11第五章农药残留的酶与免疫测定技术.docx
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11第五章农药残留的酶与免疫测定技术
第五章农药残留的酶与免疫测定技术
随着生命科学、环境科学、新材料等科学的发展，以及生物学、信息科学、计算机技术的引入，使分析化学进入新的境界，如分析研究对象越来越多的选择了DNA、蛋白质、手性药物和环境毒物等与生命活动相关的物质；分析研究体系由简单转向复杂体系；分析研究层次已进入了单细胞、单分子水平和立体构象，分析研究方法除发展各类仪器分析手段之外，开始较多的研究酶和免疫学等生物化学方法。
农药残留分析领域的发展趋势无疑与整个分析化学的发展趋势相一致。
为适应市场的需求，满足贸易的时效，保护消费者健康的迫切要求，促进了政府和科技工作者开发农药残留快速检测方法，即使用现场快速检测方法对日益增长的大量样本进行初步筛选，然后再采用标准的方法进行测定。
近年来，随着人们对食品安全和环境质量的要求越来越高，生物测定技术以其简单、快速、灵敏、特异性强、样品量少而得到迅速发展，应用酶技术、酶联免疫技术、PCR技术、基因差异显示技术、生物传感器、基因探针、生物芯片等现代生物技术测定农药残留，已成为国内外科学工作者研究的热点。
但是目前的测定方法如酶抑制法、免疫分析法只能达到定性和半定量的水平，还无法取代常规气相色谱和高效液相色谱方法，快速检测方法还需要继续完善，使之标准化。
酶抑制分析测定法
蔬菜中的农药残留问题近年来引起了政府的关注，同时也成为舆论焦点。
但是蔬菜是种特殊的农产品，其保鲜期很短，如果采用常规的检测方法，没等检测完毕，蔬菜就已经失去了食用价值，另外这类农产品农药残留问题较多、较严重，易引发急性中毒事件，因此用于检测蔬菜、水果等有机磷、氨基甲酸酯类农药残留酶抑制分析速测技术便应运而生。
酶法概述
早在1951年，Giang与Hall应用有机磷和氨基甲酸酯农药在体外对胆碱酯酶具有抑制作用的机理，来测定其含量。
1975年Kramer与Gamson用一种与靛酚乙酸酯相似的化合物，测定1～10µg的各种有机磷酸酯化合物，与此同时Zweig等也测定了甲萘威等农药。
1968年，Mendoza等利用薄层——酶抑制技术测定10种有机磷和氨基甲酸酯农药，最小检出量可达到ng水平，并作为一种经典方法被广泛采用。
进入80年代，人们开始以来源丰富、取材和制备都十分方便的植物酶源，建立薄层一植物酯酶抑制方法，为酶抑制法的进一步推广和应用创造了条件。
近年来，酶抑制技术进入了开发速测与应用的新阶段。
美国堪萨斯一研究所（MidwestResearchInstitute,MRI）开发出一种称为农药检测器的“酶标签”（EngymeTichet），这种酶标签对乙酰胆碱酯酶（AChE）的抑制灵敏，可用于测定水中有机磷和氨基甲酸酯农药，检测限在～10mg/L。
其快速、简便，可以在田间或其他没有仪器的地方使用。
中国台湾农业试验所利用敏感的家蝇脑AChE建立生化法（即酶法）并研制出与此法相匹配的专用分光光度计，带有专用软件及打印机，用于测定蔬菜中的有机磷和氨基甲酸酯类农药，灵敏度为mg/kg级。
1987年，中国农业部环保科研所研制出农药残毒速测箱，其原理就是根据有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂对动物和昆虫的毒理作用是通过特异性抑制胆碱酯酶来实现的，近年来华南农业大学、上海昆虫研究所、上海交通大学也先后研制出简易、快速检测有机磷农药的酶片和生色基质片，灵敏度在～10mg/kg，适用于现场实测。
酶法检测原理
有机磷和氨基甲酸酯类农药，都是神经毒剂，对参与神经生理传递过程的乙酰胆碱酯酶AChE具有抑制作用，使该酶的分解作用不能正常进行，从而导致底物乙酰胆碱的积累，影响动物正常的神经传导，引起中毒或死亡。
研究工作者将这一昆虫毒理学原理应用到农药残留检测中，如果农产品样品提取液中不含有或含有很低的有机磷或氨基甲酸酯类农药，酶的活性就不被抑制，试样中加入的基质就被酶水解，或少部分水解，水解产物与加入的显色剂反应产生颜色；反之，如果试样提取液中含有一定量的有机磷或氨基甲酸酯类农药，酶的活性就被抑制，试样中加入的基质就不能被酶水解，从而不显色或颜色很浅，用分光光度计测定吸光度值，计算出抑制率，就可以判断出样品中农药残留情况。
AChE属于丝氨酸为中心的酶类，羧酸酯酶（非特异性酯酶的一种）与AChE类似，同样以丝氨酸残基作为活动中心，因此对AChE有抑制作用的有机磷和氨基甲酸酯类农药同样对羧酸酯酶有抑制作用，因此，依据其对AChE或羧酸酯酶作用的有无或大小，即可判断有机磷或氨基甲酸酯类农药的有无或含量多少。
基本检测原理可以简单概括如下：
样本加酶
酶活性被抑
酶活性正常
底物不被水解
底物被水解
加显色剂不显色
加显色剂显色
含有机磷或氨基甲酸酯类农药
不含有机磷或氨基甲酸酯类农药
近年来投向市场的产品，如酶片、酶标签、速测箱等大多是建立在上述显色反应基础上的，但是，除了有机磷和氨基甲酸酯类物质有可能对羧酸酯酶产生抑制作用外，某些氯代烟碱类似物对AChE也有一些抑制作用，因此检测过程中应该注意由此引起的假阳性现象。
酶源选择与提取
酶源选择是生物酶技术应用的基础，其性质的好坏、特异性大小、稳定与否直接关系到检测的结果。
不同种类、不同来源的酶源，对检测灵敏度的影响如表5-1、表5-2所示。
表5-1比较了乙酰胆碱酯酶和非特异性酶在检测有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂残留时的特性，表5-2则给出了不同来源非特异性酶的特性比较。
表5-1 非特异性酯酶和乙酰胆碱酯酶检测农药残留特性比较
特性项
非特异性酶
乙酰胆碱酯酶
检测特异性
酶的灵敏度
酶的来源
其它化合物的干扰
操作
低
中
广
多
简单
高
高
相对稍窄
少
简单
表5-2 常见杀虫剂对３种不同来源非特异性酯酶抑制的I50和I90（mol/L）
酶源
α－乙酸萘酯
β－乙酸萘酯
I50值数量级
I90数量级
I50数量级
I90数量级
家蝇
植物
马血清
10－7～10－2
10－7～10－3
10－17～10－2
10－5～10－2
10－5～10－1
10－6～10－2
10－6～10－3
10－6～10－3
10－15～10－2
10－3～100
10－5～10－4
10－4～10－1
在酶抑制检测的技术中，既有应用AChE的，也有应用非特异性酯酶（如羧酸酯酶）的，其来源既有动物的，也有植物的，但应用动物酶源的居多，由于方法本身对酶纯度要求并不太高，因此，一般方法提取的酶液便可满足要求。
1.家蝇或蜜蜂头的脑酯酶液
采用3日龄敏感家蝇或蜜蜂在-20℃冷冻致死后装入塑料袋中，加入少许干冰振摇，硬化了家蝇或蜜蜂的头部与胸部断裂分开，收集头部，按mL在磷酸缓冲液（pH＝，L）中匀浆30s，匀浆液（4℃）以3500rpm离心5min，取上清液经双层纱布过滤，滤液经双层滤纸在布氏漏斗上抽滤，将滤液以每管1mL分装，密封于-20℃冰箱中备用。
应用时以pH＝，L磷酸缓冲液稀释15倍。
该酶液保存3个月后未见酶活力下降。
为便于运输和贮存，提取纯化后可经冷冻干燥，制成纯度比较高、稳定性更好的酶粉。
2.动物肝酯酶液
取动物（牛、猪、兔、鼠、鸡）新鲜肝脏，去筋、膜、脂肪后切碎，取1份肝＋3份蒸馏水（W/V）匀浆，匀浆液以2000～3000rpm离心15～30min，上清液分装后在-20℃下储存备用，使用时以蒸馏水稀释，稀释倍数一般为5～20倍。
3.动物血清酯酶
将刚抽取的动物（马、鸡）血清注入无抗凝剂的试管（15～25mL）中，封口后在37℃恒温箱内放置3h。
使血液凝固，淡黄色血清慢慢渗出，用吸管将血清吸入离心管中以3000rpm离心5～10min，取上清液分装后在-20℃冷冻保存，使用时以蒸馏水稀释。
4.植物酯酶液
取市售面粉，按1∶5（W/W）比例加入蒸馏水，在振荡器上振荡30min，以3000rpm离心10min，上清液经滤纸过滤，滤液置冰箱（4℃）保存，使用时加蒸馏水稀释。
应该指出，植物酯酶和肝酯酶是应用较少的酶源，常用的是脑酯酶和血清酯酶。
底物和显色剂
酶抑制剂显色反应可使用的底物（基质）和显色剂很多，如乙酰胆碱（ACh）、乙酸萘酯以及其它羧酸酯、乙酸羟基吲哚及其衍生物均可作为酶的底物，根据酶的底物和显色机理不同，酶抑制显色反应，大致可分为以下几种类型。
1.乙酰胆碱－溴百里酚蓝显色
利用底物水解产物的酸碱性变化，并借pH指示剂显色。
乙酰胆碱＋H2O
胆碱＋乙酸
溴百里酚蓝变色范围（黄色）～（蓝色），酶作用的底板部位为有乙酸的部位pH<，呈现黄色，而被农药斑点作用的部位为无乙酸的部位，pH>，呈现蓝色。
2.乙酸－β－萘酯—固蓝B盐显色反应法
利用底物水解产物与显色剂作用完成显色反应
乙酸-β-萘酯＋H2O
β-萘酚＋乙酸
β-萘酯＋固蓝B盐→偶氮化合物（呈紫红色）
3.乙酸羟基吲哚显色法
利用底物水解产物氧化显色
乙酸羟基吲哚+H2O
吲哚酚+乙酸
吲哚酚+O2→靛蓝（呈蓝色）
4.乙酸靛酯显色法
利用发色基质水解产物显色。
乙酸靛酯+H2O
靛酚蓝（蓝色）+乙酸
实验表明，乙酰胆碱—溴百里酚蓝显色法灵敏度不高，故很少使用。
而乙酸萘酯—固蓝B盐、乙酸靛酯、吲哚乙酸酯及其衍生物为基质的羧酸酶显色法，由于灵敏度高，适用性广，酶源、基质、显色剂较容易获得，而被广泛应用。
另据报道，影响酯酶法显色的灵敏性的因素是多方面的，取决于酶源和基质的种类，以及两者适宜的配合。
不同的酶与基质的配合使用，其检测限不尽相同。
检测方法
近年来，随着日益突出的农产品，尤其是蔬菜中农药残毒问题，国内外科技工作者利用酶抑制原理，开发研究农药残毒速测技术已成为热点，其目的主要是为了减少实验室内仪器分析的工作量，在短时间内，甚至可以在现场，对大批量样品进行快速筛选，对不合格样品再进行复检，对复检仍不合格的少量样品再用气相色谱或高效液相色谱法进行分析。
1.比色法
取样
提取
抑制反应
培养
显色反应
取2g样本（非叶菜类取4g）
切碎
加入20mL提取试剂，
振荡１～２min
将上清液倒入试管中，静置3～5min，于平底小试管中加入50μL酶、3mL样本提取液、50μL显色剂
在37℃－38℃下培养30min
于待测的5只平底小试管内
分别加入50μL底物
将反应物倒入比色杯内，按顺序放入仪器的比色槽内测定。
仪器测定
我国农业部农药检定所，利用酶抑制产生的显色反应，通过分光光度计比色测定酶的抑制率，以测定有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量。
其检测流程如下：
蔬菜样品的制备通常取1g样品剪碎于试管中，加～1mL甲醇，快速振摇2min，将提取液倒入比色皿，取20μL进行测定。
AChE抑制率的测定：
在5mL尖底离心管中加的L的磷酸缓冲液，对照管加甲醇，测定管加蔬菜样本提取液，然后分别加入酶液；30℃水浴保温20min后，各加入碘化乙酰硫代胆碱液AtchI（浓度为L），继续培养15min，最后加入终止剂二硫双硝基苯甲酸DTNB-乙醇溶液，用分光光度计在412nm下测吸光度值。
空白管和对照管则以缓冲液代替酶液。
几种农药的最低检出浓度和回收率见表5-3和5-4
表5-3AChE抑制法测定几种农药的最低检出浓度
农药名称
AChE抑制率10%
AChE抑制率16%
最小检出量（μg）
最低检出浓度（mg/kg）
最小检出量（μg）
最低检出浓度（mg/kg）
敌敌畏
甲胺磷
辛硫磷
伏杀磷
水胺硫磷
抗蚜威
灭多威
克百威
涕灭威
表5-4AChE抑制法测定几种农药的回收率
农药名称
添加浓度（mg/kg）
AChE抑制率（%）
平均回收率（%）
敌敌畏
辛硫磷
甲胺磷
5
抗蚜威
呋喃丹
灭多威
根据上述的研究结果，一般当酶抑制率低于15%时，表示该蔬菜为安全或比较安全；酶抑制率16%～25%，表示该蔬菜为轻度污染，相当于农药残留量，辛硫磷为～1mg/kg，甲胺磷～kg，抗蚜威～kg；酶抑制率26%～50%时为中度污染，超过50%则为严重污染。
酶抑制法只能检测对AChE具抑制作用的有机磷和氨基甲酸酯类农药，对其它类型农药造成的污染则无法检出。
而且方法的灵敏度通常较低，如对伏杀磷、水胺硫磷、涕灭威，有时还有假阳性。
总之，该方法有一定的实用价值，但局限性较大，仅为过渡性的一个措施。
目前，商品化的农药残留快速检测仪有VIS-7220SC型，带小型打印机；UV-1201V型，带专用软件及EPSONLQ-300K打印机等。
2.酶片法
酶片即为浸渍有胆碱酯酶或其它敏感酶类的滤纸片或类似载体物质，这种简单的载体作用，可以达到便于携带和现场操作的目的。
其基本技术及原理与比色法相同，虽然使用的实验材料（如酶源、基质、显色剂等）不完全一样，但检测灵敏度却无明显差异，相比之下酶片法不需仪器，更适合于现场进行快速测定，因此更受重视。
待测水样
白色
（有农药）
酶片浸入水样中（1min）
取下酶片观察结果
取出酶片压在基质片上面（3min）
兰色
（无农药）
图5-1酶标签技术检测流程示意（美国）
淡兰色
（可疑，复检）
自1985年美国科学家发明了酶标签技术以来（图5-1），我国科学工作者也进行了大量的研究，1990年李治祥等人开发的农药残留速测箱，配备有自制的酶片、显色基质及所需全部器皿和试剂，不需贵重设备和专门技术人员，可快速检测蔬菜、水果、粮食及水中的有机磷或氨基甲酸酯类农药残留量（图5-2）。
但是该速测箱的显色基质片水溶性较差，使用时需以手挤捏促进溶解，国外报道使用的显色基质片也常存在稳定性等问题．如Nanda Kumar NV等用α—乙酸萘酯和固蓝B制备的生色基质片，稳定期只有15d。
黄雁等在实验室合成制备的生色基质片，具有较好的水溶性和稳定性，同溴水配合使用可快速检测包括甲胺磷、水胺硫磷等农药。
3.固相酶速测技术
酶片法常会遇到酶活性和灵敏性降低，测不出超标农药的现象，有时甚至还产生假阳性。
这是因水果、蔬菜的提取物中含有很多对乙酰胆碱酯酶具有抑制作用的杂质，这些杂质对乙酰胆碱酯酶的抑制作用，是通过可逆性结合来实现的，然而农药对乙酰胆碱酯酶的抑制作用是不可逆的。
因此，可通过洗涤的方法把这些没有同乙酰胆碱酯酶牢固结合的杂质去除，要达到这一目的，酶的固定化必不可少。
国际专利WO92/21779，是一项采用固定化乙酰胆碱酯酶对农药残留快速测定的新技术。
通过把乙酰胆碱酯酶固定在一种特殊的、不会和其活性部位发生反应的载体上面，不仅可以排除杂质对酶活性的影响，使灵敏度提高100倍以上，而且还增加了酶的稳定性，便于贮存。
专利的关键技术在于酶的固定和农药存在时的显色反应，乙酰胆碱酯酶通过一种蛋白质模板（如明胶、血清蛋白、血红蛋白等）作为中间体，以固定在一种特定的支持物上（如玻璃试管、小玻璃球或塑料球等），酶的固定是在与其支持物相接触的瞬间完成的。
将固定好的酶放入一容器中，该容器是一个封闭的管，酶及其支撑物可以连接在封闭试管的塞子上，以便于同被测样品的接触。
在该专利中，用于检测的显色剂是ELLMAN（Biol Pharmaco，1961，7：
88～95），对应于乙酰胆碱的二硫代双硝基苯甲酸显色，当固定化酶不具有活性时，反应是呈黄色的，如果存在对酶起抑制作用的农药，反应颜色不会发生变化。
此外，也可用一些常用的具有显色反应的显色剂。
这项技术的研究与开发，将会有广阔的市场和应用前景。
酶抑制分析测定法有关技术的问题
1.酶抑制法只适用于有机磷和氨基甲酸酯类农药的检测，其灵敏度有限，且有少部分农药品种对此法很不灵敏，因此，对检测结果为阴性的样品，不能认为就不含有农药残留或农药残留量不超过规定标准（MRL值）。
2.影响酶抑制法测定误差的因素很多，因此对测定结果为阳性或可疑的样本，必须重复检测几次，对最后确定为阳性的样本需进一步用气相色谱等仪器进行定量分析。
3.在生物体外许多农药是酶的弱抑制剂，选择使用适当的转化剂，使其转变为酶的强抑制剂，也是改善方法灵敏度的途径之一。
4.影响测定误差大小的因素很多，诸如酶和底物来源及浓度，反应温度，pH和反应时间等等，因此酶法测定的重现性不理想。
为克服多因子的影响，可考虑对实验材料、检测方法等在经比较试验的基础上，确定规范和标准。
5.由于农药的含量不同，对酶的抑制程度不同，不同农药对酶的抑制能力也有差别，因此，产生的颜色深浅程度不同，这样就可以按不同农药的不同浓度档次所形成颜色深浅度不同绘制出标准色板，可以给出农药的大致含量。
6.为了减少样品提取液中的杂质干扰，开发简便易行的净化技术，也是减少假阳性出现可选择的方法之一。
7.酶法不仅适于水、蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯农药的检测，其应用范围可以扩大到其他的农产品快速检测，还可以检查喷洒农药后，农民进入果园和农田作业是否安全等等。
由此可见，酶法是一个有实用价值和发展前途的快速检测技术。
当然，若使酶法真正成为理想的速测法，根据上述讨论的问题，还有待于进一步研究，改进与完善。
免疫检测技术
免疫分析概述
众所周知，高等动物都有免疫功能，当细菌、病毒和有害物等病原入侵时，能产生抵御外来物的抗体，这就是动物的免疫反应。
致病的外来物被称为抗原。
免疫是机体识别和排除进入体内的抗原性异物的保护性反应。
免疫反应，即抗体抗原反应，不仅发生在生物体内，在体外亦能进行，而且反应是高度特异（即对特定结构的农药选择性），高度灵敏（可达pg/kg～mg/kg水平），遵循质量作用定律。
农药残留的免疫分析方法开发过程复杂，周期较长（一般一年以上），但是一经开发成功，就表现出简单、快速、灵敏的优势（表5-5）。
整个测定反应可以在试管及微孔板上进行，在96孔板上能够同时制作标准曲线，测定对照样品和一批样品，最后用比色法定量，还可以用试剂盒装备成便携式速测箱，解决现场农药残留测定问题。
目前的农药残留免疫分析方法只能检测单一农药或结构近似的少数几种农药，不能解决农药多残留分析问题。
另外，检测样品的多样性，即背景的干扰，也限制了该方法的应用范围。
鉴于免疫分析机制的特殊性，国际上对这一领域的发展都非常重视，如美国、德国、英国等国家都先后成立了免疫分析专家组，其目的是要确立IAS作为农药残留分析手段的准则和标准。
上世纪90年代以来，国内中国农业大学、华中农业大学、浙江农业大学、吉林农业大学、农业部环保所等都先后开展了农药残留免疫分析的研究工作，并取得了一些研究成果。
农药残留免疫分析技术主要分为两大类：
其一，作为相对独立的分析方法，即免疫测定法，如放射免疫分析（RIA），酶联免疫吸附测定法（ELISA），固相免疫传感器等，其中以ELISA方法应用最为广泛；其二，将免疫分析技术与常规理化分析技术联用，如利用免疫分析的高度选择性，将其做为理化测定技术的样品净化手续，典型方式为免疫亲合色谱（IAC）。
表5-5不同方法测定除虫脲的结果
基体
测定方法
取样量（mL）
净化步骤
检测限（μg/kg）
分析样品数（个/人·天）
消耗试剂
费用比例
水
牛奶
液相色谱法
酶免疫法
气相色谱法
酶免疫法
250
20
5
不需净化
19
不需净化
10
1
50
40
5
50
50
30
90
免疫分析（immunoanalysis）是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析技术。
免疫反应涉及抗原与抗体分子间高度互补的立体化学、静电、氢键范德华力等的综合作用，因而具有任何一种单独理化分析技术难以达到的选择性和灵敏度，尤其适用于复杂基质中痕量组份的分离和检测。
抗原–抗体反应，或称免疫反应（immunoaction），其最大特点是高度选择性，抗原抗体复合物的亲和常数通常为109或更高，同时，该反应不仅发生在生物体中，而在体外也能进行．现代测试仪器快速灵敏，对于一些物质如荧光素、放射性同位素、酶等，在极微量时都可检出，因此上述两个方面的结合，建立一系列的免疫检测方法。
如荧光素标记抗原或抗体的荧光免疫法（FIA），用放射性同位素标记抗原的放射免疫法RIA，用酶标记抗原或抗体的酶免疫法（EIA）等。
这些方法选择性强，灵敏度高，简单快速，迅速发展成为现代生物化学、医学、药物化学、环境化学等研究领域的重要工具。
1959年，Yalow和Berson将放射性同位素与免疫反应相结合，建立了放射免疫测定法，开创了免疫分析这一崭新的领域，被公认为痕量分析和化学方面的重大突破。
农药免疫分析始于1968年，Centeno等人制备了抗滴滴涕和马拉硫磷抗体，应用放射免疫法测定。
随后Sernberger.L.等人先后开发出狄氏剂、艾氏剂、苯菌灵、百草枯等农药的免疫分析法。
1981年，.等研制出对硫磷及2,4–滴和2,4,5–涕的RIA分析方法，检测限可达μg/kg，为世人所瞩目。
但当时大部分农药的残留量都可以使用气相色谱法等测定，加上生物学家对人工合成抗原以及化学家对制备抗体的困难，免疫分析技术未被普遍重视。
近年来，随着新农药的开发利用和人们对环境的污染、人体健康等问题的日益关注，对农药残留分析方法的选择性和灵敏度要求越来越高，同时对分析对象的种类和样品数量的要求也在不断增加。
因此迫切要求新的分析方法。
免疫分析，尤其是特别适合农药残留分析的酶免疫分析法以其高度特异性和灵敏度在80年代得到了快速发展。
到目前为止，几乎绝大多数常用的农药已建立了酶免疫分析方法。
其中用于现场快速筛选的ELISA试剂盒已商品化。
试剂盒种类很多，不仅能用于各种食品和多种环境样品中的杀虫剂、杀菌剂、除草剂分析，而且也能检测多种环境污染物，如多氯联苯、多环芳烃，以及黄曲霉素等多种天然毒物。
为了能够在现场、家庭乃至办公室更快速的筛选样品，还开发出了一些新的方法，仅需几分钟便可获得分析结果。
如E-Z纸牌（E-Zscreen）、浸棒（dipstick）、检验纸条（teststrip）等酶免疫分析方法。
这些方法都以酶为标记物，产生的颜色容易用肉眼观察，检验程序简单、快速，是半定量的。
这些方法有的用于农药检测，有的用于有毒物质的检测，使用起来都十分的方便。
综上所述，酶免疫分析方法用于农药检测具有快速、灵敏的优越性，可以预计酶免疫分析在今后的环境样品，食品以及人畜中毒等农药的残留检测方面将会得到更广泛的应用。
应当指出的是任何一种分析方法都会有其长处和短处。
酶免疫分析由于制备抗体困难、缺乏共同的试剂以及还不适用于多残留分析等缺点，因此它只能是其它分析方法的补充，而并非是取代。
酶联免疫吸附测定法
农药残留免疫分析方法是利用抗体抗原反应与现代测试手段相结合的微量分析方法。
农药残留免疫分析应用的酶联免疫吸附测定法（ELISA，EnzymeLinkedImmuno-sorbentAssay），其原理是在测定过程中，样品提取液中的农药与已知数量的酶联剂竞争有限数量的抗体吸附位点。
为了观察测定结果，往往加入底物和显色剂，以产生颜色变化。
根据样品颜色和标准物质颜色的吸光度之差就可以计算出样品中农药的含量。
农药残留免疫分析方法的建立一般包括待测农药的选择、半抗原合成、人工抗原合成、抗体制备和样品前处理方法等几个步骤。
ELISA使用的固相载体有聚苯乙烯微量滴定板、聚苯乙烯球和醋酸纤维素膜等。
通常采用聚苯乙烯微量滴定板（40孔或98孔），预处理简单（蒸馏水冲洗，晾干后即可使用），操作方便，样品含量大，适用于大批量
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