《生物工程专业分析》新实验指导书解析Word格式.docx
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（1）50ml碱式滴定管
（2）50ml移液管
（3）250ml三角瓶
（4）50ml量杯
六、实验步骤
准确吸取50ml白酒样品，置入250ml三角瓶中，加50ml水和2滴酚酞指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠溶液滴定至微红色。
记录滴定体积。
同时做空白试验。
七：
计算：
总酸（以乙酸计g/100ml）=［（V－V0）×
C］×
0.06006×
100/50
式中：
V――滴定样品时消耗氢氧化钠溶液的量ml
V0――滴定空白时消耗氢氧化钠溶液的量ml
C――氢氧化钠溶液摩尔浓度mol/L
0.06006――每毫升氢氧化钠相当于乙酸的毫克数
50――吸取白酒样品体积ml
八、实验报告
实验预习、实验记录和实验报告具体要求详见附件一和附件二。
实验二：
白酒中总酯含量测定
1、掌握酸碱滴定法测定白酒中总脂的原理及方法
白酒中的总脂的测定是先用碱中和游离酸，再加一定量的碱使酯皂化，过量的碱用酸滴定。
先用碱中和白酒中的游离酸，再加一定量的碱使酯皂化，过量的碱用酸滴定。
1．试剂:
（3）0.1mol/L盐酸溶液
2．仪器;
（2）50ml酸式滴定管
（3）50ml移液管
（4）250ml三角瓶
（5）50ml量杯
准确吸取50ml白酒样品，置入250ml三角瓶中，加50ml水和2滴酚酞指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠溶液滴定至微红色（不可过量）。
再准确加入25.0ml0.1mol/L氢氧化钠溶液，放置过夜皂化（或接上回流冷凝器，于沸水浴中回流皂化半小时），用0.1mol/L盐酸溶液滴定至红色刚刚消失。
记录盐酸溶液用量体积。
七、计算：
总酯（以乙酸乙酯计g/100ml）=（C1V1－C2V2）×
0.08812×
V1――氢氧化钠溶液的量ml
V2――滴定样品时消耗盐酸溶液的量ml
C1――氢氧化钠溶液摩尔浓度mol/L
C2――盐酸溶液摩尔浓度mol/L
0.08812――每毫升盐酸相当于乙酸乙酯的毫克数
八、思考题：
第一次用氢氧化钠滴定的目的是什么？
九、实验报告
实验三：
粗脂肪含量测定
6学时
1、了解索氏抽提器的构造
2、掌握索氏抽提法测定样品中粗脂肪的原理及方法
样品用无水乙醚或石油醚等溶剂抽提出，蒸出溶剂所得的物质，称为粗脂肪。
本法为重量法，用脂肪溶剂将脂肪提出后进行称量，该法适用于固体和液体样品。
通常将样品浸于脂肪溶剂，为乙醚或沸点30℃至60℃的石油醚，借助于索氏提取器进行循环抽提。
用本法提取的脂肪性物质为脂肪类物质的混合物，其中含有脂肪、游离脂肪酸、磷脂、酯、固醇、芳香油及某些色素等。
因此，称为粗脂肪。
1．试剂:
（1）无水乙醚或石油醚（沸程30℃至60℃）
2：
仪器：
（1）索氏提取器
（2）恒温水浴锅
（3）烘箱
（4）脱脂棉花
（5）滤纸
（6）分析天平
1：
样品预处理：
称取样品的重量根据材料中脂肪的含量而定,通常脂肪含量在10％以下的，称取样品10-12克；
脂肪含量为50-60％的，则称取样品2-4克，（可以用测定水分后的样品）。
将样品在80-100℃烘箱去水分。
一般烘4小时，烘干时要避免过热。
冷却后，准确地称取一定量样品，必要时，拌以精制海砂，无损地移入滤纸筒内，用脱脂棉塞严，将滤纸筒放人索氏提取器的提取管内，注意勿使滤纸筒高于提取管的虹吸部分。
抽取：
将洗净的提取瓶在105℃烘箱内烘干至恒重,加乙醚约达到提取瓶容积的1/2～2/3，然后将提取器各部分连接，注意不能漏气。
加热提取时，应在电热恒温水浴中进行（水浴温度约为40-50℃），严禁用火焰直接加热索氏提取器。
在加热时乙醚蒸发，乙醚蒸汽由连接管上升至冷凝器，凝结成液体滴入提取管中，此时样品内的脂肪为乙醚液面超过虹吸管高度后溶有脂肪的乙醚虹吸管流入提取瓶，循环抽提，调解水浴温度，使乙醚每小时循环3－5次，抽提时间视样品的性质而定，一般需6－12小时，样品含有脂肪是否提取完全，可以用滤纸来粗略判断，从提取管内吸取少量的乙醚并滴在净的滤纸上，待乙醚干后，滤纸上不留有油脂的半点则表示已经提取完全。
提取完全后，再将乙醚蒸到提取管内，待乙醚液面达到虹吸管的最高处以前，取下提取管。
3：
称重和计算：
将提取瓶中的乙醚全部蒸干，洗净外壁，置于105℃烘箱干燥至恒重，按下式计算样品的粗脂肪百分含量。
粗脂肪含量（%）=（m2-m1）×
100/m
式中：
m—称取试样质量（g）
m1—抽提瓶质量（g）
m2—抽提瓶与粗脂肪质量（g）
讨论
（1）乙醚易燃（BP：
34.6℃），在抽提、蒸发或蒸馏回收时，切忌明火加热。
（2）试样需干燥，否则有机溶液不易渗透，使结果偏低。
试样粉碎度以过40目筛为宜。
颗粒大太试样，脂肪不易抽提完全，颗粒太小试样，易透过滤纸筒，使抽提物增重。
（3）有机溶剂应无水，否则试样中碳水化合物及无机物易被抽提，使结果偏高。
（4）脂肪含量较低的试样，由于抽提质量与粗脂肪质量差太大，测定结果误差较大。
此时可以采用称重抽滤前后试样滤纸筒，求得粗脂肪含量（抽提前后的试样滤纸筒，都应于（105±
2）℃烘干后称重）。
（5）放入滤纸筒的高度不能超过回流弯管，否则乙醚不易穿透样品，脂肪不能全部提出，造成误差。
（6）碰到含多量糖及糊精的样品，要先以冷水处理，等其干燥后联同滤纸一起放入提取器内。
（7）提取时水浴温度不能过高，一般使乙醚刚开始沸腾即可（约45℃左右）。
回流速度以每8-12次／时为宜。
（8）冷凝管上端最好连接一个氯化钙干燥管，这样不仅可以防止空气中水分进入，而且还可以避免乙醚挥发在空气中，这样可防止实验室微小环境空气的污染。
如无此装置，塞一团干脱脂棉球亦可。
（9）如果没有无水乙醚可以自己制备，制备方法如下：
在1000毫升乙醚中，加入无水石膏50克，振摇数次，静置10小时以上蒸馏，收集35℃以下的馏液，即可应用。
（10）将提取瓶放在烘箱内干燥时，瓶口向一侧倾斜45℃放置使挥发物乙醚易与空气形成对流，这样干燥迅速。
（11）样品及醚提出物在烘箱内烘干时间不要过长，因为一些很不饱和的脂肪酸，容易在加热过程中被氧化成不溶于乙醚的物质；
中等不饱和脂肪酸，受热容易被氧化而增加重量．在没有真空干燥箱的条件下，可以在100-105℃干燥1.5-3小时。
八、思考题
1．采用无水乙醚作提取剂时，若样品未经过干燥，测定结果会怎样？
2．索氏抽提法是否对所有的样品都适用？
实验四：
还原糖的测定
4学时
1、掌握费林法测糖的原理及方法
费林法测定还原糖的原理和方法。
碱性酒石酸钾钠甲、乙液等量混合，立即生成天蓝色的氢氧化铜沉淀，这种沉淀很快与酒石酸钾钠反应，生成深蓝色的酒石酸钾钠铜络合物。
在加热条件下，以次甲基蓝作为指示剂，用还原糖滴定，样液中的还原糖与酒石酸钾钠铜反应，生成红色的氧化亚铜沉淀，进而与亚铁氰化钾反应生成可溶性的浅黄色亚铁氰化钾铜络合物。
待二价铜全部被还原后，稍过量的还原糖次甲基蓝还原，溶液蓝色消失，即为滴定终点。
根据样液的消耗量可计算出还原糖含量。
1．试剂：
（1）碱性酒石酸铜甲液：
称取15克硫酸铜（CuSO4.5H20）及0.05克次甲基蓝，溶于水中并稀释至1000毫升
（2）碱性酒石酸铜乙液:
称取50克酒石酸钾钠及75克氢氧化钠，溶于水中，再加入4克亚铁氰化钾，完全溶解后，用水稀释至1000毫升，贮于橡胶塞玻璃瓶内
（3）1g/L转化糖标准溶液
（4）200g/L氢氧化钠溶液
（5）6mol/L盐酸溶液
（6）乙酸锌溶液:
称取21.9g乙酸锌，加3ml冰醋酸，加水溶解并稀释到100ml。
（7）106g/L亚铁氰化钾溶液
2.仪器：
（1）50ml酸式滴定管
（2）5ml、10ml、25ml、50ml、100ml移液管
（4）250ml容量瓶
（5）25ml量杯
（6）恒温水浴锅
1．样品处理
（1）乳类、乳制品及含蛋白质的饮料称取2.5~5.0g固体样品或吸取25~50mL液体样品，置于250mL容量瓶中，加50mL水，摇匀后慢慢加入5mL乙酸锌及5mL亚铁氰化钾溶液，加水至刻度，混匀，静置0.5h。
用干燥滤纸过滤，收集滤液供测使用。
（2）酒精性饮料吸取100mL样品于蒸发皿中，用1mol/LNaOH中和至中性，在沸水浴上蒸发至原体积的1/4后，移入250mL容量瓶中，加50mL水混匀，以后按
（1）操作。
（3）含多量淀粉的食品称取10~20g样品，置于250mL容量瓶中，加200mL水，在45℃水浴中加热1h.振摇。
取出冷却后加水至刻度，混匀，静置。
吸取20mL上清液于另一250mL容量瓶中，以后按
（1）操作。
（4）汽水等含CO2饮料吸取100mL样品于蒸发皿中，在沸水浴中除去CO2，移入250mL容量瓶，并用水洗涤蒸发皿，洗液并入容量瓶，加水至刻度，混合后备用。
2．碱性酒石酸铜溶液标定
吸取碱性酒石酸铜甲、乙液各5.00mL，置于250mL锥形瓶中。
加水10mL，从滴定管加约9mL标准转化糖，使其在2min内加热沸腾。
准确沸腾30s，微沸下以每2秒1滴的速度继续滴加转化糖标液，直至溶液蓝色刚好褪去为滴定终点，后滴定操作需在1min内完成，消耗糖液在1mL以内。
记录消耗转化糖标液的总体积。
10mL（甲、乙液各5mL）碱性酒石酸铜溶液，相当于转化糖的质量（mg）：
m＇=V×
ρ
式中m＇—10mL碱性酒石酸铜溶液，相当于转化糖的质量（mg）
ρ—转化糖标准溶液的浓度（mg/mL）
V—标定时消耗转化糖标准溶液的总体积
3．
（1）样品溶液预测定：
吸取碱性酒石酸铜甲乙溶液各5.0mL，置于250mL锥形瓶中，加水10ml，使其在2min内加热沸腾，准确沸腾30s，微沸下以先快后慢的速度从滴定管中滴加样品溶液，待溶液蓝色变浅时，以每2秒1滴的速度继续滴定，直至溶液蓝色刚好褪去为滴定终点，记录样品溶液消耗体积。
（2）．样品溶液精测定：
吸取碱性酒石酸铜甲乙溶液各5.0mL，置于250mL锥形瓶中，加水10ml，从滴定管加入比预测时样品溶液消耗总体积少1ml的样品溶液，加热使其在2min内沸腾，准确沸腾30s，微沸下以每2秒1滴的速度继续滴定，直至溶液蓝色刚好褪去为滴定终点，记录样品溶液消耗总体积。
还原糖含量（以葡萄糖计，%）=（m＇/V）×
250×
（1/m）×
（1/1000）×
100
m＇—10mL碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量（mg）
V—测定时消耗样品溶液的体积（mL）；
250—样品溶液的总体积（mL）；
m—称取试样质量（g）。
注：
含多糖淀粉食品试样还需乘以250/20。
八、讨论：
（1）此法所用的氧化剂碱性酒石酸铜的氧化能力较强，醛糖和酮糖都可以被氧化，所以测得的是总还原糖量。
（2）碱性酒石酸铜甲液和乙液应分别贮存，用时才混合，否则酒石酸钾钠铜络合物长期在碱性条件下会慢慢分解析出氧化亚铜沉淀，使实际有效浓度降低。
（3）滴定时不能随意摇动锥形瓶，更不能把锥形瓶从热源上取下来滴定，以防空气进入反应液中。
九、思考题
1．本法能够用硫酸铜作澄清剂？
2．滴定时为什么要在保持在沸腾状态下？
3．样品溶液预滴定的目的是什么？
4．碱性酒石酸铜甲液和乙液为什么要分别储存？
5．滴定过程中为什么要严格控制反应条件？
十、实验报告
实验五：
酶活力测定
3学时
1、掌握糖化酶活力测定的原理及方法
淀粉经糖化酶水解为葡萄糖，采用碘量法测定葡萄糖含量，葡萄糖的醛基被弱氧化剂次碘酸钠氧化，过量的碘用Na2S2O3滴定，计算出酶活力。
糖化酶广泛分布于能直接以淀粉为营养源的所有生物体中。
糖化酶催化淀粉水解，从淀粉分子非还原性末端开始，分解a—1，4葡萄糖苷键生成葡萄糖，葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸钠氧化，过量的次碘酸钠酸化后析出碘，再用硫代硫酸钠标准溶液滴定，计算出酶活力。
1．仪器：
（1）pH4.60.1mol/LHAc缓冲剂：
称取乙酸钠（NaAc·
3H2O）6.7g溶于水中，加冰乙酸2.6mL，调至pH4.6后用水稀释至1000mL
（2）0.05mol/L：
Na2S2O3·
5H2O和0.2gNa2CO3用新鲜煮沸过的冷水溶解并稀释至1000mL，配制一周后以碘酸钾（或重铬酸钾）标定
（3）0.1mol/L碘溶液称取36g碘化钾溶于100mL水中，加入14g碘碘逐渐溶解，加3滴盐酸，用水稀释至1000mL,棕色瓶保存
（4）1mol/L硫酸溶液
（5）0.1mol/LNaOH溶液
（6）20g/L可溶性淀粉溶液
（7）200g/LNaOH溶液
（8）10g/L淀粉指示剂
（1）50ml酸式滴定管
（2）1ml、2ml、5ml刻度移液管
（3）50ml比色管
（4）25ml量筒
（5）恒温水浴锅
（1）待测酶液的制备：
称取酶粉1~2g，准确至0.0002g（或吸取液体酶1.00mL），先用少量的乙酸缓冲溶解，并用玻璃棒捣研，将上清液小心倾入适当的容量瓶中，用缓冲液定容至刻度（酶液浓度在样品与空白消耗Na2S2O3的差值为3~6mL为宜），摇匀。
通过四层纱布过滤，滤液供测定用。
（2）酶活力测定：
于甲、乙两支50mL比色管中，分别加入20g/L可溶性淀粉25mL和pH4.6乙酸缓冲液5ml,摇匀后至40℃恒温水浴中预热5min。
在甲管（样品）中加入待测酶液2mL，立刻摇匀，在此温度下准确反应30min，立即各加200g/LNaOH溶液0.2ml，摇匀。
将两管取出迅速冷却，并于乙管（空白）中补加待测酶液2mL。
吸取上述反应液各5mL，分别置于碘量瓶中，准确加入0.1mol/L碘溶液10mL，再加0.1mol/LNaOH溶液15mL，摇匀，密塞，于暗处反应15min。
取出，加1mol/L硫酸2mL，立即用硫代硫酸钠标准溶液滴定，直至蓝色刚好消失为其终点。
不同稀释倍数，应做相应的空白实验。
七、计算:
酶活力单位定义：
在上述条件（40℃、pH4.6）下，1h分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖为一个酶活力单位。
糖化酶活力（u/g或u/mL）=（V1-V2）×
c×
90.05×
×
n×
2
V1—空白消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积（mL）
V2—样品消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积（mL）
c—Na2S2O3标准溶液的浓度（mol/L）
90.05—与1.0mL1mol/LNa2S2O3标准溶液相当的以g表示的葡萄糖质量
32.2—反应液的总体积（mL）
5—吸取反应液的体积（mL）
1/2—吸取酶液2.00Ml，以1.00mL计
n—酶液稀释倍数
2—反应30min，换算成1h的酶活力系数
所得的结果表示至整数
为什么甲管和乙管加入酶液的时间不同？
实验六：
蛋白质的测定
5学时
综合
1、掌握水蒸气蒸馏法测定样品中蛋白质的原理及方法
本实验所涉及到的知识点有:
采用湿消化法破坏样品中的有机物的方法和操作,蒸馏吸收的原理及方法,总氮含量的凯氏定氮法测定原理性。
凯氏定氮法：
含蛋白质样品经加硫酸、硫酸钾、硫酸铜等催化剂消化，使蛋白质分解，其中氮素与硫酸化合成硫酸铵。
然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸液吸收后，再用盐酸或硫酸滴定根据盐酸消耗量，再乘以一定的数值即为蛋白含量，其化学反应式如下。
消化：
有机含氮物+H2SO4→CO2↑+SO2↑+H2O↑+NH3↑
2NH3+H2SO4→（NH4）2SO4
蒸馏：
（NH4）2SO4+2NaOH→2H2O+NaSO4+2NH3↑
吸收：
2NH3+4H3BO3→（NH4）2B4O7+5H2O
滴定：
（NH4）2B4O7+2HCl+5H2O→2NH4Cl+4H3BO3
集中授课形式
（1）浓硫酸—过氧化氢—水混合液（2:
3:
1）在100mL水中缓慢加入浓硫酸200mL，冷却后再加入30%过氧化氢300mL，混合备用。
此溶液存放阴凉处可保存一个月
（2）混合指示剂贮备液取50mL1g/L溴甲酚绿无水乙醇溶液与200mL甲基红无水乙醇溶液混合,贮于棕色瓶中备用
（3）硼酸—指示剂混合液取100mL20g/L硼酸溶液，滴加指示剂贮备液，摇匀衙溶液呈紫红色即可
（4）混合催化剂硫酸铜（CuSO4.5H2O）10g，硫酸钾100g,硒0.2g，在研钵中研细，通过40目筛，混匀后备用
（5）0.01mol/L标准溶液
（6）400g/LNaOH溶液
2．玻璃仪器:
（1）、凯氏定氮仪
（2）、定氮瓶
（3）、150ml三角瓶
（4）、50ml、l0ml、100ml量筒
（5）、10ml移液管
（6）、酸式滴定管
（7）、100毫升容量瓶
（8）、小漏斗
（1）消化：
准确称取试样0.2~0.3g（含有10~30mg粗蛋白质）置入100mL凯氏烧瓶中，加混合催化剂1g，同时加硫酸—过氧化氢—水混合液3~5mL，稍加振摇，斜置于电炉上，在通风橱内加热进行了消化。
开始用低温加热，勿使瓶中泡沫超过瓶肚的三分之二，待泡沫减少和烟雾变白后再增加温度保持微沸。
消化到溶液呈浅蓝色的透明状时，再继续加热沸腾10min,取出，冷却到室温后，将消化液转入100mL容量瓶中，用70~80mL水洗涤凯氏烧瓶，冷却至室温后加水稀释到刻度，摇匀。
同时作一空白，除不加试样外，其它操作相同。
（2）蒸馏：
在半微量凯氏定氮仪的蒸馏瓶中，加入5mL稀释消化液和10mL水，再加入400g/LNaOH溶液，立即用水蒸气蒸馏，接收三角瓶中加20mL硼酸—指示剂混合液。
待蒸馏沸腾后蒸馏至溶液呈亮绿色后再蒸馏5min。
（3）滴定：
用0.01mol/LHCl标准溶液滴定三角瓶中的吸收液，滴定至溶液由亮绿色变成浅紫色为止。
吸取5mL空白消化液，按照上述步骤进行操作。
七、计算
粗蛋白质含量（干基，%）=（V-V0）×
0.0140×
K×
100×
1/（1-X）
式中V——滴定试样时消耗HCl标准溶液体积
V0——滴定空白时消耗HCl标准溶液体积
c——HCl标准溶液的浓度（mol/L）
K——氮换算成粗蛋白质的系数，一般取6.25
M——称取试样质量（g）
X——试样水分含量（%）
0.0140——消耗1ml1mol/LHCl标准溶液相当于氮的质量（g）
八、讨论
（1）凯氏定氮法分常量、半微量和微量三种，其原理和操作步骤基本相同。
所不同的是常量法适于测定范围为15-40mg氮，半微量法2-5mg氮，微量法0.05-1mg氮。
另外，碱化后蒸馏，常量法是采用直接蒸馏法，半微量和微量法采用水蒸气蒸馏法。
（2）消化过程中，若浓硫酸—过氧化氢—水混合液损失过多时，可酌量补加，勿使瓶内干涸。
消化液加水稀释后，应及时进行蒸馏，否则应保存消化液。
临用时加水稀释。
（3）蒸馏过程中切忌火力不稳，否则将发生倒吸现象。
（4）混合指示剂在pH5.2时为紫红色，Ph5.6时为亮绿色，变色点为5.4，指示剂变色范围很窄，灵敏度高。
（5）样品应是均匀的，固体样品应预先研细混匀，液体样品应振摇或搅拌均匀。
（6）样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上，万一沾附可用少量水冲下，以免被检样消化不完全，结果偏低。
（7）在整个消化过程中，不要用强火，保持和缓的沸腾，使火力集中在凯氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下。
使氮有损失。
（8）加入硫酸钾的作用为增加溶液的沸点，硫酸铜为催化剂，硫酸铜在蒸馏时作碱性反应的指示剂。
（9）以硼酸为氨的吸收液，可省去标定碱液的操作，且硼酸的体积要求并不严格，亦可免去用移液管，操作比较简便。
1.消化过程中样品中的有机物组分C、N、H会发生什么转化
2．消化过程加入硫酸钾和硫酸铜各有什么作用？
3．蒸馏前加入氢氧化钠有什么作用？
这是溶液的颜色会发生什么变化？
为什么？
如果没有变化，说明了什么问题？
附件一
实验报告的基本内容及要求
实验报告应体现预习、实验记录和实验报告，要求这三个过程在一个实验报告中完成。
1．实验预习
在实验前每位同学都需要对本次实验进行认真的预习，并写好预习报告，在预习报告中要写出实验目的、要求，需要用到的仪器设备、物品资料以及简要的实验步骤，形成一个操作提纲。
对实验中的安全注意事项及可能出现的现象等做到心中有数，但这些不要求写在预习报告
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