酶工程考试重点文档格式.docx
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RR’===R+R’
异构酶类
～85种
R===R’
合成酶类（连接酶类）
～80种
R+R’+ATP===RR’+ADP（AMP）+Pi（PPi）
活性中心：
酶分子上与催化活性直接相关的少数氨基酸残基组成的催化区域,称作酶的活性中心（activecenter）.
包括结合部位（bindingsite）和催化部位（catalyticsite）。
1.活性中心在种系进化上的严格保守性
2.酶活性中心构象的维持依赖于酶分子空间结构的完整性
3.酶活性中心各基团的相对位置得以维持,就能保全酶的活力
比活力：
酶的比活力（specificactivity）：
每毫克蛋白所含的酶单位数，用U/mg蛋白表示。
活力：
酶活力（enzymeactivity）也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。
酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。
酶活力单位，一个标准单位：
在特定的条件下（25℃，pH、底物浓度等其他条件均为最适条件），1分钟能转化1微摩尔底物所需的酶量。
酶的转换数：
1.分子活性定义：
在最适条件下，每摩尔酶每分钟所转变的底物摩尔数（即每摩尔酶的酶单位数）。
2.对于寡聚酶：
在最适条件下，每摩尔活性亚基或催化中心每分钟所转变的底物摩尔数。
3.用min-1表示。
4.kcat=Vmax/[Et]
Km：
酶反应动力学常数Km，相当于反应达到最大速度一半时的底物浓度，或者说，相当于要使反应系统有一半的酶分子参加反应所必须具有的底物浓度。
物理意义：
⑴特定的反应，特定的反应条件下，Km是个特征常数，可部分描述酶反应性质、反应条件对酶反应速度的影响。
故可用来鉴别不同的酶。
⑵1/Km表示酶与底物的亲和力，Km越大，亲和力越小，反之越大。
⑶当v=V/2时，Ks=[S]。
表明Km相当于反应达到最大速度一半时的底物浓度，或者说，相当于要使反应系统有一半的酶分子参加反应所必须具有的底物浓度。
⑷通过Km可判断酶的最适底物，因为最适底物具有最大的V/Km。
⑸通过Km可了解酶的底物在体内可能具有的浓度水平。
一般酶<
<
Km,那么v<
V,大部分酶处于浪费状态;
反之,如果[S]>
>
Km,那么v≈V，[S]将失去其生理意义。
⑹通过体外测定某些物质对Km的影响，可以推断出该物质可能有的生理效应，如作为抑制剂或活化剂等。
酶合成的基因调节控制理论：
操纵子学说（operontheory）
操纵子——基因表达的协同单位：
a.结构基因（编码蛋白质,structuralgene,S）；
b.控制部位：
操纵基因（operatorgene,O）；
启动子（promotorgene,P）
1.调节基因（regulatorgene）：
可产生一种组成型调节蛋白（regulatoryprotein）（一种变构蛋白），通过与效应物（effector）（包括诱导物和辅阻遏物）的特异结合而发生变构作用，从而改变它与操纵基因的结合力。
调节基因常位于调控区的上游。
2.启动基因（promotorgene）（启动子）：
有两个位点：
（1）RNA聚合酶的结合位点
（2）cAMP-CAP的结合位点。
CAP：
分解代谢产物基因活化蛋白（catabolitegeneactivatorprotein），又称环腺苷酸受体蛋白（cAMPreceptorprotein，CRP）。
只有cAMP-CRP复合物结合到启动子的位点上，RNA聚合酶才能结合到其在启动子的位点上，酶的合成才能开始。
3.操纵基因（Operatergene）:
位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能特异性地与调节基因产生的变构蛋白结合，操纵酶合成的时机与速度。
4.结构基因（Structuralgene）:
决定某一多肽的DNA模板，与酶有各自的对应关系，其中的遗传信息可转录为mRNA，再翻译为蛋白质。
酶合成调节的类型：
1.诱导（induction）
组成酶：
细胞固有的酶类。
诱导酶：
是细胞为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的一类酶。
2.阻遏（repression）
分解代谢物阻遏（cataboliterepression）
反馈阻遏（feedbackrepression）
酶生物合成的反馈阻碍作用：
由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。
实验：
（1）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时，检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在；
（2）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。
（3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌体生长的经济原则:
不需要就不合成。
分解代谢物阻碍作用：
指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。
分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。
实验：
细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡萄糖。
待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二次生长现象”
这一现象又称葡萄糖效应，产生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。
此调节基因的产物是环腺苷酸受体蛋白（CRP）,亦称降解物基因活化蛋白（CAP）。
酶生物合成的模式：
根据酶的合成与细胞生长之间的关系，可将酶的生物合成分为3种模式，即：
1.生长偶联型：
a.同步合成型
酶的生物合成与细胞生长同步。
酶的合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。
当去除诱导物、细胞进入平衡期后，酶的合成立即停止，表明这类酶所对应的mRNA很不稳定。
b.中期合成型
酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的合成也随着停止。
酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。
所对应的mRNA是不稳定的。
2.部分生长偶联型：
延续合成型
酶的合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成较长一段时间。
可受诱导，一般不受分解代谢物和产物阻遏。
所对应的mRNA相当稳定。
3.非生长偶联型：
滞后合成型
只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成并大量积累。
许多水解酶的生物合成都属于这一类型。
受分解代谢物的阻遏作用。
所对应的mRNA稳定性高。
米氏方程（酶促反应动力学的推导及其原理）：
影响酶促反应速度的因素
温度、pH、激活剂、抑制剂、底物浓度、酶浓度，等。
可逆抑制（底物浓度对抑制程度的影响）：
不可逆抑制：
抑制剂与酶分子中的必需基团以共价键结合，引起酶活性丧失，用透析等物理方法不能除去抑制剂，因而不能使酶复活。
可逆抑制：
抑制剂与酶分子必需基团以非共价键结合，引起酶活力降低或丧失，用透析等物理方法能除去抑制剂而使酶活力恢复。
①竞争性抑制作用
②反竞争性抑制作用
③非竞争性抑制作用
④混合型抑制作用
分离纯化的原理及其方法:
原理：
1、根据溶解度的不同：
盐析法、有机溶剂沉淀法、共沉淀法、选择性沉淀法。
2、根据分子大小的差别：
胶过滤（层析）法、超过滤法、超离心法。
3、根据电学、解离性质：
吸附（层析）法、离子交换层析法、电泳法、聚焦层析法。
4、基于酶和底物、辅酶因子以及抑制剂间具有专一的亲和作用特点：
亲和层析。
5、利用稳定性差异：
选择性热变性法，酸碱变性法，表面变性法。
方法：
1、沉淀分离（溶解度差异）
a.盐析沉淀法：
logS=β-KI（S-蛋白质溶解度；
β-水中溶解度；
K-盐析常熟；
I-离子强度）
b.等电点沉淀法
c.有机溶剂沉淀法
温度：
0℃下操作。
pH=pI。
离子和离子强度：
中性盐通常能增大蛋白质的溶解度，并能减少变性影响。
多价阳离子效应：
pH略高于pI，使之带负电荷，添加少量多价阳离子，与负电蛋白络合。
有机溶剂：
丙酮分离效果最好，引起失效也较少。
d.复合沉淀法
e.选择性变性沉淀法,等。
2、离心分离、过滤与膜分离（分子大小的差异）
3.层析分离——极性相似的两分子间，其亲和力相近。
层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。
它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的（称为固定相），另一个相则流过此固定相（称为流动相）并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。
层析方法
分离依据
吸附层析
利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离
分配层析
利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离
离子交换层析
利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的
凝胶层析
以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离
亲和层析
利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化
聚焦层析
将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离
4.电泳分离
5.萃取分离
酶的抽提:
在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。
1、“普遍”抽提
2、选择性抽提
抽提液的具体组成和抽提条件的选择取决于酶的溶解性、稳定性以及如何最有利于切断酶和其他物质的联系。
pH：
选择的pH不能超出酶的酸碱稳定范围，且最好远离目的酶的等电点。
即：
酸性蛋白------碱性溶液
碱性蛋白------酸性溶液
盐：
低盐溶液有利于酶蛋白溶解，故抽提常用等渗溶液。
0.02—0.05M磷酸缓冲液，0.15MNaCl
用焦磷酸钠溶液和柠檬酸钠缓冲液可螯合金属离子，切断与其他物质结合。
0∼4℃之间，有的可以高一些（室温），如胃蛋白酶37℃。
其他：
防止氧化---加CySH,DTT,巯基乙醇;
防蛋白酶水解，加蛋白酶抑制剂（如苯甲磺酰氟（PMSF））等；
溶酶：
常规操作，易提取。
膜酶：
结合不太紧密的，在颗粒体结构受损时就能释放，抽提不难。
如：
α-酮戊二酸脱氢酶，延胡索酸酶等可用缓冲液抽提；
细胞色素C可用0.145mol/L三氯醋酸抽提。
结合紧密的酶，常以脂蛋白络合物形式存在，可做成丙酮粉后抽提，还可用正丁醇处理。
正丁醇具有高度的亲水性和亲脂性，能破坏酶与脂蛋白间的连接使酶进入溶液。
抽提液的用量通常为原料量的1～5倍。
“扩展床吸附层析”：
可将抽提液的分离和相继的纯化步骤结合在一起。
即可直接从含有颗粒体的物料，如发酵液、细胞破碎液中截获所需的蛋白或酶，移去颗粒成分，从而免除了离心、过滤、浓缩等繁琐的下游步骤。
在这一系统的操作过程中，吸附剂（STREAMINE）始终处于悬浮状态，物料流输入扩展床后，推动吸附颗粒向上，没有回流，靶蛋白被吸附，而细胞碎片、细小颗粒和其他杂质则无阻滞的流出；
吸附完成后，被吸附的靶蛋白可再反向洗出。
亲和层析：
亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，而使生物分子分离纯化的技术。
酶与底物,酶与竞争性抑制剂,酶与辅助因子,抗原与抗体，酶RNA与互补的RNA分子或片段,RNA与互补的DNA分子或片段等之间，都是具有专一而又可逆亲和力的生物分子对。
故此,亲和层析在酶的分离纯化中有重要应用。
四要素：
固体基质、特异性结合底物、耦合反应、溶离
分类：
共价亲和层析
疏水层析与反相层析
金属离子亲和层析
免疫亲和层析
染料亲和层析
凝集素亲和层析
离子交换层析：
离子交换层析是利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。
离子交换剂是含有若干活性基团的不溶性高分子物质。
通过在不溶性高分子物质（母体）上引入若干可解离基团（活性基团）而制成。
按活性基团的性质不同，离子交换剂可以分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。
由于酶分子具有两性性质，所以可用阳离子交换剂，也可用阴离子交换剂进行酶的分离纯化。
DonnanEffect：
紧靠近介质表面的pH，要比外围缓冲液的pH相差一个pH单位，阳离子交换介质高一个单位，阴离子则低一个单位。
固定化酶:
是通过物理的或化学的手段，将酶束缚于水不溶的载体上，或将酶束缚在一定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶充分发挥催化作用；
过去曾称其为水不溶酶或固相酶。
固定化酶的制备方法：
酶的固定化方法很多，但对任何酶都适用的方法是没有的。
酶的固定化方法通常按照用于结合的化学反应的类型进行分类，大体可概括为四种类型：
1.吸附法
a.物理吸附法:
通过氢键、疏水键和π-电子亲和力等物理作用力将酶固定于不溶性载体的方法。
b.离子交换吸附法：
指在适宜的pH和离子强度条件下，利用酶的侧链解离基团和离子交换剂的相互作用而达到酶的固定化的方法。
c.多孔物质包络法:
利用棉布、尼龙布、金属丝网、海绵、塑料等固定化放线菌、真菌组成盘状生物反应器，进行连续生产有机酸、糖化酶、四环素。
这些材料有足够大，但空隙又不十分大的空隙，能够使细胞进入空隙，通常为细胞直径的几倍大。
d.超过滤法：
利用超过滤膜将细胞固定化。
底物和产物可以自由进出超过滤膜，而膜内的细胞却出不来。
制备成膜反应器和生物传感器。
要防止细胞生长导致浓度过高而使超过滤膜破裂。
2.共价偶联法
这是借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基闭进行偶联以制备固定化酶的方法。
特点:
由于这样得到的固定化酶结合牢固、稳定性好、利于连续使用，因此它是目前应用和报导的最多的一类方法。
不过，共价偶联反应一般比较激烈应加以注意。
通过一定的方法，在载体上引进一个活泼基团。
然后活化该基团。
最后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键。
“相对酶活力”是指固定化酶和蛋白量与之相等的原酶的活力比。
影响“相对酶活力”因素：
固定化载体、方法、条件以及酶反应系统组成。
当上述因素一定时，还受偶联量影响；
当偶联量超过一定水平后，由于过多的酶集中于载体的局部，可能造成空间位阻效应，使部分的酶无法表现活性，故“相对酶活力”往往随偶联酶量的进一步增加而下降。
在制备固定化酶时，重要的一点就是要平衡好二者的关系，这对其它类型的固定化方法也具有同样的意义。
3.交联法
利用双功能或多功能试剂在酶分子间或酶分子与载体间、或酶分子与惰性蛋白间进行交联反应以制备固定化酶的方法。
常用试剂：
戊二醛、异氰酸酯、N，N’乙烯马来亚胺、双重氮联苯胺等。
应用最广泛的是戊二醛，它两个醛基都可以与酶或蛋白质的游离氨基形成席夫碱（shiff）
（1）.酶直接交联：
在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。
固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。
（2）.酶辅助蛋白交联：
a.吸附交联法：
先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交联。
用此法所得固定化酶也可称为壳状固定化酶。
b.交联包埋法：
把酶液和双功能试剂（戊二醛）凝结成颗粒很细的集合体，再用高分子或多糖一类物质进行包埋成颗粒。
避免了颗粒太细的缺点，同时制得的固定化酶稳定性好。
4.包埋法
这是将聚合物的单体和酶溶液混和后，再借助聚合促进剂（包括交联剂）的作用进行聚合，使酶包埋于聚合物中以达到固定化酶方法。
由于酶本身一般不参与结合反应，因而比较安全。
不过在化学聚合的过程中由于自由基的产生、放热以及酶和试剂间发生化学反应等，也往往可能导致酶失效，故在选择包埋方法和控制条件时仍须注意。
包埋法分为格（网格）型包埋、微囊型包埋和脂质体包埋。
*定向固定化：
1、共价固定法
2、氨基酸置换法
3、抗体偶联法
4、生物素－亲和素亲合法
5、疏水定向固定法
*细胞固定化：
1、直接固定化法
2、包埋法
3、吸附法
4、交联和共价偶联法
影响固定化酶动力学的因素，
a、酶本身的变化，主要是由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化。
b、载体的影响
①构象改变、立体屏障以及微扰；
②分配效应和扩散限制效应；
1、构象改变、立体屏障以及微扰
构象改变主要指活性中心构象改变，导致活性降低,多出现于吸附法和共价偶联法。
立体屏障指载体孔径太小，或者由于固定化方式引起位置不当，使酶活性中心或/和调节中心造成空间障碍，底物和效应物无法与酶结合。
微扰是由于载体的亲水、疏水性质和介质的介电常数等直接影响酶的催化能力或酶对效应物作出反应能力的一种效应。
2、分配效应和扩散限制效应
分配效应是由于固定化载体的亲水和疏水性质使酶的底物、产物以及其它效应物在微观环境与宏观体系间发生了不等分配，改变了酶反应系统的组成平衡，从而影响酶反应速度的一种效应。
扩散限制效应是指底物、产物以及其它效应物的迁移和运转速度受到限制的一种效应。
3、专一性
作用于低分子底物的酶专一性没有明显变化；
既可作用于低分子底物又可作用于大分子底物的酶专一性往往会变化。
4、最适温度
最适温度与酶稳定性有关。
多数酶固定化后热稳定性上升，最适温度也上升。
5、酶稳定性
1）酶固定化后，酶活性构型更牢固，增加酶的稳定性；
2）酶固定化后，更加有利于阻止不利因素对酶的侵袭，如变性剂、抑制剂的抵抗力。
3）限制了酶分子之间的相互作用，和减少蛋白酶的破坏作用。
4）固定化后可延长酶的操纵和保存的有效期限。
5）对热稳定性，大多数升高，有些反而降低。
6、最适pH
1）载体带负电荷，最适pH向碱性方向移动。
载体带正电荷，pH向酸性方向移动。
2）催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH值比游离酶的pH值高；
反之则低。
7、米氏常数Km
Km值随载体性质变化。
①载体与底物带相同电荷，Km’>
Km，固定化酶降低了酶的亲和力。
②载体与底物带相反电荷，Km’<
Km，固定化酶提高了酶的亲和力。
酶的化学修饰及其方法：
酶的化学修饰即是在分子水平上对酶进行改造，通过人工将一些化学基团或是具有生物相容性的大分子与酶的侧链基团共价相连，从而改变酶的酶学性质的操作。
一、酶的表面修饰
（一）化学固定化
通过酶表面的酸性或碱性氨基酸残基将酶共价连接到惰性载体上，从而改变了酶所处的环境，酶的性质也相应发生了改变。
（二）酶的小分子修饰作用
利用特定的小分子修饰剂修饰酶表面的一些基团：
-COO-、-NH3+、-SH、-OH等。
（三）酶的大分子修饰
1.大分子的非共价修饰
聚乙二醇、右旋糖苷等，既能通过氢键固定在酶分子表面，也能通过氢键与外部相连，从而保护酶活力。
多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等，通过调节酶的微环境保护酶的活力。
蛋白质。
蛋白质分子间相互作用时，表面区域内排除了水分子，降低了介电常数，增加了相互作用力，从而稳定性增加。
2.大分子共价修饰
用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。
（四）分子内交联
增加酶分子表面交联键的数目。
（五）分子间交联
用双功能或多功能试剂使不同的酶交联起来产生杂合酶。
（六）脂质体包埋
脂质体是天然脂类或类固醇组成的微球体。
酶分子可包埋在其内部。
它可通过细胞的膜融合和内吞作用进入细胞内。
（七）反相胶团微囊化
表面活性剂溶解在非极性有机溶剂中可自发的形成近于球形的反相胶团。
胶团内部水的极性、黏度、酸碱性和亲水性不同于外部的水。
二、酶分子的内部修饰（侧链修饰）
采用一定的方法（一般为化学法）使酶蛋白的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法。
（一）非催化活性基团的修饰
对非催化基团修饰可改变酶的动力学性质，改变酶对特殊底物的束缚能力。
亲核残基：
Ser、Cys、Met、Thr、Lys、His
亲电残基：
Tyr、Trp
可氧化残基：
Tyr、Trp、Met
（二）催化基团的修饰
对催化活性基团可以通过选择性修饰侧链成分来实现氨基酸的取代。
定点突变：
转变氨基酸侧链。
（三）酶蛋白主链修饰（肽链有限水解修饰）
利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。
酶蛋白主链修饰主要是靠酶切/酶原激活法。
（四）肽链伸展后的修饰
先用变性剂对酶进行变性处理，再进行修饰，然后重新折叠成某种活性的构象
（五）氨基酸置换修饰
定点突变技术。
（六）酶分子的物理修饰
不改变酶的组成单位及其基团，酶分子中的共价键不发生改变，只是在物理因素的作用下，副键发生某些变化和重排。
用于了解不同物理条件下，特别是在极端条件下（高温、高压、高盐、极端pH值等）由于酶分子空间构象的改变而引起酶的特性和功能的变化情况。
三、与辅因子相关的修饰
（一）对依赖辅因子的酶的修饰
1.如果辅因子与酶是非共价结合，则可将辅因子共价结合到酶分子上。
2.引入新的具有强反应的辅因子。
（二）金属酶的金属取代
把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。
可改变酶的专一性、稳定性、抑制作用等。
大分子共价修饰：
修饰剂的选择：
大分子结合修饰采用的修饰剂是水溶性大分子。
例如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。
要根据酶分子的结构和修饰剂的特性选择适宜的水溶性大分子。
修饰剂的活化：
作为修饰剂中含有的基团往往不能直接与酶分子的基团进行反应而结合在一起。
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