天然产物的美拉德反应产物及其检测手段Word文档格式.doc

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Kong等[4]发现美拉德反应产物中呋喃的衍生物具有抗突变的作用；

Hayse等[5]和Kim等[6]则认为美拉德反应产物的抗突变作用与其抗氧化的能力有关。

人体环境适宜的温度和复杂的物质体系为美拉德反应的创造了良好的条件。

体内美拉德反应，其反应过程及产物十分复杂，反应终产物被称为晚期糖基化终产物（AdvancedGlycationEndproductionsAGEs）。

体内美拉德反应能导致一些氨基酸残基的损伤，可消化性下降，可溶性下降，褐变，荧光物质的生成及交联，从而导致生物体内相关蛋白的生物活性的丧失，并且与细胞和组织的老化病因相关[7-9]，与衰老[10]、糖尿病[11]、尿毒症[12,13]等临床疾病的发生、发展过程密切相关。

美拉德反应产物比较复杂，单一产物不易大量获得，所以大多数研究者只能局限于混合的美拉德反应产物的抗氧化、抗突变方面的研究。

关于美拉德反应单一产物的深入研究，文献很少见[14,15]。

由此可见，研究天然产物美拉德反应产物以及检测手段具有非常积极的意义。

1.美拉德反应的机理

美拉德反应机理十分复杂，其反应历程、产物组成及其性质等受多种因素影响，氮基化

合物和还原糖的种类、性质以及它们间的反应比例，反应时的pH值、温度、反应时间、水分活度、缓冲液浓度对反应的速率以及最终产物的组成有着重要的影响。

Hodge在1953年提出的美拉德反应的4条可能的反应途径[16]。

包括：

初级反应阶段：

还原糖的羰基与氨基酸或蛋白质的游离氨基缩合生成席夫碱，再经环化形成相应的N-取代的醛糖基基胺，经Amadori重排形成Amadori化合物（1-氨基-1-脱氧-2-酮糖）。

见图1

中间反应阶段：

Amadori化合物在中间阶段进行的反应，主要有三条路线：

1.当pH值等于或小于7时，Amadori化合物主要发生1,2-烯醇化而形成糠醛（当糖为戊糖时）或羟甲基糠醛（当糖为己糖时）；

2.当pH值大于7时，Amadori化合物主要发生2,3-烯醇化反应，产生还原酮类及脱氢还原酮类，例如4-羟基-5-甲基-2,3-二氢呋喃和很多裂解产物产物包括1-羟基-2-丙酮、丙酮醛、二乙酰基等，这些都是高活性的中间体，可以继续参加反应，形成含羰基或双羰基化合物以进行最后阶段。

羰基能与自由氨基缩合，这样就使最终产物中含氮。

3.上阶段的活性中间体能和氨基酸反应形成醛和α-氨基酮，这个反应成为Strecker反应。

见图2,3

最终反应阶段：

包括环合、脱氢、retro-Aldol反应、重排、异构化，进一步缩合，最终形成棕色含氮聚合物或共聚物，成为类黑素（melanoidins）。

2.天然产物的美拉德反应产物

1980年代，几本书详细论证了美拉德反应在化学、营养学、食品的色香味、食

品加工、体内过程、毒理学等方面的研究进展。

1990年Ledl等[17]综述了美拉德反应的一

些小分子中间体或产物，列出了与食品香味、色泽相关的一些杂环产物。

1996年Friedman[18]

列出了一些美拉德反应的蛋白质交联产物、对身体健康有害的杂环胺类化合物以及可能的

减慢或阻止美拉德反应的方法[16]。

由于天然美拉德反应的产物结构数量多，结构复杂且分

离不易，本文选择对美拉德反应各个不同进行阶段中有代表性的MRPs进行了综述。

2.1蛋白质交联产物

体内美拉德反应，其反应终产物被称为晚期糖基化终产物（AGEs）。

AGEs是蛋白质

交联的产物，人体内半衰期长的蛋白质等均可积累AGEs。

免疫化学方法和化学方法均表

明组织蛋白中的AGEs随年龄增长而增加[19]。

在眼球蛋白、血浆、红细胞中、动脉和肾脏

中都发现AGEs随着年龄增长而增加，特别是在糖尿病人和尿毒症病人中增加更快[20-23]。

AGEs和白内障的形成[24]、动脉硬化[25]、早老性痴呆（阿尔茨海默氏病）[26]、淀粉性变样、

肾病、神经病、视网膜病等有关[27-29]。

目前发现的主要有以下几种交联产物：

2.1.1pentosidine

Monnier和Brownlee等发现了糖尿病人、糖尿病动物和高血糖实验中[30]的美拉德类

型的荧光物质在不断增加，推断起作用的可能是荧光物质。

Monnier等[31]分离得pentosidine并确定了结构，还得到了pentosidine和年龄的线性关系，发现在糖尿病人中的pentosidine

量增加速度加快。

2.1.2LM-1（Versperlysine）

LM-1是一种荧光的蛋白质交联产物，Nagaraj等[32]从人的白内障的眼晶体蛋白中将

其提取和分离出来，发现LM-1随眼球中色素的提高而增加，尤其在糖尿病人中。

LM-1类的荧光物质可以通过BSA和核糖、抗坏血酸及它的氧化物来合成，不能用葡萄糖和果糖[33]

来合成。

2.1.3CML（N-取代羟甲基赖氨酸）

Baynes小组首先从果糖赖氨酸（fructoselysine）氧化物中得到CML，接着又在眼球蛋白

中也分离出CML[34]。

Dunn等[35]发现随着年龄的增长，CML在不断增加，但是果糖赖氨

酸的量不变，后来又发现了CML的类似物CMhL[（carboxymethyl）hydrolysine]，CMhL也

随着年龄增长而增加。

2.1.4Pyrraline

Monnier小组用免疫化学和色谱方法证明在血浆蛋白、眼球蛋白和角膜后弹性层在

Pyrraline类化合物[36]。

2.1.5Crossline

Nakamura等[37]在α-N-乙酰基-L-赖氨酸和D-葡萄糖的反应中发现了crossline。

Obayash

等[38]发现Crossline的量在糖尿病人中随年龄增长而增加。

2.1.6咪唑赖氨酸盐（imadazoliumsaltGOLD和MOLD）

Velisek[38]在高温下的甘氨酸或氨基乙酰基甘氨酸和乙二醛的反应中发现了咪唑赖氨

酸的类似物。

2.2丙烯酰胺（AA）

丙烯酰胺是具有神经毒性的小分子化合物。

可引起急性、亚急性、慢性中毒。

主要表现为神经系统的损害，出现感觉-运动型周围神经核中枢神经病变。

而且具有眼毒性、生殖毒性、遗传毒性。

对于致癌性，虽然现阶段还没有临床试验和人群资料支持AA的致癌作用，但动物实验早已证实为B类致癌物。

2002年瑞典科学家发现在食品加工过程中，油炸或焙烘的淀粉类食品中发现含有较高含量的AA以来，引起了国际上对其毒性的关注。

自从发现食品中存在AA后，各国对于AA做出了新的规定，WHO也与2002年7月在网上公布了新的LC/MS/MS检测方法[40,41]。

Becalski等[42]证明天冬酰胺是形成AA的重要前提。

Zyzak等[43]报道的AA形成机理见图4。

2.3四甲基吡嗪（川芎嗪）

白酒中四甲基吡嗪（tetramethylpyrazineTMP）在制曲、堆积发酵过程均会产生，并经蒸馏带入酒中，在我国白酒主要酒种中有较高含量。

TMP是美拉德反应的产物，北京制药工业研究所在上世纪70年代中期，从川芎中分离得到的含量仅千分之几的四甲基吡嗪，后命名为川芎嗪（ligustrazine）。

TMP能通过血脑屏障，在脑干分布较多，又具有扩张血管、改善微循环及抑制血小板集聚等作用，因此在临床上用于缺血性血管疾病的治疗[44]。

吡嗪类化合物可以由Amadori重排的产物，1-氨基-1-脱氧-2-酮糖二聚缩合产生，也可以二羰基化合物与氨基酸经Strecker降解，生成的氨基酮二聚缩合产生。

袁春伟采用对甲苯胺与3,5,6-三甲基-D-葡萄糖在酸性条件下生成较稳定的Amadori化合物，此化合物再经而据和反应形成1,4-二氢吡嗪，二氢吡嗪氧化即生成吡嗪[45,46]。

见图5。

酿酒生产过程中，TMP是由美拉德反应第一条路线生成的中间体丁二酮与蛋白质水解的氨基酸缩合反应生成的。

所以白酒中TMP的研究，应成为白酒有益于健康研究的重要方向。

适量饮用白酒有益于健康，甚至比干红葡萄酒（功能性成份白芦藜醇）更有益于人体的健康。

2.4红参中麦芽酚和精氨酸双糖苷（AFG）

鲜人参中含有丰富的游离精氨酸（Arg）。

鲜人参经蒸制至熟后通过烘烤干燥所制成棕红色半透明角质状的出加工品称之为红参。

红参的抗肿瘤活性强于鲜人参和生晒参，且红参中精氨酸含量降低，并含鲜人参中所不具有的成分，其原因在于红参加工过程中，鲜人参中的麦芽糖或葡萄糖与精氨酸发生了美拉德反应[47]，产生了新的具有较强活性的化合物。

其美拉德反应的主要产物为麦芽酚和精氨酸双糖苷（AFGArgininyl-Fructosyl-Glucose）。

李向高，郑毅男等提出了红参中麦芽酚[48]和精氨酸双糖苷[49]的可能形成反应过程。

如图6与图7。

李向高，郑毅男利用L-精氨酸和麦芽糖，在醋酸中80℃反应1h，合成制得AFG[47]。

经测试，AFG具有增强免疫、扩大血管及抑制小肠麦芽糖酶活性等生理作用[50]。

2.5类黑素（melanoidins）

类黑素（melanoidins）是美拉德反应的最终产物，其反应过程非常复杂。

到目前为止，关于类黑素的结构还不是很清楚。

起始原料、反应条件的不同都会影响黑色素组成。

类黑素是一类聚合度不等的高分子混合体，多以短肽或蛋白复合物的形式存在，亲水性极强，具有类似膳食纤维的功能，可降低人体餐后血糖，抑制胰蛋白酶和ACE活性，阻断致癌物亚硝胺合成，抗杂环胺诱变，结合封闭金属离子[51]。

研究表明随美拉德反应时间的延长，抗氧化能力明显增加，而经脱色处理的美拉德反应产物抗氧化能力则显著下降，说明了类黑精中的色素物质的抗氧化作用。

利用黑色素的抗氧化性能，被用以代替酚类作为食用抗氧化剂，正逐渐引起人们的注意[52,53]。

关于类黑素的结构，目前主要有三种观点[16]：

（1）Heyns,Tressl等提出类黑素聚合物主要是由重复单元的吡咯或呋喃组成，通过缩聚

反应最终形成美拉德反应。

（2）Hofmann发现低分子量的生色团通过赖氨酸的ε-NH2或精氨酸和蛋白质交联而形成

高分子量的有颜色物质。

Hofmann认为类黑素根据分子量可以被分为两部分：

一类是低分子量的有色物质，分子量低于1000；

另一类是分子量达到100000的大分子。

目前关于生色团有较多的报道，包括：

1.Arnoldi等[54]从木糖/赖氨酸体系中分离出一个三元环的黄色物质，通过MS，NMR得出结构为1或2。

2.Hofmann[55]发现呋喃-2-羧酸与L-丙氨酸反应时，生成两种红色产物，结构为3和4。

3.在呋喃-2-羧酸存在下，Hofmann[56]从木糖和丙氨酸反应中分离出及黄色的化合物5和6。

4.Hofmann[55]在木糖和L-丙氨酸反应发现了化合物7。

（3）Cammerer等57]认为类黑素主要是由美拉德反应第一阶段的糖降解产物通过Aldol缩

合聚合而成，氨基酸可能是后连上的。

Cammerer等认为类黑素的结构框架中存在完整的碳水化合物结构。

他们通过高效薄层-高效液相色谱（HPTLC-HPLC）法定性定量检测了类黑素的降解产物。

形成于包含氨基酸化合物的3-deoxyhexosulose的可能的蛋白黑素的形成机理见图8。

2.6其他类型美拉德反应产物

2.6.13-脱氧葡萄糖醛酮（3-DG）

3-脱氧葡萄糖醛酮（3-Deoxyglucosone，3-DG）是一种高反应毒性2-羰基醛化合物，主要在体内美拉德反应的初级阶段以及多元醇通路形成。

进来研究表明[58]：

3-DG可通过其本身的毒性作用，如有到细胞凋亡及灭活抗氧化酶等，直接影响细胞和组织功能；

同时作为体内美拉德反应的高反应性中间产物，参与并促进晚期糖基化终末产物（AGEs）的生成，从而介导一系列病理反应，在衰老、糖尿病、尿毒症等许多临床疾病的发生、发展过程中发挥重要作用。

3-DG在3-DG还原酶作用下可脱毒生成3-脱氧果糖，在羰基醛脱氧酶作用下脱毒生成3-脱氧葡萄糖醛酸。

3-DG代谢酶系统作为一种资深防御系统，可以通过调节3-DG而减少美拉德反应的进行和AGES过量生成，并使3-DG处于相对正常水平，从而对一系列疾病的产生进展及预防有着积极意义[8]。

目前，国内外对3-DG的研究，主要集中在3-DG代谢酶及其产生菌种和体内3-DG检测上。

3-DG结构如图9。

2.6.2[（4aS,6R,7S,8R,8aR）-4a,6,7,8,8a-hexahydro-7,8-dihydroxy-6-hydroxymethyl-1,4-dipr-

opyl-1H-pyrano[2,3-b]pyrazine-2-yl]-hydroxy-3-buten-2-one

（1）

ThomasKnerr等[59]用D-葡萄糖和丙胺在醋酸/乙醇中回流反应，得到两个产物1和2。

主要产物1确定结构[（4aS,6R,7S,8R,8aR）-4a,6,7,8,8a-hexahydro-7,8-dihydroxy-6-hydroxymeth

-yl-1,4-dipropyl-1H-pyrano[2,3-b]pyrazine-2-yl]-hydroxy-3-buten-2-one。

较少产物2，虽然得到一定波谱数据，但其结构未完全确定。

化合物1的生成机理见图10。

2.6.34-hydroxy-5-methyl-2-（N-butyl-3-hydroxy-5-（2-hydroxyethyl）pyrrolyl-2-methylidene）

-2H,3H-furan-3-one

（2）和1-N-butyl-4-hydroxy-5-methyl-2-（N-butyl-3-hydroxy-5--（2-hydroxy-

ethyl）pyrrolyl-2-methylidene）-2H-pyrrolin-3-one（3）

Holger等[60]利用D-葡萄糖和正丁胺在醋酸/水溶液中回流反应，得到化合物2和3。

在将

化合物2和3乙酰化后，确定了化合物2和3的结构。

在反应中，正丁胺作为模型化合物代表具

赖氨酸侧链的蛋白质。

化合物2和3的生成机理见图11。

2.6.47,8a-dihydroxy-4a-methyl-8-（-D-glucopyranosyloxy）hexahydro-5-oxa-4-thia

-1-azanaphthalene-2-carboxylicacid（4）

Masafumi等[61]研究了Amadori化合物与半胱氨酸发生美拉德反应的情况。

利用Amadori化合物1-deoxymaltulosy-glycine（Mal-Gly）与半胱氨酸在中性水溶液中加热反应，利用制备HPLC得到一个新颖的化合物4。

化合物4在100℃1mol/LHCl中，很快分解为异麦芽酚和乙酰基呋喃。

化合物4结构如图12所示。

2.6.52,5-diacetyl-3-methyl-1H-pyrrole（5）和2-Acyl-5-methylpyrazine（6）

AnAdams等[62]利用美拉德反应中间阶段产物的类似物2-O-丙醛酮及其前体1,3-二羟基丙酮与20种不同的氨基化合物反应，并探讨了其生成机理。

主要得到化合物5和6。

其生成机理见图13。

2.6.61-acetyl-β-carboline（acetyl-βC）（7）

Birgit等[63]参照食物加工中L-色氨酸和D-葡萄糖可能发生的反应条件，利用HPLC/DAD检测，L-色氨酸和D-葡萄糖反应得到葡萄糖-色氨酸Amadori化合物（AP）,将AP在强酸性甲醇溶液中加热得到（1R,3S）-1-（D-gluco-1,2,3,4,5-pentahydroxypentyl）-1,2,3,4-tetrahydro-β-carboli-

ne-3-carboxylicacid（PHP-THβC），PHP-THβC在150℃加热条件下得到1-acetyl-β-carboline（acetyl-βC）（化合物7）。

其反应过程如图14。

2.6.77-hydroxy-4a,6-dimethyl-2H,3H,4aH-furo[2,3-b]thiazine（11）

ThomasHofmann在对D-葡萄糖和L-脯氨酸混合物加热过程中，得到两个苦味化合物9和10。

并发现如果在反应体系中加入L-半胱氨酸，会大大减少苦味感。

其原因是L-半胱氨酸会很容易与反应的中间体化合物8生成7-hydroxy-4a,6-dimethyl-2H,3H,4aH-furo[2,3-b]thiazine

（化合物11），从而减少苦味化合物的生成。

其反应过程见图15。

3.天然产物的美拉德反应产物的检测技术

由于天然产物的美拉德反应产物结构复杂多样，类型不一，反应产物受反应条件影响较大，没有固定统一的方法来检测。

为方便叙述，将天然产物的美拉德反应产物分为简单小分子反应产物和高分子反应产物。

针对有代表性的天然产物的美拉德反应简单小分子产物作详细介绍，对天然产物的美拉德反应高分子反应产物作笼统介绍。

3.1天然产物的美拉德反应简单小分子产物的检测技术

3.1.1食品加工中风味成分的检测技术

在食品加工和烟草加工过程中的美拉德反应，产生的挥发性性简单小分子化合物，作为风味成分可以改善食品和烟草的色泽、香气、品相。

由于原料和加工工艺技术的不同，其挥发性芳香成分有很大差距。

利用GC-MS技术，可以检测这些风味成分的结构，固定食品和烟草加工中的风味成分组成以及优化加工工艺，调配风味成分成分占比。

王浩等[65]以奥尼罗非鱼鱼皮中胶原蛋白酸解液与葡萄糖为原料，对美拉德反应乙醚层进行GC-MS分析（岛津QP-2010A型气相色谱-质谱连用仪），通过G170LBA化学工作站书局处理系统，检索Nis98谱图库及EPA/NH质谱图集的标准谱图进行对照，复合，确定其主要风味成分有：

乙酸乙酯（相对质量分数达30%以上）、1,1-乙二醇二乙酸酯、2,3-二羟基丙醛、己二酸二丁酯、二乙二醇丁醚醋酸酯、苯甲酸乙酯、2-乙酰基吡咯、柠檬烯等水果香风味物质，其总质量分数占67.17%。

鉴定出多种烷烃化合物：

3,3,5-三甲基庚烷、2,6-二甲基癸烷、3,7-二甲基壬烷、4-乙基辛烷、2,6,10-三甲基十二烷，其总质量分数为6.46%。

3.1.2丙烯酰胺的检测技术

高温加热时食品加工最普遍和广泛使用的一种加工方法，如高温杀菌、油炸等。

2002年4月瑞典国家食品管理局和斯德哥尔摩大学宣布高温加热食品中有丙烯酰胺（AA）产生，食品中丙烯酰胺的存在水平为μg/kg~mg/kg。

AA对人和动物是一种有效积累积性神经毒性，进入体内，可以迅速快速分布全身的组织中，环氧丙酰胺和环氧化合物是其代谢产物，可与DNA加成形成加合物。

因此研究高温加热食品中AA的产生于预防对于食品安全具有重要的现实意义。

目前检测食品中AA的常用方法有GC-MS和LC-MS及LC-MS/MS以及质子转移反应质谱（PTR-MS）[66]。

前面3中都是离线分析方法，分析的灵敏度堵在几到几十ng/mL左右。

GC/MS采用固相萃取（SPE），溴化作为衍生化方法，不分流进样，程序升温，选择性离子检测，电子离子化。

LC-MS采用同位素13C3作标记为內源性标准，2-巯基苯甲酸进行衍生化，己烷去脂，乙腈和乙酸为流动相，电喷雾离子化。

LC-MS/MS采用13C3作标记为內源性标准进行示踪，固相萃取，ShoderxRspakDE-613聚甲基丙烯酸酯凝胶柱，甲酸为流动相，分流进样，选择性例子检测，电喷雾离子化。

质子转移反应质谱（PTR-MS）是一种在线分析方法，具有很重要的实际意义。

将直接收集的顶空气体连续导入DriftTube，在此管内含有缓冲气体及控制离子流H3O+，挥发性化合物具有比水大的质子亲合力，在管内从H3O+夺取氢离子而离子化，进入质谱仪分析。

3.1.33-脱氧葡萄糖醛酮的检测技术

正常人血清中的3-脱氧葡萄糖醛酮（3-DG）通常维持在较低水平，糖尿病患者的高血糖状态可导致血清和红细胞中3-DG生成增加，其血清中3-DG含量要比正常人升高3-5倍。

目前国内对3-DG研究较少，在一般生理样品中3-DG含量较低（纳克水平），因此要求检测方法的灵敏度较高。

江国荣等[67]应用2,3-二氨基萘柱前衍生，采用C18色谱柱，流动相为50mmol/LNa2HPO4·

12H2O-NaH2PO4·

2H2O缓冲液（pH7.4）-甲醇-乙腈（7.0:

0.5:

2.5），检测波长为Ex/Em=271/503nm。

结果：

3-DG峰成尖峰，分离度良好；

在12.5-250ug/