mTOR通路在游离SiO2粉尘诱导肺泡巨噬细胞自噬中的机制研究毕业论文Word格式.docx
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指导教师评阅书
指导教师评价：
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□优□良□中□及格□不及格
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技术线路的可行性；
设计方案的合理性
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指导教师：
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年月日
评阅教师评阅书
评阅教师评价：
一、论文（设计）质量
二、论文（设计）水平
评阅教师：
教研室（或答辩小组）及教学系意见
教研室（或答辩小组）评价：
一、答辩过程
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3、学生答辩过程中的精神状态
评定成绩：
教研室主任（或答辩小组组长）：
（签名）
教学系意见：
系主任：
摘要
目的：
通过体外培养大鼠肺泡巨噬细胞，使用mTOR抑制剂雷帕霉素抑制mTOR信号通路，游离SiO2粉尘诱导自噬，观察巨噬细胞自噬水平的差异，进一步明确在细胞水平上该信号通路在游离SiO2粉尘诱导肺泡巨噬细胞自噬活动中的机制。
方法：
选取SPF级健康雄性Wistar大鼠。
麻醉后，采用支气管肺泡灌洗法，离心获得肺泡巨噬细胞，贴壁培养纯化。
将肺泡巨噬细胞分为对照组，矽尘组，矽尘+雷帕霉素组。
运用Westernblotting测定各组mTOR蛋白以及LC3蛋白表达水平，共聚焦荧光显微镜观察巨噬细胞自噬水平。
结果：
与对照组相比，矽尘组和矽尘+雷帕霉素组的mTOR蛋白表达水平明显下降，LC3蛋白表达水平明显增加。
与矽尘组比较，矽尘+雷帕霉素组的mTOR蛋白表达明显下降，LC3蛋白表达水平明显增加。
结论：
游离SiO2粉尘可诱导肺泡巨噬细胞发生自噬，mTOR信号通路被抑制后，自噬的发生显著增加，表明mTOR通路在游离SiO2粉尘诱导肺泡巨噬细胞自噬的过程中起到抑制的作用。
关键词巨噬细胞；
自噬；
mTOR通路
Abstract
Objectives:
Byculturingratalveolarmacrophagesinvitro，UsingthemTORinhibitorsrapamycininhibitmTORsignalingpathways，FreeSiO2dustinducealveolarmacrophagesautophagy.Thenobservethedifferencesinthelevelsofmacrophageautophagy,furtherclearthemanifestationofthesignalingpathwaysonthecelllevelinfreeSiO2dustinducedalveolarmacrophagesactivity.
Methods:
SelectSPFhealthmaleWistarrats.Afteranesthesia,usingthemethodofbronchoalveolarlavage,centrifugingtogetalveolarmacrophages,adherentcultureandpurification.Thealveolarmacrophageisdividedintocontrolgroup,silicondustgroup,silicondust+rapamycingroup.UsingWestemblottingdeterminatemTORproteinandLC3proteinexpressionlevelsofeachgroup.Usingconfocalfluorescencemicroscopy
obsivethelevelofmacrophagesautophagy.
Results:
Comparedwithcontrolgroup,themTORproteinexpressionlevelofsilicondustandsilicadust+rapamycingroupdecreasedobviously,LC3proteinexpressionlevelincreasedsignificantly.Comparedwithsilicondustgroup,themTORproteinexpressionofsilicondust+rapamycingroupdecreasedobviously,LC3proteinexpressionlevelincreasedsignificantly.
Conclusions:
FreeSiO2dustcaninducealveolarmacrophagesautophagyoccurs.WhenmTORsignalingpathwayshasbeeninhibited,theoccurrenceofautophagyincreasedsignificantly,showedthatmTORpathwaymanifestsinhibitioneffectintheprocessoffreeSiO2dustinducingalveolarmacrophagesautophagy.
Keywordsmacrophages;
autophagy;
mTORsignalingpathways
目录
摘要I
AbstractII
1前言1
1.1研究背景1
1.2目的及意义1
1.2.1研究目的1
1.2.2研究意义2
2材料与方法3
2.1主要试剂3
2.2主要仪器3
2.3实验分组及处理3
2.3.1大鼠肺泡巨噬细胞收集3
2.3.2细胞染尘时间的确定4
2.3.3实验分组及处理4
2.4观察指标及检测方法4
2.4.1细胞上清液细胞因子TNF-α和TGF-βⅠ的检测4
2.4.2.WesternBlotting检测各组巨噬细胞的mTOR蛋白的表达4
2.4.3WesternBlotting检测各组肺泡巨噬细胞LC3蛋白的表达7
2.4.4免疫荧光染色方法检测各组肺泡巨噬细胞中LC3颗粒聚集情况8
2.5统计学处理8
3结果9
3.1不同染尘时间TNF-α和TGF-βⅠ的表达水平9
3.2Westernblotting测定各组巨噬细胞mTOR蛋白表达水平9
3.3Westernblotting测定各组巨噬细胞LC3蛋白表达水平10
3.4共聚焦显微镜观察各组肺泡巨噬细胞自噬水平11
4讨论12
5结论13
参考文献14
谢辞15
1前言
1.1研究背景
尘肺病是目前我国最受关注的职业病，迄今仍缺乏有效的治疗药物，究其原因，主要是其发病机制尚不清楚。
因此，研究肺纤维化的机制已成为一种迫切的需要。
研究发现自噬的功能障碍与包括器官纤维化在内的很多疾病之间存在联系，动物实验表明自噬与矽肺纤维化有着密不可分的联系。
因此，自噬的研究越来越受到重视。
细胞自噬是一种广泛存在于真核生物中的细胞程序性死亡机制，是细胞的一种自我保护机制。
当细胞自稳态发生改变或机体受外界的各种刺激的情况下自噬即被诱导，细胞借此途径清除胞内多余或损伤的细胞器及胞内成分来维持细胞内稳态[1]。
游离SiO2粉尘可诱发大鼠肺组织自噬活动，不同染尘时间自噬活动强弱亦不同[3]。
微管相关蛋白1轻链3（LC3）是重要的自噬体标志性蛋白，有I型和II型之分，未发生自噬时，细胞内合成的LC3经过加工成为胞浆可溶性I型LC3。
当自噬发生时，I型LC3经泛素样加工修饰过程，与自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺结合形成LC3-II，LC3-II结合并始终位于胞内自噬体的膜上，其含量的多少与自噬泡数量的多少成正比，因此LC3的表达强度与自噬活性密切相关[4]。
自噬的调节过程非常复杂，其中包括很多信号通路如mTOR，PI3K/AKT，Beclin1等的参与。
mTOR（哺乳动物雷帕霉素靶蛋白）是蛋白激酶家族中的一员，mTOR信号通路包括两种功能蛋白复合物，即mTOR复合物1（mTORC1）和mTOR复合物2（mTORC2）二者均参与对自噬的调节[1]。
随着对细胞自噬研究的不断深入，mTOR信号通路的作用也越来越受到重视。
有研究发现mTOR信号参与通路了心肌缺血再灌注损伤中自噬的调节。
但是在游离SiO2粉尘诱导的大鼠肺泡巨噬细胞自噬活动中，mTOR信号通路的作用尚未完全阐明[2]。
1.2目的及意义
1.2.1研究目的
通过体外培养大鼠肺泡巨噬细胞，抑制mTOR信号通路，游离SiO2粉尘诱导自噬。
进一步明确细胞水平上该信号通路在游离SiO2粉尘诱导细胞自噬活动中的机制。
1.2.2研究意义
由于实验手段的不断发展，自噬的基础研究有了很大的进展。
在人群研究和动物实验中验证了自噬活动参与尘肺纤维化反应。
随着对细胞自噬发生机制研究的不断深入，mTOR信号通路作为细胞自噬重要的信号通路也越来越受到重视。
因此研究mTOR信号通路在游离SiO2粉尘诱导肺泡巨噬细胞自噬活动中的机制不仅具有理论意义，而且也具有非常重要的应用价值。
2材料与方法
2.1主要试剂
兔抗鼠多克隆mTOR抗体美国CST公司
兔抗鼠多克隆LC3抗体美国CST公司
BCA蛋白定量试剂盒西安晶彩生物科技有限公司
RPMI1640细胞培养液 美国GIBCO公司
游离二氧化硅粉尘 美国Sigma公司
青链霉素双抗 美国MP公司
封闭液实验室现配
细胞裂解液实验室现配
1%（w/v）溴酚蓝 实验室现配
2.2主要仪器
电子天平上海精科天平公司
低速离心机科大创新股份有限公司
冷冻离心机德国Eppendorf公司
摇床（SCS-24）金坛市医疗仪器厂
恒温细胞培养箱美国ThermoScientific公司
多功能酶标仪SpectraMax®
M5美国MolecularDevices公司
电泳仪北京市六一仪器厂
转膜仪美国Bio-Rad公司
显影仪美国ProteinSimple公司
共聚焦显微镜FV500日本Olympus公司
2.3实验分组及处理
2.3.1大鼠肺泡巨噬细胞收集
（1）用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉后，股动脉放血处死。
剪开颈部皮肤,分离暴露气管。
取注射器抽取生理盐水5ml注入肺腔，按摩肺脏，再缓慢回抽灌洗液，重复灌洗5次。
（2）灌洗液1000r/min离心10分钟,弃去上清液。
（3）使用RPMI1640培养基重悬,调整细胞浓度为1.5×
106/ml。
接种于6孔板在37℃。
（4）5%CO2培养箱中培养2h后换液，用PBS冲去非贴壁细胞。
2.3.2细胞染尘时间的确定
将接种好的6孔板中加入20μl的制备好的粉尘悬液，用RPMI1640培养基补足至2ml（粉尘工作浓度50mg/l），孵育5h、10h、20h、22h分别收集细胞上清液，每个时间点做3个复孔，上清液1500转/分，10min离心，-20℃保存备用。
在分析前，冷冻样本应该缓慢的恢复至室温，轻柔混匀。
2.3.3实验分组及处理
收集肺泡巨噬细胞，方法同2.3.1。
将肺泡巨噬细胞分为对照组、矽尘组、矽尘+雷帕霉素组。
矽尘+雷帕霉素组加入10nmol/L雷帕霉素200μl，另外两组加入等量的RPMI1640培养液，培养1h。
在矽尘组和矽尘+雷帕霉素组加入游离SiO2悬液20μl，SiO2工作浓度为50mg/l，对照组加入等量培养液，培养20h。
2.4观察指标及检测方法
2.4.1细胞上清液细胞因子TNF-α和TGF-βⅠ的检测
采用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测技术，实验步骤严格按照试剂盒要求进行，检测之前将所有的试剂、样本平衡至室温。
（1）300μl洗液洗板两次，TNF-α静置浸泡15分钟，TGF-βⅠ静置浸泡15秒。
洗板完成之后注意不要让微孔板干燥。
（2）每孔50μl检测缓冲液，50μl标准品、样本，15分钟内完成。
（3）TGF-βⅠ室温孵育2h，弃掉液体，洗板6次。
必需彻底移除残留液体。
（4）TNF-α每孔50μl检测抗体，TGF-βⅠ100μl，室温孵育2h。
（5）弃掉液体，洗板6次，每孔加入100μl辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，室温孵育45分钟。
（6）弃掉液体，洗板6次，每孔加入100μl显色底物TMB，避光室温孵育30分钟后每孔加入100μl终止液，在30分钟之内置于酶标仪中450nm波长测定OD值，参考波长设定为630nm。
2.4.2WesternBlotting检测各组巨噬细胞的mTOR蛋白的表达
2.4.2.1细胞总蛋白的提取
弃去细胞培养上清液，用PBS清洗细胞两遍，再加入1ml的PBS，细胞刮刮下细胞。
在4°
C1500r/min条件下离心5分钟，吸尽上清液，细胞沉淀用于提取细胞总蛋白。
（1）裂解细胞：
在每孔提取出的细胞沉淀中加入150μl蛋白裂解液，混匀后置于冰上裂解30分钟。
（2）收集细胞总蛋白：
细胞被充分裂解后，在4°
C下12000r离心10分钟，小心吸取上清至EP管，即为细胞总蛋白。
2.4.2.2BCA法测定蛋白浓度
（1）配制BCA工作液：
以200μl/孔计算BCA工作液总量，按A液:
B液（v/v）=50:
1配制成BCA工作液，充分震荡混匀，置于冰上备用。
（2）加标准品：
取10μl蛋白标准再加入90μl的PBS稀释至l00μl，最终浓度为0.5mg/ml。
标记96孔板的标准品孔，将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加到96孔板的标准品孔中，用PBS溶液补足到20μl。
（3）加10μl蛋白样品到96孔板的样品孔中，用PBS溶液补足到20μl。
（4）各孔加入200μlBCA工作液，37°
C避光放置30分钟。
移至酶标仪中测定A562nm波长下的OD值，根据得到的标准曲线计算所需蛋白浓度。
2.4.2.3SDS-PAGE凝胶的配制
（1）清洗玻璃板，将玻璃板对齐后放入制胶器中，准备灌胶。
（2）根据mTOR蛋白的分子量大小选择浓度为6%的分离胶（表2-1）。
按照表2-2配制分离胶。
灌胶后在胶上加水液封，使胶凝的快且平整。
（3）静置30分钟，当胶充分凝固后倒去上层水并吸干。
（4）按照表2-3配制浓度5%的浓缩胶。
用浓缩胶将剩余空间灌满，然后将梳子插入浓缩胶中。
待浓缩胶凝固后，将梳子轻轻拔出。
（5）取出梳子后，用上样缓冲液充满加样孔，上样前要将样品于沸水中煮10分钟使蛋白变性。
表2-1不同浓度的SDS-PAGE分离胶的最佳分离范围
SDS-PAGE分离胶浓度
最佳分离范围
6%胶
50-250kD
8%胶
30-90kD
10%胶
20-80kD
12%胶
12-60kD
15%胶
10-40kD
表2-2不同浓度分离胶的配制（ml）
溶液成分
6%
8%
10%
12%
15%
dH20
5.3
4.6
4
3.3
2.3
30%胶液
2
2.7
5
1.5MTris（pH8.8）
2.5
10%SDS
0.1
10%APS
TEME
0.008
0.006
0.004
终体积
10
表2-35%浓缩胶的配制（ml）
5%
2.1
30%胶液
0.5
lMTris（pH6.8）
0.38
10%SDS
0.03
TEMED
0.003
2.4.2.4蛋白电泳及转膜
（1）连接电源，先在16mA条件进行电泳，等溴酚蓝染料进入分离胶时将电流调至
20mA继续电泳至溴酚蓝到达凝胶底部。
（2）拔掉电源，取出凝胶。
在胶板一端切除一角作为标记。
（3）准备滤纸和用甲醇浸泡的PVDF膜。
其大小都应与凝胶大小吻合。
（4）安装转移装置：
转膜一般采用“海绵-滤纸-凝胶-膜-滤纸-海绵”夹心法，逐张叠放，精确对齐，不留气泡。
（3）连接电源，按120V接通电流，电转移2小时。
（4）断开电源取出PVDF膜剪去一角作为标记。
2.4.2.5染色及封闭
（1）将PVDF膜浸泡于去离子水中5分钟。
（2）将PVDF膜转移到丽春红染液中，放置摇床上染色10分钟后，用去离子水冲洗PVDF膜，充分漂洗丽春红染液。
（3）将转膜后的PVDF膜浸于封闭液，放在摇床上室温条件下封闭1小时。
2.4.2.6抗体孵育
（1）将封闭的PVDF膜放入一抗中，置于摇床上孵育过夜。
（2）TBST洗一抗，每次10分钟，共3次。
（3）将PVDＦ膜放入相应二抗中，置于摇床上室温孵育1小时。
（4）TBST洗二抗，每次10分钟，共3
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