细胞免疫荧光染色的自我总结.pdf

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免疫荧光实验所需试剂免疫荧光实验所需试剂1、PBS和PBST（0.05%0.05%Tween20inPBSTween20inPBS：

2000mlPBS+1ml2000mlPBS+1ml吐温吐温）2、4多聚甲醛/PBS（4g（4g多聚甲醛多聚甲醛+50+50-80mlPBS+80mlPBS+加热至加热至6060并搅拌并搅拌+滴加滴加少量少量1mol/L1mol/L的的NaOHNaOH溶液溶液使其使其变清亮，定变清亮，定容至容至100ml）100ml）3、0.1tritonX-100/PBS配制（999mlPBS+1mlTritonXTritonX-100/100/曲拉通曲拉通XX-100100（碧云天（碧云天ST795ST795），因为TritonX-100很粘稠，需减掉枪头尖慢吸）4、2二抗同源血清封闭：

组织切片上有剩余的位点可以与一抗非特异性结合，造成后续结果的假阳性；封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合；也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致（中杉金桥中杉金桥封闭用正常羊血清工作液封闭用正常羊血清工作液ZLI9022）ZLI9022）5、二抗（中杉金桥（中杉金桥594594标记山羊抗兔标记山羊抗兔IgGZF0616IgGZF0616）（中杉金桥（中杉金桥488488标记山羊抗小鼠标记山羊抗小鼠IgGZF0512IgGZF0512）细胞爬片的免疫荧光染色步骤：

细胞爬片的免疫荧光染色步骤：

1）实验前一天，将细胞接入铺有2222mm（或2424mm）盖玻片悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片的六孔板或十二孔板中。

2）第二天，待细胞汇合度达到70左右开始进行染色步骤。

3）用新鲜配制4多聚甲醛4固定细胞10分钟。

4）PBS洗三遍，每次5分钟。

5）用0.1tritonX-100PBS配制对细胞透化处理10分钟。

6）加PBS，使液面覆盖玻片。

如果细胞贴壁好，PBS洗时可轻摇孔板洗三遍，每次5分钟不必一直摇。

如果细胞贴壁不好就不必了，可以考虑多加点PBS，或者每次浸泡时间稍延长1-2分钟。

7）2二抗同源血清购买的纯的羊或牛血清用PBS稀释至2%，当前用的是羊血清封闭30分钟-60分钟，PBS简单冲洗两遍或者不洗。

8）染色前根据公司说明书建议的浓度配好1抗（1抗稀释液购自中杉金桥）建议先测试抗体浓度，可依据公司推荐的浓度增加和减低浓度进行测试；如公司推荐1：

200，可将抗体配成1：

50、1：

100、1：

200、1：

400、1：

600，以不同浓度进行孵育，如果抗体有效，应当在有效染色的抗体浓度范围内都可染色，只是颜色深浅不同，加入1抗，4冰箱孵育，一般要大于18小时有的抗体可能需要多达50小时。

孵育过程中注间保持容器湿度，切勿干片！

。

9）PBS洗三遍，每次5分钟。

10）避光！

加入PBS配制的二抗，室温孵育30-45分钟似乎室温高一点二抗结合得更好，实际操作过程中应考虑将室温控制在20-35。

11）避光！

PBS洗四遍，每次5分钟。

12）避光！

加入0.5ug/mlDAPIPBS配制当前也有已经配好的DAPI，如碧云天公司的，直接用染色10分钟，染完后用微量进样器将玻片上附着的残余DAPI尽可能小心吸干净。

13）避光！

用PBS洗一次5分钟或简单洗三遍，去除多余的DAPI，洗完后玻片上附有少量PBS，不必吸掉，因为玻片不宜太干燥。

14）避光！

加入20L-50L封片剂（购自碧云天公司）封片封闭液PH8.5，封片剂多少根据玻片大小决定，原则上要让玻片贴在载玻片上，但不应该滑动。

15）将封片好的细胞样品保存在湿盒中，盒中放置湿的滤纸，可于4度冰箱中存放2周以上。

注意：

注意：

1、玻片与载玻片的处理:

泡酸去污,冲洗,晾干,75%酒精杀菌，泡纯酒精脱脂,蒸馏水洗（此时用镊子夹着洗）,晾干备用。

2、封闭液若使用的是100%的纯牛或羊血清，使用前用PBS稀释至2%，不与一抗同源即可。

3、加入二抗时与加二抗后的步骤全部避光操作！

尽可能减少荧光的淬灭。

4、PBS应当过滤，减少残渣。