酶法制备的大米免疫活性肽分离纯化的研究Word文件下载.docx

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二、申请书一律用A4纸，于左侧装订成册。

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如有查新报告及其它附件材料，请连同申请书一起装订成册。

三、“所属学科”按博士、硕士学科专业目录（2006年修订版）二级学科名称填写。

（封2，此页不装订）

二、立项依据

（项目的研究目的、意义；

国内外研究现状分析和发展趋势；

项目应用前景和学术价值；

现有研究基础、条件、手段以及指导教师情况等）

1.项目研究目的、意义

1.1大米蛋白深加工既可提高经济价值又可避免资源浪费

大米的营养十分丰富，是中国人民的主要食粮之一，中国稻谷产量占世界总产量的1/3以上，我国人口中有65%以水稻为主食，特别是在南方。

大米中含碳水化合物75%左右，蛋白质7%~8%，脂肪1.3%~1.8%，并含有丰富的B族维生素等。

大米蛋白中的谷蛋白和球蛋白为主要成分，分别占8%和12%，醇溶蛋白占3%，大米蛋白主要以PB-Ⅰ和PB-Ⅱ两种蛋白体的形式存在。

在我国，有大量的陈米、早籼米和碎米，有一部分用于发酵和淀粉糖工业，然后就会留下米渣，大米经制糖后，由于大量的淀粉已经被利用，其中蛋白质得到浓缩，蛋白质含量高达40%~60%；

还有一部分直接当做饲料来喂养牲畜。

这样没有达到物尽其用的效果，造成资源的浪费。

因而，对大米蛋白的深加工不仅使大米物尽其用，避免资源浪费，而且还能提高大米蛋白经济价值。

1.2大米免疫活性肽分离纯化技术的研究对于活性肽规模化的工业化生产具有重要意义

生物活性肽是对生物机体的生命活动有益或具有生理作用的肽类化合物，是一类相对分子质量小于6000Da，具有多种生物学功能的多肽，多肽现在主要应用在药物和功能性食品上。

大米蛋白作为一种低过敏性的优质植物蛋白，其中蕴涵着许多具有生物活性的氨基酸序列，用特异的蛋白酶水解就有可能释放出有活性的肽段。

目前，虽然已经发现大米活性肽具有许多生理活性特征，如抗氧化性、ACE抑制活性和免疫活性等，但对其实际应用开发仍处于摸索阶段，对大米活性肽功能效应的研究开发也以实验室阶段为主，尚未形成大规模的工业化生产。

对大米肽的研究主要集中在抗氧化肽和ACE抑制肽，而对免疫活性肽的研究比较少，而且酶法制备免疫活性肽的分离纯化还到很多问题的困扰，酶法制备免疫活性肽的过程中产生了大量分子量相近的肽段，还缺乏高效的普适性分离纯化免疫活性肽的方法。

另外随着我国人口的老龄化，老年人口比例已占总人口的14.5%，随着年龄增长，机体免疫力下降，刚出生的婴儿，其免疫器官尚未发育完全，免疫系统的功能也不健全，他们对免疫力的提高有非常必要需求，大米免疫活性肽的开发有潜在的市场需求。

针对上述问题，本项目从优化酶法制备大米免疫活性肽的工艺和摸索高效的普适性的分离纯化大米免疫活性肽的工艺方法，以期得到最佳酶解大米免疫活性肽的工艺和高效的普适性的分离纯化大米免疫活性肽的方法，为大米免疫活性肽的工业化生产提供最佳工艺条件，使大米免疫活性肽更广泛、科学地应用于食品工业及医药领域。

开发具有免疫活性的大米肽，以丰富功能性食品市场，同时大米免疫活性肽也可用来开发免疫增强剂，丰富医药市场，这样不但提高资源利用率，也将为我国的健康事业和经济发展做出贡献。

2.国内外研究现状分析和发展趋势

随着具有各种生物活性的多肽的不断发现，对多肽的研究和开发越来越受到各国科学家的重视。

近十多年来，国内外对多肽进行了大量的基础和应用研究，国外早已将多肽药物和营养产品推向市场，且市场前景极为可观。

Yoshiyuki等[1]可以从酒糟中分离出九种具有ACE抑制活性的肽；

刘志国等[2]分别用胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶单独或联合水解米糠蛋白，酶解组分中含有较高ACE抑制活性成分，其相对分子量在500u以内，其中活性组分主要为Arg-Tyr、Met-Trp、Gly-Val-Tyr或Gly-Asp-Phe，这些组分共同特征C端具有苯环样结构；

蒋燕等[3]采用不同的蛋白酶对碎米蛋白进行水解，得出最佳水解酶为风味蛋白酶，同时确定出的最佳酶解工艺条件下ACE抑制肽的抑制率可达85.4%;

Takahashi等[4]报道用胰蛋白酶水解大米蛋白后，获得由具有引起豚鼠回肠收缩、抗吗啡及免疫调节活性的由8个氨基酸组成的肽；

陈季旺等[5]用胰蛋白酶从米糠水解物中分离出具有类吗啡拮抗作用的五肽；

玄国东[6]利用碱性蛋白酶水解米糟蛋白制备抗氧化肽，水解产物具有较强的还原能力，同时对米糟蛋白水解物、茶多酚、BHA、Vc等四种物质进行清除DPPH·

自由基能力比较实验，结果表明米糟蛋白水解物的清除DPPH·

自由基能力与BHA相当；

贾俊强[7]等采用超声波预处理大米蛋白，再利用中性蛋白酶酶解制备出大米抗氧化混合肽，其清除DPPH·

的能力可达到74.8%，大米蛋白经胃蛋白酶处理，所得酶解物对化学体系产生的O2-、OH-及DPPH·

自由基有很强的清除能力，还能有效抑制小鼠肝匀浆丙二醛（MDA）生成及红细胞氧化溶血程度，尤其对亚铁离子诱导的小鼠肝脏匀浆液的抑制作用最明显，抑制能力与维生素E相当；

申衍豪[8]使用碱性蛋白酶酶解大米蛋白同时给予超声处理得到大米活性肽，并通过离子交换层析、凝胶色谱和RP-HPLC进行混合肽的分离测定，得到的F3b组分清除DPPH·

自由基的能力最强，可达89.53%。

相对国外，中国生物活性肽研究起步晚，目前处于起步阶段。

而且目前研究得比较多的肽有乳肽[9-15]、大豆肽[16-19]、玉米肽等[20-21]，对大米肽的研究还比较少，大米活性肽在我国的研究相对于国外来说起步比较晚，所以对大米生物活性肽的研究尚浅，而且研究的热点也大多是抗氧化肽和抗血压肽上，国内外对于酶法制备大米免疫活性肽的研究比较少，日本和美国在大米免疫活性肽的研究相对比较多一些，日本对稻米资源开发利用涉及粮油、食品、医药保健、日化、造纸、建材、化肥和能源等多个领域，最大限度的实现物尽其用。

但在其他国家大米免疫活性肽的研究是比较少的，在分离纯化这一块也是薄弱的，只有少数的研究者分离纯化出纯的免疫活性肽，并确定其氨基酸序列。

本项目前期研究已证实酶法制备的大米多肽具有较强的免疫活性。

因此，可将大米免疫活性肽作为食品和医药领域潜在的免疫增强剂来进行开发。

3.项目应用前景和学术价值

3.1项目应用前景

在我国，有大量的陈米，有一部分用于发酵和淀粉糖工业，然后就会留下米渣，大米经制糖后，由于大量的淀粉已经被利用，其中蛋白质得到浓缩，蛋白质含量高达40%~60%；

日本对稻米资源开发利用涉及粮油、食品、医药保健、日化、造纸、建材、化肥和能源等多个领域，最大限度的实现物尽其用。

因而，对大米蛋白的深加工不仅使大米物尽其用，避免资源浪费，而且还能提高大米蛋白的经济价值，具有较大的社会效益和经济效益。

3.2学术价值

目前报道的分离纯化免疫活性肽的技术成本很高，且缺乏高效、普适性的分离纯化方法，蛋白酶解物的分离纯化技术已成为制约活性肽的产业化生产的关键所在。

本项目以大米为原料，通过本实验室前期摸出的碱提酸沉的提取蛋白的工艺，提取蛋白质，用特异的蛋白酶水解大米蛋白，使其释放出有免疫活性的肽段。

以MTT法的刺激指数为指标，拟通过比较多种膜分离技术、常压色谱和高压色谱的分离纯化效果，优化各种分离纯化方法的工艺条件，探索多种分离纯化方法的应用顺序，以期得到广泛适合酶法制备免疫活性肽的分离纯化方法，同时分离纯化出纯出一系列较强免疫活性的免疫活性肽，同时为大米免疫活性肽的产业化生产提供最佳的工艺参数；

在细胞水平对目标短肽的免疫活性进行研究，为对大米蛋白酶解物的免疫活性方面的开发利用提供理论依据。

4.研究基础、条件、手段和指导老师情况

4.1研究基础

本项目成员程云辉博士/教授自2000年2月以来一直从事麦胚蛋白酶解物抗氧化性及分离纯化的研究，在国内外学术期刊上发表了十多篇系列研究论文，其3篇论文分别被SCI和EI收录；

本实验室前期已用不同的酶对大米蛋白进行酶解，并以水解度为指标，来制备免疫活性肽，优化出最佳的酶解工艺条件，得到免疫活性较高的蛋白酶解物，并进行了初步的分离纯化，研究结果表明，分离纯化能提高大米蛋白酶解物的免疫活性；

本项目前期研究已经筛选出特异性的酶，用其酶解大米蛋白得到酶解物进行细胞实验，用MTT法测酶解物对RAW264.7株细胞的刺激指数（SI），在其浓度为250ug/mL时，SI值为1.80，说明此酶解物具有较强的免疫活性。

4.2研究条件

项目依托单位和合作单位建有食品生物技术和分子生物学研究平台、细胞培养室，拥有研究所需要的相关仪器和设备；

项目组成员熟悉本课题所涉及领域的前沿工作；

课题研究思路新颖、方法可靠、方案可行；

熟练掌握了相关实验技术和方法；

上述工作基础可保证本课题研究目标按计划顺利实施和完成。

4.3研究手段

采用纳滤、超滤装置，离子交换色谱，极性色谱，反相高效液相色谱，以MTT刺激指数为指标，分离纯化目标酶解物。

4.4指导老师情况简介

程云辉，女，工学博士，教授，硕士生导师，长沙理工大学化学与生物工程学院常务副院长，中文核心、CSCD收录期刊《食品与机械》执行主编，教育部食品科学与工程类专业教学指导委员会委员，湖南省“十一五”学位与研究生教育优秀研究生指导教师，湖南省“万企联村、共同发展”专家顾问团成员，湖南省食品工业标准化技术委员会委员，湖南省食品科学技术学会常务理事，湖南省省级特色专业—“食品科学与工程”专业负责人，湖南省省级精品课程—《食品分析》建设负责人。

主要研究方向为功能因子的分离纯化及构效关系研究，目前研究重点为抗氧化肽构效关系及植物蛋白功能特性的改性修饰。

探讨了广泛适合酶法制备的抗氧化寡肽的高效分离纯化方法；

围绕植物蛋白溶解性低的技术难题，开展了大米蛋白、麦胚蛋白酶法改性及酶解制备活性肽的研究，其研究成果达到国际先进或国内领先水平。

（1）近年获奖成果

《稻米深加工高效转化与副产物综合利用》，2011年获国家科技进步二等奖，本人排名第4；

《大米主食生产关键技术创新与应用》，2013年获湖南省科技进步一等奖，本人排名第3；

《FMHE高扭矩双螺杆挤压机系列产品研制与开发》，2012年获中国食品科学技术学会科技创新奖技术进步二等奖，本人排名第4；

《基于食品安全的天然活性蜂产品深加工技术及产业化》，2010年获湖南省科技进步三等奖，本人排名第4。

（2）近年申请或授权的专利

①《一种具有高可溶性的大米蛋白的制备方法》（专利号ZL200910311765.6），2011年获国家发明专利授权，第一发明人；

②《一种人工合成的麦胚肽及其制备方法与应用》（申请号201310589424.1），第一发明人；

③《一种从米糠残渣中提取米糠蛋白的方法》（申请号201310589752.1），第一发明人。

5.参考文献

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[3]蒋艳,王泽南,王博,等.碎米蛋白ACE抑制肽制备工艺的研究[J].食品科技,2012（5）:

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[5]陈季旺,陶冠军,姚惠源,等.米糠类阿片拮抗肽的氨基酸序列分析[J].食品科学,2005,26（12）:

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[19]黄文凯,华欲飞,贺大伟,等.超滤处理对大豆肽体外免疫功能的影响[J].食品与生物技术学报,2007,26（5）.

[20]冯永巍.玉米肽制备工艺的优化及其功能饮料的研制[D][D].吉林农业大学,2007.

[21]朱艳华.玉米多肽的制备,理化性质及生物活性的研究[D][J].武汉:

华中农业大学,2007:

3-5.

三、研究方案

1.研究目标、研究内容和拟解决的关键问题

1.1研究目标

（1）通过分离纯化的手段得到1~2条具有免疫活性的短肽；

（2）得到广泛适合酶法制备的免疫活性肽的分离纯化方法，同时为大米免疫活性肽的产业化生产提供最佳的工艺参数。

1.2研究内容

利用分离纯化的手段对酶解物进行分离纯化，采用的方法：

膜分离（纳滤和超滤）→离子交换色谱→疏水作用色谱→凝胶过滤色谱→RP-HPLC。

（1）采用高效液相色谱测定酶解物的分子量分布，以此来选择纳滤把样品中分子量小于160的小分子物质脱去，再用超滤按分子量1000、3000对其进行分离，再用这两个分子段的样去做MTT，选出活性最高的组分；

（2）收集上一步中活性最高的组分进一步进行离子交换，选用阳性离子交换色谱对目标组分进行分离，得到带电荷量不同的组分，用MTT法，选出活性最高的组分；

（3）收集上一步中活性最高的组分进行疏水作用色谱的分离纯化，选出活性最高的组分；

（4）收集活性最高的组分进行凝胶过滤，选出活性最高的组分；

（5）收集活性最高的组分，用RP-HPLC进行进一步的分离纯化，在此可用RP-HPLC反复的进行分离纯化，直到收集的样品可进行活性检测和序列分析；

（6）用Q-TOF质谱仪和电喷雾电离源（ESI）联用对纯化的免疫活性肽进行分子量和氨基酸序列的测定。

1.3拟解决的关键问题

（1）广泛适合酶法制备的免疫活性肽的分离纯化方法的研究；

（2）从细胞水平和分子水平研究大米免疫活性肽的免疫活性。

2.拟采取的研究方法及可行性分析

2.1拟采取的研究方法

采用纳滤、超滤装置，离子交换色谱，极性色谱，反相高效液相色谱，以免疫刺激指数（SI）为考察指标，分离纯化目标酶解物。

2.1.1膜分离

（1）超滤

压力、料液浓度、操作时间、温度、pH等都可以影响超滤膜的分离效果，考虑到保留提取物的免疫活性的提取条件，仅选择研究不同操作压力和操作时间对目标物得率的影响。

表1超滤的实验方案

因素

水平

操作压力（MPa）

操作时间（min）

1

0.05

20

2

0.08

40

3

0.11

60

4

0.14

80

5

0.17

100

（2）纳滤

纳滤膜分离过程部分受渗透压的控制，部分受孔径的控制，部分受电荷的控制，是一个综合的复杂过程。

操作参数不同，纳滤膜的分离性能也不同，如进料的浓度、溶质极性、操作压力、操作温度等对分离性能有明显的影响，考虑为保留酶解物的免疫活性，仅选择不同的操作时间和操作温度对目标物质的膜通量和脱盐率的影响。

在操作温度28℃，料液浓度4%，酶解工艺最优pH条件下，按照表7进行实验，肽液通过截留分子质量为160的纳滤膜进行超滤分离。

以膜通量和脱盐率为指标进行条件的优化选择。

表2纳滤的实验方案

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

2.1.2阴离子离子交换色谱

将纳滤后的样品上样到已经用pH7的磷酸盐缓冲液预平衡的DEAESephroseFastFlow阴离子交换层析柱（Φ2.6×

40cm），先用3~10倍床体积的预平衡缓冲液洗脱至吸光值（220nm）不变，同时收集穿透峰，再用含有0.5~1.0mol/LNaCl的磷酸盐缓冲液进行线性梯度洗脱，收集各个洗脱峰，把收集到的穿透峰和各个洗脱峰组分进行纳滤脱盐，旋蒸浓缩，冷冻干燥，经过MTT选出免疫活性高的组分。

2.1.3疏水作用色谱

将处理好的DA201-C大孔吸附树脂装成2.6×

40cm的玻璃层析柱，浓度30mg/mL的上一步中得到的组分以0.5BV/h流速流经层析柱，上样结束后，用去离子水以1BV/h的流速洗涤层析柱，收集水洗脱液，每15mL收集一管，测定水洗脱液的电导率，但电导率降至与去离子水相当时，用10%、30%、50%、70%、90%的乙醇以1.5mL/min的流速流经层析柱，同时用紫外检测仪检测A220nm，收集各洗脱峰，旋蒸浓缩，冷冻干燥各级洗脱组分，通过MTT选免疫活性最高的组分，以进行下一步的分离纯化。

2.1.4凝胶过滤色谱

将处理好的SephadexG-15（分级范围＜700，一般有活性的肽是3肽到6肽，六肽的分子量在700左右）装成1.6×

100cm的玻璃层析柱，用pH7.0，0.05mol/L（NH4）2CO3缓冲液将上一步中得到的组分配成30mg/mL的溶液，上样量4mL，用同种缓冲液以20mL/h流速洗脱，同时用紫外检测仪检测A220nm，收集各洗脱峰，旋蒸浓缩蒸去（NH4）2CO3和大部分水分，冷冻干燥各级洗脱组分，通过MTT选出免疫活性最高的组分。

可行性分析：

项目组成员长期从事植物源蛋白的研究，其研究内容涉及麦胚蛋白、大米蛋白的分离纯化、酶法改性修饰及功能活性的研究，对植物源蛋白分子特性、结构特性及其功能特性都相当熟悉。

项目组成员熟练掌握了活性肽制备、分离纯化及功能活性的分析技术，已完成麦胚抗氧化肽、异蛇低肽、高蛋白肽乳粉的制备和功能活性研究。

通过酶种筛选及酶解工艺优化制备出了具有较强抗氧化活性的麦胚蛋白酶解物，并采用膜技术和多种色谱从麦胚蛋白抗氧化水解物中分离得到了2个具有较强抗氧化活性的组分，氨基酸组成分析和Q-TOFMS质谱分析鉴定其氨基酸序列分别为Arg-Glu-Trp（REW）、Arg-Val-Phe（RVF）；

所以项目成员能为本项目提供良好的实验指导。

项目组成员在长期从事细胞分子生物学的