牛源无乳链球菌sip基因编码抗原表位序列的原核表达及其初步应用研究(1)Word文档格式.docx
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ApplicationofCodingRegionGeneofSipEpitopeof
StreptococcusagalactiaeFromBovine
Abstract
Objectivlbconstructprokaryoticexpressionvectorofsipgene,expressitinEscherichiacoliBL21,andstudytheimmunocompetenceandapplication.
MethodsGenomicDNAwasextractedfromstreptococcusagalactiae,epitopesites,hydrophilicityandantigenicindexparameterswerepredictedbyDNAStarProteanprogramaccordingtotherelevantnucleotidesequencefromGenBank^andapairofspecificprimerswasdesignedtoamplifytheepitopeofsipgenebyPCR.Thefragmentwasclonedintothemultiplecloningsite（MCS）ofpET»
30（a）,fbnningtherecombinantprokaryoticexpressionvector（sip-pET）.Therecombinantplasmidsip-pETwastransformedintoE.coliBL21（DE3）bycommonmethodandtheBL21（DE3）/pETwasinducedbyIsopropyl-p-D-thioglactoside（IPIG）toexpressfusionprotein,optimizetheexpressioncondition.ThentheexpressedproteinsinE.coliBL21（DE3）wereanalyzedwithSDS-PAGEelectrophoresis.WesternblottingwasperformedtoidentifytheImmuneactivefusionprotein.Therecombinantproteinwaspurifiedwithimmobilizednickeionaffinitychromatography,andanindirectenzymelinkedimmunosorbentassaywasdeveloped.Takingthismethodtotesttheserumtitersofvaccinatedrabbitswhichwereimmunizedwithimmunepharmaceuticsofstreptococcusagalactiae.
ResultsTherecombinantplasmid（sip-pET）wasobtainedanditsopeningreadfram^ORF）wasverifiedbysequenceanalysis.TheresultsofSDS-PAGEshowedthattherewasanovalproteinband,whichwas40KD.Westemblottingassayprovedthatthefusionproteincouldbespecificallyrecognizedbyanti-Str.agalactiaeantibody.ThedensityofSipproteinwas5.09mg/mlafterpurification,theantibodyvalenceofstreptococcusagalactiaewere1:
3200whentestedbyindirectenzymelinkedimmunosorbentassay,Specificantibodycouldbedetectedin70daysafterinjectionimmunization.
ConclusionsTheseresultsshowedthatcodingregiongeneofsipepitopeofstreptococcusagalactiaefrombovinewassuccessfullycloned,thesequencewascomposedof897nucleotidesencodingapolypetideof299aminoacids,prokaryoticexpressionvectorwasefficientlyexpressedinE.coliBL21（DE3）andanindirectenzymelinkedimmunosorbentassayfordetectionofBovineMastitisStreptococcusagalactiaewasdeveloped.Thepreviousworkhasnotonlyrolloutabasisforthestudiesofantigenicityidentificationoftherecombinantprotein,butalsolaidanecessaryfoundationforfutureresearchonpossibleImmuneeffectofstreptococcusagalactiaeinthefuture.
Keywords:
BovinesourceStreptococcusagalactiae;
sipgene;
Prokaryoticexpression:
Purification;
Indirectenzymelinkedimmunosorbentassay
Directedby:
prof.BuRie（Ph.D）
AppIicantforMasterdegree：
LANGJingmin（preventiveveterinaryScience）
（CollegeofAnimalScienceandTechnology,!
nnerMongoliaUniversityfbrNationalities,Tongliao028043,China）
英文缩写词表
英文缩写
英文名称
中文名称
4«
CN
4-Chloro1-naphthol
四氯奈酚
A492
Absorptionvalueat492nm
492纳米处的吸光值
Amp
Ampicillin
氨千青霉素
APS
Ammoniumpersulfate
过硫酸铉
bp
Basepair
碱基对
CP
Caspsularpolysaccharide
荚膜多糖
CSF
Colony-stimulatingfactor
集落刺激因子
DNA
deoxyribosenucleicacid
脱氧核糖核酸
dNTP
Deoxynucleosidetriphosphate
脱氧核吾三磷酸
DTT
Dithiothreitol
_硫苏糖醇
E.coli
Escherichiacoli
大肠杆菌
E.coliBL2I
EscherichiacoliBL21
基因「•程表达菌
E.coliJM109
EscherichiacoliJM109
基因1程克隆菌
EB
EthidiumBromide
漠化乙锭
ED1A
ethylenediaminetetraaceticacid
乙一胺四乙酸
ELISA
Enzyme-linkedimmunosorbentassay
酶联免疫吸附实验
EP
Eppendorf
离心管
FCA
Freundcompleteadjuvant
福氏完全佐剂
FIA
Freundincompleteadjuvant
福氏不完全佐剂
Genebank
核吾酸序列数据库
h
Hour
小时
HRP
Horseradishperoxidase
辣根过氧化物酶
IF
Interferon
干扰素
Ig
Immunoglobulin
免疫球蛋白
IL
Interleukin
白细胞介素
IPTG
isopropylthio-p-D-thiogalactoside
异丙基■硫代半乳糖昔
Kan
kanamycin
卡那霉素
KD
kilodalton
千道尔顿
L
Liter
升
LB
Luria-Benrtanimedium
LB培养基
LF
Lactoferrin
乳铁蛋白
LFb
LactoferricinB
乳铁素
M
Moleperliter
摩尔/每升
mg
Milligram
毫克
min
Minute
分钟
ml
MilHliter
基升
mM
Miilimolperliter
毫摩尔/升
MO
Macrophage
巨噬细胞
OPD
O-phenylenediamine
联苯二胺
PAGE
Polyacrylamidegelelectrophoresis
聚丙烯欧胺凝胶电泳
PBS
Phosphatebuffer
磷酸盐缓冲液
PCR
PolyeraseChainReaction
聚合酶链式反应
PH
pHvalue
pH值
PMN
Polymorphonuclerneutrophils
多形核嗜中性粒细胞
rjxn
Rotateperminute
每分钟转数
S.aureus
Staphylococcusaureus
金黄色商萄球菌
see
Somaticcellcounts
体细胞数
SD
Standarddeviation
标准荒
SDS
Sodiumdodecylsulfate
十一烷基磺酸钠
Sec
Second
秒
SIP
Surfaceimmunogenicprotein
表面免疫相关蛋白，
Str.agalactiae
Streptococcusagalactiae
无乳链球菌
Str.dysgacactiae
金黄色葡笥球菌
Streptococcusdysgacactiae
停乳链球菌
Str.uberis
Streptococcusuberis
乳房链球茜
TAE
Tris.cl-acetate-EDTAbuffer
Tris缓冲液
Taq
Deoxyribonucleicacidpolymerase
TaqDNA聚合酶
TE
Tris.cl-EDTAbufifer
TE缓冲液
TEMED
Tetramethylethylenediaine
四甲基乙二胺
Tris
HydroxymethyUaminomethane
三羟甲基氨基甲烷
WB
Westernblot
免疫印迹试验
JXl
Microliter
微升
内蒙古民族大学硕士学位论文作者声明
本人声明：
本人呈交的学位论文是本人在导师指导下取得的研究成果。
对前人及其他人员对本论文的启发和贡献已在论文中做出了明确的声明，并表示了感谢。
论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人已经发表或撰写的研究成果。
本人同意内蒙古民族大学保留并向国家有关部门或资料库送交学位论文或电子版，允许论文被查阅和借阅。
本人授权内蒙古民族大学可以将本人学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。
作者签名：
时晶日期：
年/月/7日
1引言
牛乳腺炎（Bovinemastitis,BM）是指乳腺因受到致病性微生物侵袭所发生的一种炎性变化，致使乳腺组织发生病理变化，导致产奶量下降，也是乳及乳制品中有害病原的主要来源，给世界奶牛业及食品业造成了巨大的经济损失，目前尚无有效的防控措施。
全球2.2亿头奶牛中约有1/3的奶牛患有各型乳腺炎.国内报道牛乳腺炎发病率为46.4%〜85.7%,其中临床型占4.9%,隐性型占47.2%%主要病原有葡萄球菌、链球菌和肠杆菌3类，葡萄球菌占37.29%,链球菌占38.98%,肠杆菌占23.73%叫在包括内蒙古地区在内的北方地区由于寒冷及干燥对牛乳头的刺激，乳腺炎发病率更高一些叫近年来由链球菌引起的奶牛乳腺炎发生系呈增长趋势“•*无乳链球菌是引起牛乳腺炎的优势性病原微生物“ 该菌具有高度传染性，不仅是奶牛乳腺炎的主
要致病菌之一，也是女性生殖道和新生儿受感染的重要致病菌％具有重要的公共卫生意义。
随着人们生活水平的提高，乳制品逐渐成为民众每日必需的营养品之一，其需求量与H俱增，因此乳及其制品的安全问题是近年来广大民众最为关注的敏感民生问题之一叫2008年的“三聚系胺事件”触发了中国乳业的深度改革，确保乳品质量安全显的尤为重要。
由于初乳含有优良的生物活性蛋白而倍受人们的青睐，但是通过检验也发现部分初乳中也存在无乳链球菌污染，这对人类和犊牛健康构成严重威胁质。
如果在牛奶的加工过程中灭菌不严格，就会对人们的身体健康造成很大的危害。
因此该种疾病己经引起全球乳品行业和公共卫生行业的高度关注。
多年来，尽管各国研究人员对该疾病的预防与治疗的研究付出了极大的努力，但至今未能提出一个理想的解决办法.
目前对该疾病主要采取抗生素治疗为主，但是由于抗生素的残留和耐药菌株的出现，造成了牛乳品质的下降和治疗难度的加大，所以为了保证奶牛业的健康、快速发展，迫切需要研究和建立一种安全、新型、高效的预防与检测方法“气国内外相关专家正致力于乳腺炎免疫制剂研究与开发，利用疫苗来控制乳腺炎其优点是无药物残留、降低乳腺感染的严重程度、控制隐性乳腺炎的发生，而且操作简便，防疫费用低廉，因此疫苗免疫是预防与防制奶牛乳腺炎的发展方向。
1.1奶牛乳腺炎的危害
在世界各国奶牛业中，奶牛乳腺炎是奶牛三大疫病之一，被公认为是造成奶牛业损失最大的一种疾病，也是一种严重的人畜共患病。
奶牛乳腺炎不仅对奶牛乳腺组织造成损伤，严重影响奶牛的使用年限，而且还使产奶量降低，使牛奶的品质和营养价值受到影响；
另外乳汁病原菌及其毒素污染等严重影响乳品质量，给乳品工业带来巨大损失，并影响到公共卫生，危害人类健康。
由于乳腺炎引起产奶量的降低，使大量处于产奶高峰期的奶牛被淘汰，对奶牛业造成了巨大的经济损失•2003年前，全世界约有奶牛2.2亿头，其中约有1/3的奶牛患有各种类型乳腺炎，每年因乳腺炎造成的损失高达350亿美元。
据报道，我国的发病率高达70%〜80%,每年损失达30亿元.美国每头母牛每年因乳腺炎而引起的花费为182美元，丹麦因乳腺炎引起的损失则为每头每年225美元，加拿大为140-300美元，世界范内每年因奶牛乳腺炎造成的奶产量损失为380万吨皿•«
・
乳腺炎乳中含有大量的体细胞和抗生素，使鲜乳受到一定程度的污染，严重影响了乳制品的质量和风味.另外，牛奶含有较多的使牛奶产生酸味的游离脂肪酸，它抑制了用于制作发酵乳制品的乳酸菌的培养，而乳蛋白含量的减少和pH值升高都将导致奶酪产量的降低g.对牛奶的加工，目标始终是既要最大限度地保存天然牛奶的营养成分和风味，又要最有效地消除和预防不安全因素的影响。
牛乳中的无乳链球菌及代谢物等异物并不能通过常规温度消毒法将其消除的"
f,人类可通过食入被污染的奶制品而被感染，可见乳腺炎乳汁中的有害病菌既能引起乳房炎，又能使人患病.2008年2月2日中山大学附属东华医院报道了由无乳链球菌引起的四例新生儿败血症；
2009年3月13日医学经济报报道了1例无乳链球菌引起的新生儿败血症；
北京儿童医院新生儿病房在肺炎、败血症、脑膜炎等患儿105例中，确定无乳链球菌感染27例，占25.9%.美国、英国、芬兰等国家的无乳链球菌感染为新生儿感染的首位，发生率分别高达61%、28%、30%,病死率达20%〜50%；
申阿东等报道由无乳链球菌引起的新生儿肺炎占25.71%"
”.可见奶牛乳腺炎造成的损失之大，严重影响了正蓬勃发展的奶牛业。
1.2奶牛乳腺炎的病因及主要病原
奶牛乳腺炎是一种多因素疾病。
除了遗传因素、饲养管理、病原微生物与环境之间相互影响外，其复杂性还表现在病原的多样性，可由多种非特定的病原微生物引起，且不同地区各种病原微生物表现出明显的生物学特征。
林锋强““（2002）报道引起奶牛乳腺炎的致病微生物为150多种，包括细菌、真菌、病毒及霉形体等，其中以细菌最为常见。
在感染的细菌中主要以金黄色葡萄球菌（Sfop/iy奴?
occusaureus）＞链球菌（Streptococcus）^埃希大肠杆菌（E.co。
）为主，约占整个奶牛乳腺炎病例90%以上叫葡萄球菌包括金黄色航萄球菌｛Str.arueus）＞凝固酶阴性葡萄球菌（Coagu如enegativestaphylococcus）和表皮葡萄球菌（Staphylococcusepidermidis）,链球菌包括无乳链球菌（Str.agalactiae）、停乳链球菌（Str.dysgalactiae）和乳房链球菌（Str.uberis）等tB,.引起奶牛乳腺炎的微生物还有兽疫链球菌、粪链球菌、化脓链球菌、空肠变形杆菌、嗜血昏睡杆菌、肺炎链球菌、化脓棒状杆菌、溃疡棒状杆菌、克雷伯氏杆菌、产气肠杆菌、牛分枝杆菌、乳分枝杆菌、意外分枝杆菌、蜡样芽抱杆菌、多杀性巴氏杆菌、溶血性巴氏杆菌、绿脓假单胞杆菌、类杆菌、牛霉形体、加拿大支原体、巴西诺卡霉菌等，厌氧菌有呼噪消化球菌、黑素类杆菌和产芽抱梭状芽抱杆菌等，真菌有毛抱子菌、烟曲霉、酵母菌等回。
赵香汝皿等对张家口地区254份患临床乳腺炎乳汁中分离病原菌,调查结果显示，葡萄球菌类占分离菌株的36.2%,链球菌类占分离菌株的32.3%,肠杆菌科占分离菌株的283%.易本驰•对信阳地区的调查显示隐性乳腺炎发病率为51.81%,其中葡萄球菌占35.63%,链球菌占14.94%,革兰氏阴性杆菌占49.43%；
张信军g等从扬州某奶牛场乳样中分离到13个菌株，其中有10株为链球菌，2株为金黄色葡萄球菌，1株为大肠杆菌；
杨慧萍等g报道，从重庆地区患隐性乳腺炎分离病原菌以葡萄球菌和链球菌为主，占检出细菌总数的94.6%.不同报道显示隐性乳腺炎的主要病原微生物有一定差异，但主要病原菌是金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、埃希大肠杆菌为主。
在根据国际奶牛联合会统计，在临床型和亚临床型乳腺炎病例中，链球菌检出率可高达50%“％链球菌属与乳腺炎有关的主要是无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌向。
链球菌为圆形或卵圆形细胞，常排列成链状，致病菌的链通常比较长.被链球菌感染后，多数病例无临床症状或症状不明显，大多慢性经过，愈后可导致乳腺萎缩和间质增生。
据国内牛病专家对我国北方高寒地区及山东省的奶牛乳腺炎病原调查结果显示，端性乳腺炎的发生率为最高（47.2%）,而且以无乳链球菌为主，更为严重的是母犊牛也常发生乳腺炎。
马保臣等s分离的36株链球菌中有26株为无乳链球菌。
无乳链球菌是高度接触性传染的专性乳腺寄生菌，其危害比较大，只要感染机体，就会形成传染源，即使感染牛本身不发病，也会传染给其它牛而导致疾病的发生；
该菌可导致隐性乳腺炎，特点是潜伏期可达数周或数月，不易被发现，可通过挤奶人员或消毒不严的挤奶杯传染；
虽然该菌不象金黄色葡萄球菌那样侵入乳腺组织引起纤维化和脓肿，却可以定植于上皮表面，引发亚临床乳腺炎，若该菌与其他菌共同感染乳腺，将有明显的急性乳腺炎症状，引起奶产量的急剧下降，并引起乳质量的下降。
国外学者通过多位点序列分型研究（Bisharat等皿）和脉冲场凝胶电泳（PFGE）图谱分析方法（Oliveira等s研究得出牛源及人源无乳链球菌之间存在紧密的相关性的结论，为无乳链球菌在牛与人类之间实现共感染提出了基因层面的科学依据。
乳房链球菌、停乳链球菌引起的乳腺炎大多通过乳腺或乳头的损伤和挤奶人员的手传播而引起，传染性较小，属于环境性致病菌。
金黄色葡萄球菌（Stap加/ococcusaureus）也是引起奶牛乳腺炎的主要病原菌之一。
金黄色葡萄球菌广泛地分布于自然界，空气、饲料、饮水、地面、物体表面、人及
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