。

c）.载体和插入片段不纯，抑制反应：

未纯化DNA加入重组反应体系内的总体积不应超过4l（反应体系体积1/5）。

尝试对线性化载体、PCR产物进行胶回收纯化。

重组反应体系中应尽量避免金属络合剂（如EDTA）的带入。

因此，我们推荐您将DNA纯化产物溶解在pH8.0的ddH2O中保存（常规胶回收试剂盒中的洗脱液可用pH8.0的ddH2O替代），请勿使用TE进行DNA保存。

d）.感受态细胞中加入了过多的反应产物：

反应产物的转化体积不应超过感受态细胞体积的1/10，否则会降低转化效率。

2多数克隆不含插入片段a）.克隆载体线性化不完全：

即使是痕量未完全酶切的载体也会产生很高的转化背景。

提高限制性内切酶使用量、延长酶切反应时间、胶回收纯化酶切产物，都可以有效减少甚至消除环状质粒残留。

b）.反应体系中混入了相同抗性的质粒：

PCR扩增模板（扩增克隆载体或者扩增插入片段）为环状质粒。

当扩增产物直接用于重组反应时，残留环状质粒模板会产生较高的转化背景。

尽量使用预线性化质粒作为扩增模板、扩增产物进行DpnI消化、扩增产物进行胶回收纯化，都可以有效减少甚至消除环状模板质粒残留。

3克隆含有不正确的插入片段a）.PCR产物混有非特异扩增产物：

优化PCR体系，提高特异性；胶回收PCR产物；鉴定更多的克隆。

4特别提醒！

在选择克隆位点时，应避免选择克隆位点上下游50bp内有重复序列的区域。

当克隆位点上下游20bp区域内GC含量均在40%60%范围之内时，重组效率将达到最大。

如这部分区域GC含量高于70%或者低于30%，重组效率会受到较大影响。

b）.载体线性化不完全：

如果线性化载体不是由空载体酶切或扩增制备，而是由已插入其他不同片段的载体酶切或扩增制备而成，不完全酶切或残留环状模板质粒将导致很高的转化背景，使部分克隆中含有不正确的插入片段。

提高酶切效率、使用预线性化质粒作为扩增模板、扩增产物进行DpnI消化、扩增产物进行胶回收纯化，都可以有效避免此类情况发生。

7/常见问题与解决方案