发育过程中形态发生素梯度形成和信号转导的调控机制Word文档下载推荐.docx

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在应用基础研究方面：

Wnt、Hh、BMP、JNK、Hippo等信号通路与多种人类疾病密切相关，本项目将鉴定出这些信号通路中的未知成员，为相关疾病的诊断和治疗提供新的检测方法、治疗方案和药物靶点。

在平台建设方面：

建立一个完整而系统的形态发生素研究体系和技术平台,包括用于研究的人力资源、实验材料、实验方法和技术手段等。

该平台的建立将为研究团队高效率、高水平完成形态发生素及相关发育生物学科研任务提供良好的基础条件，增强我国在这些研究领域的国际竞争力。

在人才培养方面：

培养硕士及博士研究生100名，博士后15-20名，国家杰出青年等高级人才2-3名。

成果考核指标：

在国际一流杂志（IF>

10）发表论文12-16篇，在有影响力的杂志（IF>

5）上发表论文40-50篇。

申请5-10项发明专利。

三、研究方案

1.学术思路

形态发生素作为形态构建的组织者，对多种发育过程均起到至关重要的作用。

了解形态发生素的作用机制是深入理解图式形成和器官发生的关键。

对形态发生素的研究不仅为组织工程和器官修复提供实验依据和理论基础，同时为出生缺陷、癌症等重大疾病的预防、诊断及治疗开辟新的途径。

本项目将对形态发生素的分布及其信号转导机制开展系统性研究，利用多种模式动物（果蝇、斑马鱼、小鼠等）的研究优势，力求从遗传学、生物化学、细胞生物学及分子生物学等不同角度出发，回答形态发生素梯度形成及信号转导的关键问题。

我们将利用果蝇模式动物完善的遗传学研究系统，首先分析形态发生素梯度形成和信号转导的分子机制；

其次研究形态发生素与JNK及Hippo信号通路间的相互作用，深入理解各种信号通路如何协同调控胚胎发育和图式形成；

最后，我们利用斑马鱼研究形态发生素在脊椎动物胚胎发育中的作用，并用斑马鱼和小鼠的心血管系统为模型研究形态发生素信号通路对器官发生的作用。

总之，本项目的实施将解决形态发生素梯度形成及信号转导的一系列关键问题；

揭示发育过程中形态发生素的梯度形成及信号转导的调控机制。

这些结果不仅会对形态发生素梯度形成的基础理论做出重要贡献，而且有助于阐明相关重大疾病的发生机制，并为相关疾病的诊治奠定理论基础。

2.技术途径

本项目充分利用果蝇、斑马鱼等模式动物的优势，整合国内优秀团队，利用当前最先进的研究手段和技术，对发育过程中形态发生素的表达、分泌、梯度形成和信号转导，以及与其它重要信号通路间的相互作用进行研究，揭示形态发生素与其它重要信号间的互动机制，构建完整的信号转导网络，并阐明其在胚胎发育和人类疾病中的重要作用。

围绕项目研究内容和目的，本课题将在分子、细胞和整体动物水平上开展研究。

在研究手段上将突出系统性、动态性，同时将注重发展并使用新方法。

在分子水平的研究中，除了常规的研究方法外，将开展多标记、定量和实时的方法对基因转录、蛋白质翻译、蛋白质修饰以及蛋白质相互作用进行动态研究，如实时定量PCR、荧光素酶定量分析、蛋白质修饰位点确定、修饰位点突变、报告基因活性分析、免疫共沉淀实验等。

在细胞水平的研究中，将突出活细胞研究技术，如活细胞荧光免疫观察、活细胞内标记蛋白质的动态多维观察、活细胞囊泡运输观察等。

通过结合常规的固定细胞研究技术和活细胞研究的方法，更好地认识细胞内信号转导分子和通路在调控细胞活动中的作用。

在分子和细胞水平的机制性研究基础上，我们还将在整体动物模型上进行基因的功能分析。

利用果蝇、斑马鱼和小鼠等模型对形态发生素信号及其它相关发育信号的功能开展体内生理条件下的研究，如采用果蝇嵌合体突变技术、RNAi干涉技术、过量表达技术、可阻遏细胞标记技术（MARCMsystem）以及斑马鱼Morpholino干涉技术、转基因鱼荧光活体观察技术、小鼠基因敲除技术等。

本项目针对细胞生长调控的几个关键要点和过程设置了相应的四个研究课题，包括

（1）Wnt梯度形成和信号转导的调控机制；

（2）Hh梯度形成和信号转导的调控机制；

（3）形态发生素信号通路与JNK、Hippo信号通路的相互作用；

（4）形态发生素在脊椎动物胚胎发育和组织器官形成中的功能和作用机制。

总体技术途径如下图：

总体技术途径示意图

3、创新点与特色

科学问题：

形态发生素信号通路在正常发育和疾病发生过程中都有重要的作用，是发育生物学领域一个极为重要的研究方向。

虽然经过多年的努力，我们已经对其信号通路的主要成员和基本作用机制有了一定的了解，但对于其浓度梯度形成、信号转导和不同信号间相互作用等诸多问题还知之甚少。

本项目针对形态发生素信号通路中几个极为重要且尚待研究的科学问题，力图通过利用不同模式生物的研究优势，采用现有多种稳定有效的研究方法，并应用新的技术和研究手段来解决这些重要的科学问题。

研究内容：

本项目抓住形态发生素信号通路的几个关键要点，同时从多个重要的信号通路Wnt、Hh、TGF-β、JNK和Hippo出发，利用果蝇全基因组RNAi文库、果蝇全基因组过表达文库和蛋白质组学等多种手段，鉴定参与形态发生素信号通路的新基因，研究这些基因在形态发生素梯度形成和信号转导中的功能和机制，揭示不同信号通路之间的相互作用，进而探究形态发生素信号在正常发育和疾病发生过程中功能和作用机制，形成一个由表及里、相互关联的研究体系。

研究系统：

本项目针对形态发生素梯度形成和信号通路调控机制这一发育生物学关键问题，从分子、细胞和整体动物多个层次，利用果蝇、斑马鱼、小鼠等模型并结合哺乳动物细胞，有利于更好地鉴定参与形态发生素信号通路的新基因，分析基因在信号通路中的新功能，发现信号通路调控的新机制。

研究方法：

本项目综合运用遗传学、细胞生物学、分子生物学、生物化学、蛋白质组学和生物信息学等方面的研究思想和技术方法，系统地研究形态发生素梯度形成和信号通路调控机制。

充分利用不同模式生物的优势，结合果蝇嵌合体分析技术、过量表达分析技术、斑马鱼morpholino干涉技术和小鼠组织特异性敲除技术对形态发生素信号通路进行系统性研究。

针对基因功能和作用机制的研究，我们结合细胞活体染色观察囊泡运输、蛋白质亚细胞定位、荧光素酶定量分析、免疫共沉淀、酵母双杂交和基因定点突变等微观分析手段对形态发生素分子及其信号进行直观的、动态的、定量的分析。

研究队伍：

本项目由形态发生素研究领域资深专家林鑫华博士领衔,并汇集了在形态发生素及胚胎发育研究领域已做出优秀成绩的中青年科学家，他们在各自研究领域都有很好的研究基础和特色的科研成果。

项目整体分为4个研究课题，每个课题由7-8名研究方向一致的研究人员组成，能相互合作集中解决本课题内的关键科学问题。

4个课题之间又可以紧密联系、相互促进。

例如在课题一Wnt信号通路中发现的新分子、新机制可以用于课题二Hh信号通路的研究。

课题一和课题二的研究成果则可以作为课题三研究的基础，将有利于阐明形态发生素信号通路与其它发育信号通路之间的关系。

由于形态发生素信号通路从果蝇到哺乳动物高度保守，所以前三个课题的基础研究成果可以应用到课题四在脊椎动物模型中进行功能分析和机制研究。

研究队伍的所有成员都能够相互借鉴，互助合作，形成长期而良好的科研合作平台。

4、可行性分析

本项目抓住形态发生素信号通路的几个关键要点，同时从多个重要的信号通路Wnt、Hh、TGF-β、JNK和Hippo出发，通过多种筛选手段鉴定参与形态发生素信号通路的新基因，研究这些基因在形态发生素梯度形成和信号转导中的功能和机制，揭示不同信号通路之间的相互作用，进而探究形态发生素信号在正常发育和疾病发生过程中的功能和作用机制，形成了一个由表及里、相互关联的研究体系。

目前利用果蝇全基因组RNAi干涉文库和果蝇全基因组过表达文库系统进行的遗传筛选工作已经获得了多个参与形态发生素信号调控的新基因，初步实验结果显示这些新基因很可能有新的功能和新的作用机制，我们正力图将这些基因融合进现有的信号通路，构建一个完善的形态发生素信号调控网络图谱。

现有的实验结果已经证明我们的研究体系和研究手段切实可行。

本研究团队已经承担多项科研任务，其中包括科技部“973”项目、中国科学院创新工程项目、国家自然科学基金项目等，具有很强的科研实力，能够承担国家重大科研任务。

研究组前期的研究工作已经在形态发生素研究领域做出了突出成绩，成果发表在Cell、Nature、Science、Developmentalcell、NatureCellBiol、Development等国际一流学术期刊上。

同时各个研究组目前已经形成各具特色的研究团队，并且研究组间相互协作形成了一支技术过硬、结构合理的的整体队伍。

本项目课题负责人和主要学术骨干所在的研究组大多依托国家级重点实验室和省部级重点实验室。

其中包括有生物膜与膜生物工程国家重点实验室、中国科学院分子细胞生物学重点实验室,中国科学院系统生物学重点实验室、中国科学院干细胞重点实验室（筹）、卫生部视觉科学研究重点实验室、上海市信号转导和疾病重点实验室和浙江省眼视光学重点实验室。

各重点实验室及研究中心经过多年的积累和发展，营造了良好的科研环境、配备了较完备的大型专业仪器设备，建立了完善的实验技术和研究系统，为本项目的顺利开展奠定了基础。

此外我们还建设了多个模式生物实验平台，包括果蝇平台、斑马鱼平台、小鼠平台、果蝇显微注射平台、斑马鱼显微注射平台和小鼠胚胎显微注射平台，能够进行大规模转基因动物的构建和大规模遗传筛选。

课题组所在单位主要为中国科学院动物研究所、中国科学院上海生命科学院、南京大学、同济大学、南开大学等具有悠久历史的研究单位，在发育生物学、细胞生物学、遗传学、分子生物学、蛋白质组学、生物信息学和方面都有良好的基础。

各研究组之间可以相互借鉴、优势互补，确保本项目的顺利实施。

5、课题设置及各课题间相互关系

本项目围绕“发育过程中形态发生素梯度形成和信号转导的调控机制”这一关键科学问题，系统地研究形态发生素的梯度形成和信号转导、形态发生素和其它信号通路的相互作用以及在脊椎动物胚胎发育中的作用。

项目分为四个课题：

课题一，Wnt梯度形成和信号转导的调控机制；

课题二，Hh梯度形成和信号转导的调控机制；

课题三，形态发生素信号通路与JNK、Hippo信号通路的相互作用；

课题四，形态发生素在脊椎动物胚胎发育和组织器官形成中的功能和作用机制。

从研究的科学问题来看,前两个课题将详细阐明两个关键形态发生素Wnt和Hh的浓度梯度形成和信号传导的分子机制。

该课题的开展不仅使我们进一步完善对Wnt和Hh信号通路中各成员作用机制的认识，而且有助于我们鉴定这些信号通路中的新成员。

课题三将研究JNK和Hippo信号通路与形态发生素信号通路之间的相互作用。

课题一和课题二发现的信号通路新成员和新机制将有助于我们加深理解这些信号通路之间的相互关系，全面认识形态发生素及其相关信号通路控制组织图式形成和器官发育的客观规律，促进项目中课题三和课题四相关研究的实施。

另一方面，充分掌握JNK和Hippo信号通路与Wnt和Hh信号通路的关系，也为我们全面理解Wnt和Hh的整个信号网络提供了重要信息。

前三个课题的目标是揭示形态发生素的浓度梯度形成、信号转导以及各发育信号之间的相互作用；

课题四是以斑马鱼和小鼠为模式动物，揭示形态发生素信号通路在脊椎动物胚胎发育和器官发生中的重要作用，因此我们可以将课题一、二和三鉴定出的新成员在课题四的脊椎动物发育系统中进行功能分析。

从实验材料和技术手段共享方面来看，我们已经获得果蝇全基因组RNAi干涉文库和果蝇全基因组过表达文库，并利用这两个全基因组文库筛选到了多个参与Wnt和Hh信号通路的新基因。

下一步我们将利用这两个果蝇文库，筛选JNK和Hippo信号通路的新基因。

同时我们还利用蛋白质质谱、基因芯片等方法找到多个参与Wnt和TGF-β信号通路的新基因，我们将共享这些信息，研究这些基因是否参与其它信号通路。

综合利用以上多种实验材料和技术手段，我们可以在全基因组水平上鉴定Wnt、Hh、TGF-β、JNK和Hippo信号通路的新基因。

同时我们还将完全共享现有的果蝇品系、cDNA文库等重要的实验材料，为研究各个信号通路间相互作用提供基础保障。

本项目由形态发生素研究领域资深专家林鑫华博士主持，同时汇集了国内目前形态发生素研究方面最优秀的中青年科技人才。

本项目包含的四个课题各自独立又紧密相关，形成一个研究形态发生素作用机制和功能的完整体系。

本项目的实施不仅将阐明形态发生素浓度梯度形成和信号转导的分子机制，并且将揭示它们在发育过程中的重要功能。

课题之间的相互关系

课题一，Wnt梯度形成和信号转导的调控机制

研究目标：

本课题以Wnt/Wg信号通路为研究对象，通过遗传学、细胞生物学和生物化学等手段相结合的方法，研究Wnt/Wg蛋白从分泌、运输、分布、受体结合到信号传递等各个环节的调控机制，寻找Wnt/Wg信号通路中未知的调节因子，并揭示它们的调控机制以及在发育过程中的重要作用，从而全面地了解Wnt/Wg信号通路的分子网络及调控机制。

利用果蝇全基因组RNAi文库，转基因过表达文库及蛋白质组学，筛选并鉴定Wnt/Wg信号通路的新基因；

研究Wnt/Wg的分泌和扩散及与受体结合的分子机制；

探讨细胞质中各种调节因子如何调控β-Catenin/Armadillo的稳定性；

分析核内β-Catenin/Armadillo与TCF/Pangolin复合物如何通过其它调节因子的协同作用调控下游基因的转录；

研究Wnt/Wg信号通路中的新成员及新机制在脊椎动物中的保守性。

经费比例：

32%

承担单位：

中国科学院动物研究所、中国科学院上海生命科学研究院、温州医学院

课题负责人：

林鑫华

学术骨干：

宋海云、江晓勇、金龙金、杨勇飞、叶菊秀

课题二，Hh梯度形成和信号转导的调控机制

本课题结合遗传学、细胞生物学、生物化学及分子生物学多种手段，以果蝇为研究系统，研究形态发生素Hh梯度形成和信号转导的调控机制。

寻找参与Hh信号通路的新基因；

揭示Hh浓度梯度形成和信号转导的新机制；

阐明Hh在机体发育过程中的作用机制。

利用果蝇全基因组RNAi文库，转基因过表达文库及蛋白质组学，筛选并鉴定参与Hh信号通路调控的新基因；

研究Disp蛋白如何调控Hh蛋白分泌；

分析Dlp和Ihog影响Hh分布的调控机制；

以信号通路的关键分子Smo为靶点，研究其作用机理，分析形态发生素Hh刺激下的信号通路成员的动态变化；

研究Ci分子稳定性和活性的调节；

研究Hh信号通路中的新成员及新机制在脊椎动物中的保守性。

25%

中国科学院上海生命科学研究院、南京大学、中国科学院动物研究所

赵允

张青、吴一卉、石大伟、吴文青

课题三，形态发生素信号通路与JNK、Hippo信号通路的相互作用

本研究拟利用模式生物果蝇的遗传学优势，从分子、细胞、组织及整体水平，探讨形态发生素信号通路与JNK、Hippo信号通路间的相互作用；

寻找参与JNK、Hippo信号通路的新基因；

揭示JNK、Hippo信号转导的新机制；

构建完整的信号转导网络；

阐明其调控胚胎发育和器官发生的重要作用。

分析JNK信号通路与Wnt/Wg、Hh和BMP/Dpp信号通路之间的相互作用，及对发育的调控机制；

探索Hippo信号通路与Wnt/Wg、Hh和BMP/Dpp信号通路之间的相互作用，及对发育的调控机制；

研究JNK信号通路与Hippo信号通路间的相互作用，及对发育的调控机制；

筛选JNK和Hippo信号通路中的新成员，分析其与Wnt/Wg、Hh和BMP/Dpp通路中各成员的交互关系，构建完整信号转导网络。

18%

同济大学、南开大学

薛雷

吴世安、赵素然、张欣文、王兰芳

课题四，形态发生素在脊椎动物胚胎发育和组织器官形成中的功能和作用机制

研究形态发生素在脊椎动物胚胎发育和器官发生中的功能和作用机制；

了解形态发生素信号通路及靶基因在细胞增殖、分化和凋亡等细胞命运中的作用；

揭示形态发生素在胚胎发育和器官发生中的重要作用；

探讨形态发生素信号通路与其它信号通路的相互联系，共同调控脊椎动物胚胎发育、血液和心脏发育的分子机制。

应用模式动物斑马鱼阐明形态发生素Nodal信号通路在胚胎发育中的功能；

鉴定Smad2直接调控的靶基因，并进一步探讨Smad2通过其靶基因调控胚胎发育的分子机制；

分离鉴定Smad2相互作用蛋白，从而了解Smad2的活性与功能的调控机制及在发育中的意义；

应用斑马鱼模式动物揭示BMP和FGF在血液和心血管发育中的作用机制；

揭示BMP、Wnt、Hh和FGF等信号通路之间相互关联对造血干细胞维持、形态发生以及细胞命运的调控作用；

应用小鼠模式动物阐明形态发生素信号通路Wnt、BMP和FGF信号与Akt和Hippo信号通路之间的相互关系，以及在心脏发育中的调控机制。

南京大学、中国科学院动物研究所

杨中州

刘峰、王强、常在、马东媛

四、年度计划

研究内容

预期目标

第

一

年

1、运用全基因组RNAi文库，转基因过表达文库，染色体缺失片断库、突变体库、P因子插入文库、进行体内全基因组大规模遗传筛选，鉴定参与Wnt，Hh，JNK,Hippo信号通路的新基因。

2、利用基于质谱的蛋白质组学研究它们在Wnt和Hh信号通路中调控的新基因和靶蛋白，以及已知基因的新的修饰方式。

3、研究Dlp对Wnt和Hh分布的调控机制。

4、研究Retromer对Wnt分泌的调控机制；

研究Disp对Hh分泌的调控机制。

5、研究三个蛋白激酶Nek2、Smi35A和Lic在体内和体外对Wnt通路以及其它通路产生的影响；

研究Smo分子调控Hh信号传递的相关机制。

6、完成斑马鱼发育早期ChIP-on-chip检测，并建立合适的生物信息学分析方法，分析出Smad2靶基因及其结合序列，并用ChIP进行验证；

分析Smad2结合序列对靶基因转录的调控作用。

建立以斑马鱼为主体的心血管发育研究技术平台，

7、制作第二心场剔除PTEN小鼠，心脏特异剔除Wntless小鼠，和在心脏祖细胞（Mesp1阳性细胞）中特异剔除β-Catenin。

利用细胞培养分析Wnt/β-Catenin对Mesp1表达的调控。

1、筛选并鉴定5-10个Wnt信号通路相关、5-10个Hh信号通路相关、5-10个对Hippo信号通路相关和10-20个对JNK信号通路的新基因，并初步分析其体内功能。

2、对已知在Wnt和Hh信号通路中起重要作用的关键调控因子如-Catenin、Dishevelled、Pygopus、Fu、Cos2和Su（fu）等蛋白的特异性修饰（磷酸化、乙酰化和甲基化修饰）进行鉴定；

并找到5-10个有可能影响这些蛋白功能的未知调控因子。

3、找到并鉴定Dlp与Wnt和Hh结合并调节它们分布的关键结构域。

4、揭示Retromer对Wnt分泌的调控机制。

找到与Retromer对Wnt分泌调控相关的SNX分子；

找到并鉴定Disp与Hh结合并调节Hh分泌的关键结构域。

5、确定Nek2、Smi35A和Lic对Wnt信号通路的特异性调控；

阐明Smo分子经过Cos2/Fu复合体传递Hh信号的机制。

6、建立以斑马鱼为主体的脊椎动物器官发育研究技术平台；

完善以斑马鱼胚胎为实验材料的ChIP-on-chip实验体系。

7、获得心脏特异剔除PTEN，Wntless，β-Catenin小鼠；

并初步分析它们的发育表型；

建立Mesp1基因表达检测的体系。

二

1、对在遗传筛选中发现的与Wnt,Hh,JNK,Hippo信号通路相关新基因进行进一步的功能研究。

2、分析Wg、Hh和Dpp信号通路与JNK和Hippo信号通路在体内的遗传相互作用；

分析JNK和Hippo信号通路相互作用。

3、利用基于质谱的蛋白质组学方法和生物化学手段进一步鉴定Wnt,Hh,JNK,Hippo信号通路新的调控因子和新的蛋白修饰方式。

4、进一步深入研究Wnt和Hh分泌的调控机制。

5、研究Dlp和Ihog作为协同受体，在Hh信号通路中发挥作用。

分析这两个蛋白是否协同调控Hh在细胞顶层和基底外侧的不对称分布。

6、结合生物化学和遗传学手段，寻找三个蛋白激酶在Wnt通路中的调控对象；

研究Elp3和Coop在体内调控Wnt信号通路的机理。

7、深入研究Cos2/Fu复合体通过Smo分子传递Hh浓度梯度的机制；

研究Smo分子是否在高浓度Hh诱导下形成多聚体。

8、确认Smad2与靶基因的Smad2结合序列的结合；

体外报告基因分析验证Smad2结合序列对靶基因转录的调控作用；

9、研究BMP和FGF信号能否调节造血干细胞的产生、维持和分化。

10、利用心脏特异剔除小鼠初步分析PTEN-Ak信号通路与Wnt信号通路之间的相互作用；

初步分析Wntless调控心脏发育的机制；

初步分析Wnt/β-Catenin对Mesp1表达的调控的机制；

制作新的参与Wnt/β-Catenin,Hh,BMP及FGF形态素调控基因的剔除小鼠。

1、初步鉴定Wnt,Hh,JNK，Hippo信号通路新基因的生理功能。

并对其中2-3个新基因的作用机理进行深入研究，确定其在信号通路中的作用机制，整理实验数据，发表相关论文。

2、确定Wg、Hh和Dpp信号通路与JNK和Hippo信号通路的相互作用；

确定JNK和Hippo信号通路的相互作用。

3、确定新发现的蛋白修饰方式在细胞水平上对Wnt,Hh,JNK和Hippo信号通路调控功能和生物学意义。

4、揭示Disp对Hh分泌的调控机制，并整理实验数据，发表相关论文；

阐明泛素化Wls蛋白的性质特征并确定Wls泛素化修饰位点，运用细胞生物学方法观察泛素化修饰的Wls在细胞表面分布状况。

5、揭示Dlp分子与Ihog的协同作用及协