可口可乐无菌验证Word格式.docx
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酒精灯、过滤膜、试管
第二部分：
操作要求
1.S2验证都应当在穿着无菌服，手套，进行全身杀菌的条件下进行
2.将样品按照验证程序要求，进行相应的处理，完毕后采用无菌取样的方式移出，进行微生物检验。
3.操作前，按照要求进行洗手、更衣、消毒等人员卫生程序。
4.不相关的人员严禁进入净化间，避免人为污染的存在。
5.所用工具事先完成消毒处理。
6.操作过程中产生的废弃包装物、废弃样品和防护用品等物品及时销毁，并对相关操作区域和接触过的区域进行彻底消毒处理。
7.凡是使接触或可能接触过菌种的地方都要进行消毒，尤其是生产车间内的灌装间，凡是接触过菌种的设备，工具，仪器表面必须进行高温灭菌或者相对应的处理
8.接种室的准备：
一房间作为接种室，内部有恒温设施，温度计，湿度计，生石灰（作为干燥剂），桌，椅各一张。
出入此房间人员必须严格控制或者指定专人房间保管钥匙
第三部分：
S2验证步骤
1．设备进行CIP和SIP，SIP时用温度测试条对微生物实验室中的杀菌锅，灌注UHT系统SIP温度，UHT保持管末端温度进行验证
2．着色试验，确定S2验证中所挂钢片的位置
3．挂钢片之前，由Krones人员做阳性对照试验，10组
4．无菌钢片安置（协助Krones人员做）：
钢片使用塑料扎带或者双面胶，悬挂或黏贴在之前通过着色实验确认的30个点上。
安置钢片时，可由三人进行操作，一人在无菌环境内安置，其余两人则协助钢片安置人，比如为其用酒精消毒，穿戴鞋套，递送工具等。
钢片安置完毕之后，关闭灌装机各个密封门，并且确认。
之后，进行COP/SOP，并且期间有相关人员对于HygieneCenter上的参数，与灌装间COP/SOP的实际时间进行确认。
关于COP/SOP参数，需事先从Ecolab取得，后依照此数据，在HygieneCenter核对，并且通过秒表记数验证数据准确性，确认方法亦从Ecolab得到。
（需设记录实验的表格）
5．无菌钢片卸载（协助Krones做）：
COP/SOP结束后，卸载钢片，可由三人进行操作，一人在无菌环境内安置，其余两人则协助钢片安置人，比如为其用酒精消毒，穿戴鞋套，递送工具等。
钢片背部以及边缘，需使用酒精或者PAA稀释等消毒液进行消毒，但是消毒液绝对不允许接触钢片正面，消毒完毕后，用9ml无菌水冲洗，并立即放入100ml洗脱液的塑料盒中，上下摇晃20分钟。
6．洗脱液膜过滤（微生物品控员做）：
洗脱液塑料盒摇晃20分钟后，置于超净工作台上取出，直接对洗脱液进行膜过滤，如产生泡沫，使用100ml无菌水加入滤杯助滤，取下滤膜，放入事先准备好的培养基平板（事先倾倒好TSA无菌培养基）。
实验后，平皿放入35-38℃培养箱，48小时后计数
第四部分：
S2验证过程中无菌流体的取样
从S2开始至结束，工厂品控人员需依据取样频率，进行微生物取样。
要求现场微生物QC取样，取样后进行膜过滤，以总菌以及霉菌/酵母温度培养。
1．无菌水总出水口
2．V401，V165，V825无菌空气
3．COP/SOP时化学中心无菌空气
4．COP/SOP时化学中心无菌水
第五部分：
用差值法计算每片浓度为6log的钢片所减少的微生物的数量级：
R=log（C0）–log（Ct）,即：
R=数量级缩减量或者数量级毁灭量，
C0=初试微生物数量和
Ct=灭菌后微生物存活数量
无菌区钢片测试可接受运行结果参考标准（COP/SOP）：
5logSporeteststrip
6log细菌量测试钢片
通过
<
1带菌钢片
至少杀灭每条带菌钢片上所含的５log微生物
未通过
≥1带菌钢片
≥1片带菌钢片，被杀灭微生物量小于５log
无菌线S3验证SOP
验证系统对包装材料外部表面消毒灭菌效果。
瓶，盖必须与即将投入生产线生产的瓶，盖设计形状，尺寸相一致
1.微生物品控准备工作：
移液枪（1ml，0.1ml，0.01ml，推荐另配一把1-9ml）以及灭菌过的枪头各100个，细菌悬浊液，菌液浓度确认后，将原液和108浓度的菌悬液冷藏待用，装有洗脱液100ml的塑料圆盒198个（121℃20分钟灭菌），无菌浇好TSA培养基的小平皿250套左右，和样品数量相当的0.45um的无菌滤膜，无菌针筒（1ml，10ml各一个），
2.洗脱液配比：
吐温0.1%、蛋白胨0.1%、石英砂稍许、氯化钠0.85%
3.小圆盒上用标签识别5个组和阳性对照
4.采样点所需物品准备无菌空气采样管、无菌空气取样器、无菌水取样器等，注意：
除了正常采样数量，还必须增加化学中心的无菌空气和无菌水
5.至少2L无菌水（用于过滤冲洗）
6.无菌9ml稀释液，数量根据阳性对照数量确定
7.75%酒精，35-38℃的培养箱，取塑料袋放入紫外灯下杀菌后备用。
酒精消毒不锈钢托盘备用3个，锡箔纸5卷，口罩若干，塑料手套若干，摇床，振荡器
8.准备接种用PET瓶至少600个（包括阳性对照、阴性对照、在实验过程中掉落损失）
9.强力剪刀1把，不锈钢剪刀2把，镊子2把，纸箱30个，
10.1500ppmPAA2L（以1L烧杯/塑料杯盛放，保证能覆盖到整把剪刀以及镊子上沿），标签纸（根据样品个数准备）
11.确认现场的PAA浓度符合要求
1.S3验证都应当在穿着无菌服，手套，进行全身杀菌的条件下进行
S3验证步骤
1.生产部保证灌装机可以正常运行
2.生产部要在注入间内放置两张用于放置瓶子和剪瓶子的非木质桌子。
3.微生物工程师准工作（由克朗斯微生物工程师主导）：
104接种：
将稀释至106/105菌悬液，用移液枪取0.01ml/0.1ml至验证所用PET空瓶外表规定区域，在该区域作好标记，室温干燥4-8小时不等，具体数量和部位参照ValidationProtocol（可以事先备好生石灰做干燥剂）。
准备好30个1.25L产品的纸箱，顶端开瓶口大小圆孔，安置倒置干燥之PET瓶，空瓶按照实际情况放置（比如接种点为瓶底，瓶子要倒置插在纸箱上安放，干燥）。
4.接种瓶上菌液干燥后，就可进行S3。
5.接种后PET瓶，使用塑料袋，按照不同部位，将175个已接种的PET瓶分成5个组别，从接种室转移到注入间，以35个一组（5个备用），挂上风道。
6.按照规定最大灌装速度（比如NT480瓶型对应的36000bph），进行验证。
7.杀菌后PET瓶不封盖，迅速从注入机出口运输带取出，放入已杀菌的速封袋，转移至指定区域，把PET瓶做标记部分剪下，放入洗脱液中（放置洗脱液与接种样品的小盒子，必须事先用标签纸标示清楚，待用）。
8.将样品的洗脱液充分摇匀晃（接种在瓶口罗纹部分的样品需要摇晃25分钟，其余区段产品摇晃20分钟），摇匀后将样品置于超净工作台上取出，直接对洗脱液进行膜过滤，取下滤膜，放入事先准备好的TSA培养基平板（事先倾倒好无菌培养基）。
将平皿放入35-38℃培养箱，48小时后计数。
9.每个阳性对照做10-3稀释，10-4稀释，0.1*10-3稀释各一次。
阳性对照建议一共5个点，每个点5组。
注意：
a.剪下带有标记的瓶子时，每完成一个瓶子的剪切，必须使用1500ppm的PAA对双手，剪刀进行消毒。
b.由于剪切样品数量较多，建议两组人员进行操作，每组两人，一人剪瓶，一人为另一人消毒）
c.过滤时，使用100ml无菌水加入滤杯助滤.
d.以上项目由克朗斯培训，微生物品控操作，同时由克朗斯微生物工程师主导。
过程监控取样
由Krones提供取样培训、微生物品控取样，生产部协助通知取样时间、品控组长协助取样。
从S3开始至结束，工厂品控人员需依据取样频率，进行微生物取样（无菌水总出水口、无菌空气、HygieneCenter无菌空气、HygieneCenter无菌水、冲瓶无菌水、冲瓶无菌空气），取样后进行膜过滤，以总菌以及霉菌/酵母温度培养。
现场的检测和巡检项目和正常时一致。
用差值法计算每个瓶子，瓶盖所减少微生物的数量级：
R=log（C0）–log（Ct）,即:
外部表面杀菌测试可接受运行结果参考标准：
瓶子，瓶盖外部杀菌
所有瓶子，瓶盖的每个接种点的生物负载量，至少减少3log
≥1瓶子，瓶盖的接种点的生物负载量减少量小于3log
无菌线S4验证SOP
验证系统对包装材料内部表面消毒灭菌效果。
准备工作：
移液枪（1ml，0.1ml，0.01ml，推荐另配一把1-9ml）以及枪头，细菌悬浊液（枯草芽孢杆菌ATCC9372），100ml塑料圆盒150个，不锈钢托盘，锡箔纸，平皿（塑料/玻璃均可），OSA培养基，PCA培养基，吐温试剂（0.1%Tween（界面活性剂）/0.1%peptone（蛋白胨）溶液），3M胶带，扎带，针筒（1ml，10ml各一个），振荡器，超声波洗瓶器，摇床，Duran瓶或者三角瓶制备培养基以及无菌水，以及其他微生物实验室仪器耗材等。
2.接种：
10６接种：
将稀释至10８菌悬液，用移液枪取0.1ml至刚吹好的PET空瓶内/空盖内，拍打空瓶/晃动空盖，使菌悬液呈小水珠附着于瓶内壁/分布于空盖底部。
10５接种：
将稀释至10７菌悬液，用移液枪取0.1ml至刚吹好的PET空瓶内/空盖内，拍打空瓶/晃动空盖，使菌悬液呈小水珠附着于瓶内壁/分布于空盖底部。
具体数量参照ValidationProtocol，空瓶室温干燥12-24小时/空盖室温干燥2-4小时（可以事先备好生石灰做干燥剂）。
1、根据供应商所提供说明书用清洗灭菌条件的下限对无菌线设备进行一次CIP,SIP/COP,SOP，生产线运行平稳时开始进行S4试验。
2、接种PET瓶安置：
菌液干燥后，就可进行S4。
接种后PET瓶，使用塑料袋，将120个已接种的PET瓶，从接种室转移到注入间，挂上风道。
按照规定最大灌装速度（比如NT480瓶型对应的36000bph），进行验证。
杀菌后PET瓶中注入100ml无菌水后用无菌洁盖/铝箔封盖，从注入机出口运输带取出，转移至指定区域，开盖后加入对应量的无菌吐温试剂，细沙等,剧烈晃动20分钟（强烈建议使用超声波水浴，对样品进行洗脱）。
3、空盖安置：
使用托盘铝箔纸，将接种好空盖覆盖好，转移至注入间。
从下盖槽整齐排列。
建议接种盖与洗盖槽中其他盖，以颜色区别。
按照规定最大灌装速度进行验证。
杀菌后瓶盖，从盖取样口，用已杀菌之容器盛接（例如烧杯/平皿容器等），然后放入对应量的已加入无菌吐温试剂，细沙的小盒子中,剧烈晃动20分钟（强烈建议使用超声波水浴，对样品进行洗脱）。
4、记录下每个样本运行中的中断与停顿，同时也要记录下瓶，盖／铝箔的杀菌条件，冲洗条件以及其他关键的无菌系统测试运转的参数。
5、作为一个阳性对照，在当天使用的样品干燥后（干燥和当天使用后），检验在各个浓度的已接种的瓶子，瓶盖各5个，检验它们上面的生物负载量
6、作为一个阴性对照，取未接种的瓶子，瓶盖各3个，每个瓶子灌入±
100ml无菌吐温试剂，然后用无菌的铝箔或者瓶盖封口，然后将这些瓶子然后充分摇动瓶子25次，进行膜过滤对瓶中全部内容物（±
100ml）进行检验，来检验三个瓶子，盖子的总菌数。
S4验证过程中无菌流体的取样
从S4开始至结束，工厂品控人员需依据取样频率，进行微生物取样-无菌水总出水口，无菌空气，HygieneCenter无菌空气，无菌水，以及冲瓶/冲盖无菌水，无菌空气的取样，要求现场微生物QC取样，取样后进行膜过滤，以总菌以及霉菌/酵母温度培养。
内部表面杀菌测试可接受运行结果参考标准：
已接种5log细菌量的瓶子，瓶盖
已接种6log细菌量的瓶子，瓶盖
所有瓶子，瓶盖上含有<
1个单位菌体数量
杀灭每个瓶子，瓶盖上每个至少５log微生物
≥1个瓶子，瓶盖含有
≥1个瓶子，瓶盖上的
≥1单位菌体数量
被杀灭微生物量小于５log
无菌线S5验证SOP
评价注入环境和设备外表面的无菌程度
这一测试在完成CIP/SIP/COP/SOP后和LG培养基测试之前进行的，同时这一测试将在LG培养基充填后再进行一次。
已倒入TSA无菌平皿（塑料/玻璃均可）7个（2个备用），无菌涂抹棒40支，Duran瓶，或者三角瓶以制备培养基以及无菌水，以及其他微生物实验室仪器耗材等。
温度测试贴条
实验前处理及实验过程
1.试验前确认：
水处理、动力中心、灌装机、无菌水、化学中心处于正常状态。
2.灌装机、无菌水进行CIP、SIP，参数确认，用温度测试贴条对微生物实验室中的杀菌锅，SOP管路温度确认。
3.通过烟来确认无菌区域空气的流向。
4.灌装机进行碱性COP、酸性COP，SOP，参数确认
5.检测无菌区和洁净室的空气质量，在1立方米的空气里取3-5个样品。
取样器可以选用MerckMASESO或者Millipore公司生产MairT的压缩空气取样器。
选用TSA培养基培养。
6.对灌装机进行尘埃粒子计数。
7.灌装机进行SOP。
8.做S5实验，根据公司标准进行涂抹取样分析。
取样位置需包括：
灌装阀，所有除菌后的喷嘴处，及其它可疑处。
其中的一半用于分析总菌，另一半用于分析霉菌和酵母菌。
记录取样点及各取样点选取的原因。
9.灌装机进行碱性COP、SOP
空气取样点和涂抹点
空气取样点
positionofair-borne
CODE
Name（Chinese）
Name（English）
Quantity
Result
代码
名称（中文）
名称（英文）
数量
TC
M&
Y
1
封盖区
Capper
2
灌注区
Filler
3
冲瓶区
Rinser
涂抹点
SwabTestPoints
C1
浸泡前拨盖器
Capcombinerdiskbeforeimmersion
C2
盖冲洗槽
Caprinseringslot
C3
送盖星轮
Capinletstar-wheel
C4
封盖头内
Cappingheadinner
C5
封盖头外
Cappingheadexterior
2x10
C6
进盖星轮前下盖滑槽
Capchutebeforecapinletstar-wheel
C7
封盖器外围支架背侧
Therearcappingperipheralframe
F1
充填机进口星轮顶部
Fillertopinletstar-wheel
F2
充填机出口星轮底部
Fillerbottomoutletstar-wheel
F3
充填机主体轴旋转下部
Fillerbottommainrotarypart
F4
充填机主体轴旋转上部
Fillertopmainrotarypart
F5
灌注阀
Fillingvalve
4x15
A1
空气输送带
Airconveyor
R1
冲瓶机入口星轮基座
Rinserinletstar-wheelbaseframe
R2
冲瓶机出口星轮基座
Rinseroutletstar-wheelbaseframe
R3
冲瓶头
Rinserhead
5x20
R4
冲瓶机转接区顶部灯圈
Rinsertransferingtoplightinner
R5
冲瓶机转接星轮瓶夹底
Rinsertransferingstar-wheelbottleclampbottom
R6
冲瓶机转接区域COP管下部
RinsertransferingCOPpipebottom
R7
冲瓶机平台前内侧
Rinserflatinner
L1
灯圈
Lightcover
W1
墙角
cornerofwallin
对于环境测试的可接受水平
空气样品Airsamples（CFU/m3）
棉球样Swabsamples（CFU/swab）
合格
每个样品<
1CFU/m3
1CFU/1个棉签
不合格
样品≥1CFU/m3的数量≥1
样品≥1CFU/1个棉签的数量≥1
注：
离子数测试要符合100级的需要（即干燥空气每立方）：
1ft3≥0.5µ
m的微粒个数<
100个–在干燥的、静止的情况下。
无菌线S6验证SOP
用经过灭菌过的LG培养基来充填并且在正常的无菌生产条件下加盖。
所有的样品在一定时间的放置后要进行一次彻底的检查，同时LG培养基要在充填前保存72小时，被延长的产品的无菌状态需要被认可。
测试中所使用的瓶子和瓶盖要和将来生产中使用的一致。
一.可能影响影响验证的因素确认及解善
1）对吹瓶风道空气过滤器的维护，对风道内部的擦洗
2）瓶盖/空瓶检验合格
3）安排对灌注机和清洗消毒系统设备进行自查（如灌装机查漏，杀菌液浓度确认等）
4）膜包机长时间不用，要在试验开始前调试好
5）保温室（空间容量,温湿度,光照等）
二．培养基的准备（中性，PH6.5-6.8）
培养基：
LG培养基的配方（10000L）：
葡萄糖（食品级）
200kg
酵母提取物（粉状分析级）
35kg
蛋白胨（食品级）
20kg
4
硫酸铵（化学纯级）
5
磷酸二氢钾（化学纯级）
10kg
6
硫酸镁（化学纯级）
LG培养基的配制（10000L）：
1.实验前对培养基原材料以以上比例进行预调配小样，并按照比例进行添加酸碱，对pH进行测试。
而且需要事先检测培养基是否能够被污染。
2.向混合缸中注入2000L60℃的处理水。
3.将20kg蛋白胨用300L60℃的处理水预混，通过滤网加入混合缸中。
搅拌直至蛋白胨彻底溶解。
4.在搅拌器开启的情况下将其余的组分按下列次序加入：
酵母提取物35kg，葡萄糖200kg，磷酸二氢钾10kg，硫酸铵20kg，硫酸镁10kg
（注意：
酵母提取物必须采用粉状分析级的。
投料顺序按照上述顺序进行，而且必须等待前一组分完全溶解后才能加入后一个组分。
如能将这些组分分别使用小料缸预溶解后通过5u滤网加入混合缸中更好。
）
5.搅拌直至所各组分彻底溶解。
目测检查。
6.用20oC的处理水将混合缸定容至10000L。
7.至少30分钟搅拌，取样测试pH，浊度和白利度。
将LG培养基pH值调至6.5-6.8（参考添加量：
110-130g化学纯NaOH加入1吨LG培养基），谨慎起见，酸碱第一步添加量参考添加量下限的80%，然后按照实际情况，逐渐加入余下量直至pH达标为止。
8.在2小时内将培养基在137℃，30秒或相当的温度和时间灭菌。
储存于无菌缸中，否则可能会引起微生物过度繁殖，造成培养基内部浑浊。
灌注（测试中所使用的瓶子和瓶盖要和将来生产中使用的一致。
1.确认生产线各个设备都在正常无故障状态（前处理、动力中心、PET、UHT、无菌罐、氮气系统、膜包机等后工序）。
2.确认参与试验的的人员到位：
车间所有员工（溶糖、萃茶、套标除外）、维修工、微生物品控员、成品品控员、跟班品控员、SCMC工程师、克朗斯工程师、艺康工程师。
3.调配系统、灌装机、无菌水、UHT、无菌罐、氮气系统进行CIP、S
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