最新 丝状真菌常见的筛选标记方法综述精品.docx

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最新丝状真菌常见的筛选标记方法综述精品

丝状真菌常见的筛选标记方法综述

　　摘要：

　随着基因组时代的发展，主要丝状真菌基因组测序基本完成而被广泛应用于工业，农业，等领域。

然而丝状真菌的遗传转化效率极低，为了保证在大量非转化子背景下能筛选到目标转化子，恰当的筛选标记显得尤为重要。

目前，在丝状真菌的遗传转化过程中常用的筛选标记可分为两类:

药物抗性筛选标记和营养缺陷型筛选标记。

但两者均具有一定的局限性，为此科研人员利用最新研究的基因组编辑技术对筛选标记加以修饰改造，以更好地用于遗传筛选。

本文综述了目前常用的遗传筛选系统的分子机制及运用基因组编辑技术改造的新型筛选标记理论，为丝状真菌在各领域更广泛的应用奠定基础。

　　关键词：

　丝状真菌;筛选标记;营养筛选;抗性筛选;基因组编辑;

　　Abstract：

　Withtheboomingofthegenomeera,thewholegenomesequencingofimportantfilamentousfungihasbeenbasicallycompletedandiswidelyusedinthefieldsofindustry,agricultureandmedicine.However,thegenetictransformationefficiencyoffilamentousfungiisextremelylow.Inordertoensurethatpositivetransformantscanbepickedoutfromalargenumberofnon-transformedcolonies.Thereforeappropriateselectablemarkersareparticularlyimportant.Atpresent,thecommonlyusedselectablemarkersinthegenetictransformationoffilamentousfungicanbedividedintotwocategories:

drug-resistanceselectablemarkersandauxotrophicselectablemarkers.However,bothofthemhavedistinctlimitations.Forthisreason,researchersusethelatestgenomeeditingtechnologytomodifytheselectablemarkersforbettergeneticselection.Thisarticlereviewsthecurrentgeneticselectionsystemandnewscreeningmarkertheorymodifiedbygenomeeditingtechnology,whichlaysafoundationforabroaderapplicationprospectoffilamentousfungiinvariousfields.

　　Keyword：

　Filamentousfungi;Selectablemarker;Auxotrophicselection;Drug-resistantselection;Genomicediting;

　　丝状真菌（Filamentousfungi）是一类重要的真核微生物，广泛存在于自然界中，并在工业、农业和医药等领域发挥着重要作用。

例如，里氏木霉（Trichodermareesei）、黑曲霉（Aspergillusniger）和米曲霉（Aspergillusoryzae）被广泛用于生产工业酶制剂（如纤维素酶、葡萄糖淀粉酶和淀粉酶等）和有机酸（如柠檬酸等）。

与细菌、酵母相比，丝状真菌具有较高的蛋白质分泌能力。

例如，传统诱变后的里氏木霉经发酵工艺优化后，自身纤维素酶分泌水平可达40g/L，甚至更高[1]。

而且它还具有转运分泌蛋白到胞外的能力，这对蛋白产物的分离纯化非常有利；目前仅有几种酵母菌的分泌蛋白可达到g/L级的水平[2]，而黑曲霉分泌的葡萄糖淀粉酶水平可达25?

30g/L[3]。

因此，丝状真菌作为细胞工厂生产外源蛋白也受到广泛关注。

除此之外，黑曲霉也是柠檬酸工业化生产的主要发酵菌株，并有科研人员成功构建由原生质体-PEG介导的高产柠檬酸黑曲霉菌株的遗传转化体系，为柠檬酸工业化发展提供可能[4]。

农业上，丝状真菌一方面会引起农作物病害，如引起水稻稻瘟病的病原真菌——稻瘟菌（Magnaporthegrisea）可侵染多种禾本科植物；另一方面则具有生物防治和土壤修复功能，木霉属具有产生多种抗生素物质的能力以及寄生其他真菌的能力，如绿色木霉（Trichoderma　viride）和哈茨木霉（Trichodermaharzianum）可诱导一系列植物产生对多种植物病原体局部和系统的抗性。

当其孢子添加到土壤中时，它们与植物根部接触并在根表面上发芽和生长，同时会产生引发植物防御反应的化合物，除此之外，还可以增加养分吸收和氮利用效率，溶解土壤中的养分，起到修复的作用[5]。

医药上，临床上广泛使用的抗生素——青霉素和头孢菌素分别由产黄青霉（Penicilliumchrysogenum）和顶头孢霉（Cephalosporiumacremonium）产生。

　　在现代生物技术不断发展的今天，遗传操作体系的建立对丝状真菌在各领域的进一步发展具有重要意义。

构巢曲霉（Aspergillusnidulans）和粗糙脉孢菌（Neurosporacrassa）等因结构相对简单而被作为真核微生物的“模式”菌在基础研究领域发挥着不可替代的作用。

1979年首次将DNA重组技术应用于粗糙脉孢菌，这对丝状真菌产物形成的分子基础研究及代谢工程育种具有重大意义[6]。

但大多数非模式丝状真菌的分子遗传学基础研究尚不明确。

近年来，1000个真菌基因组计划的完成（http:

//genome.jgi.doe.gov/）为非模式丝状真菌的研究提供更有力的手段[7]。

在功能基因组时代，从分子遗传水平上深入研究丝状真菌，尽可能发挥其在工业、农业、医药及基础生物研究等方面的作用，对其遗传转化的研究是十分必要的。

　　自1973年Tatum等利用肌醇缺陷型（inl?

）粗糙脉孢菌进行转化实验以来[8]，尤其近10年，丝状真菌遗传转化系统研究发展迅速。

据统计，到目前为止已在100多种丝状真菌中成功进行了转化[9]。

我们课题组长期从事于玉米大斑病菌（Setosphaeriaturcica）、灰葡萄孢（Botrytiscinerea）、谷子弯孢菌（Cochlioboluslunatus）、粟弯孢霉叶斑病菌（Curvularialunata）等丝状真菌在生长，发育及致病性机理相关基因的研究。

如构建玉米大斑病菌的漆酶基因Stlac2敲除突变体，发现该基因参与细胞壁完整性，黑色素生物合成以及附着体和分生孢子形成的重要过程[10]；构建灰葡萄孢致病相关基因的RNAi突变体，探究病菌侵染与致病的分子机制，为制定持久控制灰霉病提供理论依据及实验基础[11,12]；利用RACE技术成功克隆谷子弯孢病菌中编码海藻糖酶基因——citre基因，研究发现该基因参与病菌生长发育及致病过程，为以海藻糖酶为靶位点的化学农药防控研究奠定基础[13]；粟弯孢霉叶斑病是由新月弯孢病菌引起的一种重要谷子叶部病害，通过粟弯孢霉叶斑病菌致病相关基因的克隆和功能分析，对致病机制及防御具有重要指导意义[14]。

然而在基因转化过程中，为保证从大量非转化子背景下能快速筛选到目标转化子或在转化子纯培养过程中避免重组基因的丢失，必须依赖于特异性筛选标记基因，使其在特定的生长压力下得到选择性培养[15]。

　　筛选标记基因可使转化子获得自身所不具备的新的遗传特性；是遗传转化载体所必备的基本元件；是利用特定的选择培养基，筛选转化子的一类特殊标记基因。

目前，常见的筛选标记主要分三类：

第一类为营养筛选，包括氮源和碳源营养基因及营养缺陷型互补型标记基因，通过转入的标记基因与受体菌突变基因互补，使受体菌恢复野生型；第二类为药物抗性标记基因，该基因的转入使受体菌在一定药物浓度下正常生长，表现药物抗性；第三类是功能附加型筛选标记，因质粒携带宿主细胞本身没有的基因而赋予转化子新的基因功能，进行特异性筛选。

　　1营养筛选

　　营养筛选是因营养缺陷型菌株合成或分解代谢途径异常而通过外源物质补救进行遗传转化筛选的方式。

营养缺陷型菌株是指经自然或人为突变致使代谢途径中某一过程发生缺陷，丧失合成某种物质的能力，必须外源添加该营养物质才能正常生长的突变菌株。

目前常用的营养筛选分为两类：

第一类是氮源和碳源营养基因；第二类是营养缺陷型互补基因。

氮源和碳源营养基因标记在受体菌染色体中无同源序列，将标记基因插入到受体菌染色体的特定位点产生突变型表达，结果显示只有转化子能够在含特定氮源或碳源培养基上正常生长，野生型则不能。

此类应用较为广泛的有：

amdS基因、niaD基因、glmS基因等。

营养缺陷型互补基因是通过转入的标记基因与相应营养缺陷型菌株遗传互补恢复正常生长，为转化子提供一种正向选择。

此类应用最为广泛的有pyrG基因、trpC基因、agaA基因及argB基因等。

　　1.1氮源和碳源营养基因

　　1.1.1amdS氮源营养筛选基因

　　构巢曲霉中amdS基因编码的乙酰胺酶能将乙酰胺降解成氨从而获得其生长所需氮源，而黑曲霉、产黄青霉及其它丝状真菌则不能合成此酶，即没有能力利用乙酰胺。

为此，它们只有从载体上获得乙酰胺基因来表达乙酰胺酶，才能在以乙酰胺作为唯一氮源的培养基上正常生长，而不含amdS的野生型则生长较差，实现转化子筛选[16]。

因此，amdS基因是大多数丝状真菌（除构巢曲霉）转化很好的筛选标记。

　　1.1.2niaD氮源营养筛选基因

　　niaD编码的硝酸盐还原酶是真菌氮素代谢过程中的关键酶，可使转化子获得硝酸盐代谢能力。

真菌吸收并利用外界NO3?

需经过2个同化反应：

首先NO3?

经硝酸还原酶还原为NO2?

，再经亚硝酸还原酶还原为NH4+，进一步利用氮源完成氨基酸及蛋白质的合成。

同化反应中两个酶易受外界条件影响导致基因功能缺失，使微生物不能利用硝酸盐。

但niaD功能缺失的突变株能耐受高浓度的氯酸盐[17]，而野生型则不能。

因此，通过氯酸盐的选择易获得niaD自然突变株可用于转化子的筛选。

该筛选基因遗传上比较稳定、对环境无污染、成本较低、为诱导型基因，便于遗传操作，而被广泛用于转化米曲霉、产黄青霉、黑曲霉等重要的工业丝状真菌。

　　1.1.3glmS碳源营养筛选基因

　　glmS基因编码的葡萄糖胺合成酶参与催化氨基己糖合成代谢途径的第一步反应，即氨基在谷氨酰胺和6-磷酸果糖之间转移产生6-磷酸葡萄糖胺，因而又称谷氨酰胺-6-磷酸果糖氨基转移酶[18,19]。

该酶几乎存在于每个物种中，是生命活动所必需的酶。

因此，敲除glmS的宿主菌株只有在外源添加葡萄糖胺为碳源的培养基上才能正常生长。

　　1.2营养缺陷型筛选

　　1.2.1尿嘧啶营养缺陷型筛选

　　1979年，Botstein和Struhl等运用DNA重组技术从酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）中首次得到编码乳清苷-5'-磷酸脱羧酶的ura3基因，并将其作为选择标记构建酿酒酵母转化系统[20,21]。

1984年，Boeke等发现在酿酒酵母中敲除ura3基因可形成尿嘧啶营养缺陷型菌株[22]。

ura3基因编码的乳清苷-5′-磷酸脱羧酶是酵母尿嘧啶核苷酸合成过程中的关键酶，敲除该基因乳清苷-5'-磷酸脱羧酶失活，表现为尿苷或尿嘧啶营养缺陷，只能在添加尿苷或尿嘧啶的培养基上生长。

　　尿嘧啶生物合成途径非常保守，在丝状真菌中也具有类似的生化反应[23]。

黑曲霉中pyrG/pyr4基因，米曲霉中的pyrF基因与酿酒酵母ura3基因均同源，其编码的产物乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶或乳清酸磷酸核糖转移酶是负责乳清苷-5′-磷酸向尿嘧啶生物合成途径中的最后一步尿苷-5′-磷酸转化的酶；敲除pyrG基因使乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶失活，菌株无法合成尿嘧啶。

对于尿苷和尿嘧啶营养缺陷型菌株，则需通过外源补加尿嘧啶进行补救途径。

　　1.2.2色氨酸营养缺陷型筛选

　　L-色氨酸是丝状真菌生长的必需氨基酸之一，但它们不能自身代谢合成，需从外界环境中摄取才能满足其营养物质的需求。

色氨酸操纵子由5个结构基因组成：

trp1、trp2、trp3、trp4和trp5。

trp1基因和trp2基因是在色氨酸的合成中编码色氨酸合成酶的2个亚基[24]，trp3基因编码吲哚-3-甘油磷酸合成酶，trp4基因和trp5基因是编码邻氨基苯甲酸合成酶的2个亚基[25]。

邻氨基苯甲酸合成酶催化由分支酸生成N-氨基苯甲酸，吲哚-3-甘油磷酸合成酶催化N-氨基苯甲酸生成吲哚-3-甘油磷酸，色氨酸合成酶催化最后一步反应生成色氨酸[26]。

沈微等在研究产甘油假丝酵母（CandidaglycerinogenesWL2002-5）的多基因敲除过程中发现磷酸核糖氨基苯甲酸同分异构酶催化由分支酸到色氨酸的生物合成途径的第3步，因其编码基因trp1突变而产生的trp1缺陷型突变株相对容易获得，且该基因又能有效互补宿主酵母的trp1缺陷，因此trp1基因常用作酵母遗传工程中的标记基因[27,28,29,30]。

该基因同样可以作为丝状真菌的营养筛选标记。

1988年，Kim等在粗糙脉孢菌中敲除trp1基因引起菌株的整个色氨酸合成功能障碍，使其不能正常合成色氨酸，导致色氨酸营养缺陷，即在色氨酸缺陷培养基内不能生长[31]。

黑曲霉和产黄青霉的trpC基因类似于粗糙脉孢菌trp1基因，该营养筛选系统已被广泛应用于丝状真菌[32,33]。

　　1.2.3精氨酸酶营养缺陷型筛选

　　agaA基因编码精氨酸酶参与精氨酸转变为鸟氨酸的代谢过程。

2012年，Dave等敲除黑曲霉agaA基因得到精氨酸酶营养缺陷型菌株，并发现2种不同的启动子启动agaA回补基因，得到正常生长的菌株[34]。

当agaA基因缺失时，菌株因无法利用精氨酸合成鸟氨酸而成为营养缺陷型宿主菌。

当外源载体带有agaA基因转化该营养缺陷型菌株，转化子可恢复代谢精氨酸转化为鸟氨酸的能力，即在补加精氨酸的培养基中正常生长[34]。

但该筛选基因目前应用范围较小，目前只在黑曲霉丝状真菌应用成功。

　　1.2.4精氨酸营养缺陷型筛选

　　argB基因编码的鸟氨酸氨甲酰基转移酶催化鸟氨酸转化为精氨酸的过程，参与尿素的合成。

敲除argB基因引起胞内精氨酸缺少导致不能在基本培养基中生长，外源添加精氨酸或瓜氨酸，可使突变株正常生长[35,36]。

体外构建argB基因载体转化到argB营养缺陷型菌株营养缺陷互补，以实现其他基因遗传筛选的目的。

　　1.3致突变型或建立特殊代谢途径的标记

　　营养缺陷型菌株被广泛应用于分子生物学实验，但经突变产生的营养缺陷型菌株不稳定，易回复为野生型，影响转化子的筛选。

因为amdS和pyrG的正向和反向筛选的特异性，使之在多基因敲除过程中，成为了丝状真菌较为常用的筛选标记。

　　在pyrG营养缺陷型筛选的基础上进行改善，发现了一种反筛选药物——5-氟乳清酸（5-FOA），它几乎对所有生物体都有毒性，是乳清酸的结构类似物，可代替乳清酸进入嘧啶合成通路，在乳清酸核苷-5′-单磷酸脱羧酶、胸苷酸合成酶等一系列酶作用下产生对细胞有毒性的物质，导致细胞死亡[37]。

在研究该药物的同时发现该药物与尿嘧啶的生物合成过程有着密切的关系：

在外源添加尿嘧啶满足生长需要的情况下，阻断嘧啶合成通路可使细胞对5-FOA产生抗性[38,39,40]，为此，这可以作为尿嘧啶缺陷型筛选的依据。

由pyrG基因编码的乳清酸核苷-5′-单磷酸脱羧酶，不仅是尿嘧啶合成过程中的关键酶之一[41]，它也可以催化5-FOA合成有毒的5-氟尿嘧啶单磷酸盐[23]，产生很强的细胞毒性，导致野生株在含有5-FOA的培养基中不能完成尿嘧啶营养物的合成，生长受到抑制[42]；但对于尿嘧啶营养缺陷型菌株缺失尿嘧啶核苷酸从头合成途径中的乳清酸磷酸核糖转移酶或乳清酸核苷单磷酸盐脱羧酶，使5-FOA无法形成有毒物质5-氟尿嘧啶单磷酸盐，从而对5-FOA具有抗性[22]，其嘧啶核苷酸营养则可以向培养基加入尿嘧啶通过补救途径给予补充；而5-FOA可以抑制野生型生长。

因此在含尿嘧啶的培养基中加入5-FOA可用于尿嘧啶营养缺陷型突变体的反筛，其筛选效率大大提高，并且减少了回复率。

　　实际操作过程也非常简单，将携带有构巢曲霉的pryG基因的部分片段的质粒，转化构巢曲霉可造成乳清酸核苷-5'-单磷酸脱羧酶功能的缺失，通过5-FOA反筛可得到转化子。

另外，在构巢曲霉中已成功运用5-FOA反筛的方法构建yA和wA突变体[7]。

目前，我们课题组也将5-FOA反筛的方法成功用于玉米大斑病菌的遗传转化筛选。

　　最初丝状真菌转化子的获取多是利用营养筛选，其中营养缺陷型标记易于筛选。

但是，特定营养缺陷型菌株的获取是大多数丝状真菌难以满足的，并且经突变产生的营养缺陷型菌株不稳定，易回复成野生型[43]，严重阻碍了对丝状真菌的遗传工程改造。

所以，抗性筛选在遗传转化中显得尤为重要：

可直接用野生型菌株完成转化和筛选，无需特定的营养缺陷型菌株。

　　2抗性筛选

　　抗性筛选是将抗性基因转入受体菌中使其在一定药物浓度下生长而表现抗药性的一类筛选方式。

目前常用的抗性筛选标记基因分为抗生素抗性基因和除草剂抗性基因两类。

抗生素类药物对细胞生长的抑制作用主要在于影响细胞壁的形成和细胞膜的功能、抑制核酸或蛋白质的生物合成[44]。

常用的抗生素包括潮霉素、遗传霉素、寡霉素、博来霉素及苯菌灵。

除草剂类药物主要作用于除草剂的有效成分使其丧失活性，如：

草胺膦。

　　一般要求选择抗生素或除草剂的种类和浓度既要能有效抑制非转化子的生长又不影响转化子的正常生长。

由于不同受体菌对不同种类和浓度的抗生素或除草剂敏感程度及毒害耐受程度存在较大差异，因此，确定适宜的选择抗生素或除草剂种类和浓度对筛选转化子至关重要。

　　2.1抗生素抗性基因筛选

　　2.1.1潮霉素抗性筛选

　　潮霉素磷酸转移酶基因产物的作用底物潮霉素B（HygromycinB）是由吸水链霉菌（Streptomyceshygroscopicus）产生的抑制原核和真核生物蛋白质合成的氨基糖苷类抗生素[45]，可破坏细胞核中核糖体的功能，导致基因翻译受阻，蛋白质合成受到抑制。

潮霉素磷酸转移酶可将磷酸基团共价地加到潮霉素B的第4位羟基上，发生磷酸化而失去活性，使受体菌产生潮霉素抗性。

1988年，Wang等构建了含有潮霉素磷酸转移酶基因的质粒载体pHL1转化致病真菌——黑粉菌（Ustilagomaydis）获得了具有潮霉素抗性的转化子[46]。

1989年，Punt等构建了来源于构巢曲霉的强三磷酸甘油醛脱氢酶启动子调控下的潮霉素磷酸转移酶基因的质粒载体pAN7-1[47]。

目前，pAN7-1常被用作丝状真菌的整合转化并获得理想的效果[48]。

近些年，我们课题组利用潮霉素抗性筛选灰葡萄孢的T-DNA插入突变体库，获得了一株致病力增强的突变体BCt98，为研究灰葡萄孢侵染及致病机理奠定基础[49,50]。

多数真菌对潮霉素B较其他抗生素表现出更高的敏感性，尽管一些真菌种类需要较高的潮霉素B的浓度来抑制其生长，但在浓度50?

400?

g/mL的范围内可以抑制大多数真核微生物的生长[51]。

　　2.1.2新霉素抗性筛选

　　新霉素（Neomycin）抗性基因neor，编码氨基糖苷磷酸转移酶，该酶可使氨基糖苷抗生素G418（新霉素衍生物）失活。

G418通过抑制80S核糖体的功能来阻断蛋白质的合成进而杀死细胞[52]。

当neo基因被整合到基因组后，则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA，以获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。

并且neo抗性基因序列较短，易获取。

因此，G418抗性筛选系统已被广泛地用作丝状真菌转化。

　　据报道，为给谢瓦氏曲霉间型变种（Aspergilluschevalierivar.Intermedius）多基因功能的研究提供新的选择标记，采用构巢曲霉三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子PgpdA、nptⅡ基因和构巢曲霉色氨酸C终止子TtrpC组成的G418抗性基因替换双元载体pDHt/sk-bar上的草丁膦抗性，成功构建双元载体pDHt/sk-nt，并且通过根癌农杆菌介导的转化获得的G418抗性转化子[53]。

　　2.1.3寡霉素抗性筛选

　　寡霉素（Oligomycin）抗生素是由Smith等首次从淀粉酶产色链霉菌（Streptomycesdiastatochromogenes）中分离得到的一类结构相似的二十六元环大环内酯类抗体络合物[54]，是一种醇溶性的结晶，具有强烈的抗肿瘤、抗真菌、呼吸抑制作用及杀虫等生物学活性，被广泛应用于科学研究。

1958年，Lardy等报道寡霉素是线粒体ATP合酶参与氧化磷酸化能量转移的有效抑制剂之一[55]。

20世纪60年代Racker等研究表明，线粒体ATP合酶可分为两部分，耦合因子F1和F0，前者含有ATP合成的催化位点而后者可产生寡霉素抗性[56,57,58]。

寡霉素与F0结合可特异地抑制氢的运输，直接干扰ATP的生成过程。

目前，寡霉素的抗性蛋白常用于筛选对这种抗生素敏感的丝状真菌的转化子。

研究发现构巢曲霉和黑曲霉的oliC31和oliC3基因编码线粒体ATP合酶亚基9的抗寡霉素变体，将其基因转化构巢曲霉和黑曲霉后，可直接选择寡霉素抗性[59,60]。

即在含有寡霉素的培养基中筛选到的抗性转化子。

但寡霉素抗性作为一种半显性抗性具有种的特性，其应用受到一定限制。

　　2.1.4博来霉素抗性筛选

　　博来霉素（Bleomycin，BLM）是1966年从轮枝链霉菌（Streptomycesverticillus）分离出的一种碱性水溶性糖肽类抗肿瘤抗生素。

blmVIII编码一个聚酮合成酶，其由1个酮基合成酶，1个酰基转移酶，1个甲基转移酶等多个功能域组成[61]，采用λRED介导的PCR定向突变使轮枝链霉菌中的blmVIII基因缺失，丧失了合成BLM的能力，说明blmVIII是BLM生物合成的过程中必不可少的基因[62]。

blmC、blmD、blmE、blmF、blmH、blmG被鉴定为糖基生物合成基因，负责BLM中相应糖基的合成。

blmA和blmB是编码BLM结合蛋白的基因，有可能负责产生自身对BLM的抗性。

X射线晶体结构测定表明blmA通过N末端臂交换形成二聚体[63]，推测blmA和BLM可能通过碱性抗生素与酸性蛋白之间的静电而相互作用，在Fe2+的螯合作用下，它们的亲和力大大提高，通过药物隔离使得轮枝链霉菌自身产生抗药性[64]。

BLMB是BLM的一个N-乙酰转移酶，在乙酰辅酶A的作用下，N-乙酰化修饰BLM中的β-氨基丙胺酰胺的伯胺，其对金属离子结合是非常关键的，乙酰化的BLM将不能螯合金属离子而失活[65]。

因此，敲除与BLM生物合成相关的一个必需基因，就会导致菌株在含有博来霉素抗生素的培养基中死亡以达到筛选的作用。

　　2.1.5苯菌灵抗性筛选

　　苯菌灵（Benomyl）属于苯并咪唑类杀菌剂，该类杀菌剂主要作用于病原菌的β-微管蛋白，阻止纺锤丝的形成，干扰细胞核的分裂，对子囊菌亚门、半知菌亚门及部分担子菌亚门真菌