学年同步备课套餐之生物浙科版选修3讲义第.docx

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学年同步备课套餐之生物浙科版选修3讲义第

第2课时　获取目的基因、构建基因表达载体

[学习导航]　1.概述获取目的基因的方法，特别说明PCR的原理。

2.结合图1－10，说出基因表达载体的构建。

[重难点击]　获取目的基因的途径及基因表达载体的构建。

方式一　抑制疾病传播的转基因蚊子

巴西等拉美国家深受致倦库蚊的危害。

致倦库蚊可携带多种病毒和寄生虫，能够传播脑炎、丝虫等传染病，而这些传染病常年在拉美国家肆虐。

为了抑制疾病的传播，巴西科学家培育出了一种转基因雄性致倦库蚊。

科学家在雄性致倦库蚊体内植入一种特殊基因，当具该基因的转基因雄蚊与野生雌蚊交配时，这种基因可以进入雌蚊的基因组，并使雌蚊死亡，从而减少了该种蚊子的数量，达到抑制疾病传播的目的。

怎样才能最终得到转基因雄蚊呢？

让我们一起来学习基因工程的基本操作程序吧！

方式二　师：

出示我国有知识产权的转基因抗虫棉的培育图解：

问：

转基因抗虫棉的培育需要哪些步骤？

学生看图并回答：

首先要获得目的基因，其次将目的基因连接到Ti质粒上，然后将重组的Ti质粒导入受体细胞，最后要重建转基因植物。

根据学生回答补充：

还需检测抗虫基因是否已经进入棉花植株，并由此引出基因工程的四部曲。

一、获取目的基因

1．通过基因文库获取目的基因

（1）概念

先用酶切等方法将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片段，再将这些片段分别和载体连接起来，导入受体菌的群体并储存起来，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，这个群体称为基因文库。

（2）种类

2．通过PCR技术扩增目的基因

（1）原理：

DNA分子半保留复制。

（2）基本过程

①加入反应物质：

在离心管中加入所需要的模板DNA、引物、4种脱氧核苷酸以及TaqDNA聚合酶。

②变性：

加热至94℃左右，使DNA中的氢键断裂，双链解开。

③退火（复性）：

冷却到55℃左右，引物与单链DNA相应互补序列结合。

④延伸：

加热至72℃左右，在TaqDNA聚合酶的作用下，沿模板延伸子链，最终合成2条DNA分子。

（3）若PCR过程中，扩增循环的次数是n，则目的基因的量将被扩增2n倍。

（4）PCR技术中因为需要在高温下进行，因此TaqDNA聚合酶需要有什么特性？

答案　具有热稳定性。

3．通过化学方法直接人工合成目的基因

如果目的基因较小，脱氧核苷酸序列又已知，可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。

1．从基因文库中获取目的基因

（1）cDNA文库是从某种生物的某一细胞中提取出mRNA，经逆转录过程获得的基因文库，为什么该基因文库仅含有该生物的部分基因？

答案　由于基因的选择性表达，某种生物的某一细胞中仅有部分基因转录出mRNA，所以由该细胞中的mRNA逆转录得到的基因文库仅含该生物的部分基因。

（2）结合概念，从范围上比较基因组文库和cDNA文库（部分基因文库）之间的大小关系：

基因组文库>cDNA文库。

（3）基因文库的组建过程所包含基因工程的步骤

①目的基因的获取：

将某种生物体内的DNA全部提取出来，选用适当的限制酶，将DNA切成一定范围大小的DNA片段。

②重组质粒的构建：

将所获得的DNA片段分别与载体连接起来。

③目的基因导入受体细胞：

将重组质粒导入受体菌的群体中储存。

2．PCR技术与DNA复制的比较

比较项目

DNA复制

PCR技术

区别

解旋方式

解旋酶催化

DNA在高温下变性解旋

场所

细胞内（主要在细胞核内）

细胞外（主要在PCR扩增仪中）

酶

解旋酶、DNA聚合酶

热稳定的DNA聚合酶

温度

细胞内温和条件

控制温度，需在较高温度下进行

结果

合成DNA分子

合成DNA片段或基因

联系

（1）模板：

均需要脱氧核苷酸双链作为模板

（2）原料：

均为四种脱氧核苷酸

（3）酶：

均需DNA聚合酶

（4）引物：

都需要引物，使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成

归纳总结　两种人工合成目的基因的方法比较

（1）逆转录法

主要用于相对分子质量较大而又不知其序列的基因，它是以目的基因的mRNA为模板，借助逆转录酶合成碱基互补的单链DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA。

其过程如下图：

（2）化学合成法

即依照某一蛋白质的氨基酸序列，通过密码子推算出其基因序列，然后直接合成目的基因。

其过程如下图：

由于真核细胞的基因含有不表达的DNA片段，不能直接用于基因的扩增和表达，因此，在获取真核细胞中的目的基因时，一般是用人工合成目的基因的方法。

1．为从根本上解决水稻中的高植酸问题，可将植酸酶基因导入水稻，培育低植酸转基因水稻品种。

下图是获取植酸酶基因的流程。

据图回答下列问题：

（1）B过程需要的酶是____________。

（2）图中基因组文库________（填“小于”“大于”或“等于”）cDNA文库。

（3）目的基因Ⅰ和Ⅱ除可从构建的文库中分离外，还可以分别利用图中________和________为模板直接进行PCR扩增，该过程中所用酶的显著特点是____________。

答案　

（1）逆转录酶　

（2）大于　（3）DNA　cDNA　耐高温

解析　B过程是以RNA为模板合成DNA的逆转录过程，需要的酶是逆转录酶；目的基因Ⅰ和Ⅱ除可从构建的文库中分离外，还可以分别利用图中DNA和cDNA为模板直接进行PCR扩增，该过程中所用酶的显著特点是耐高温。

一题多变

判断正误：

（1）直接分离目的基因的方法其优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性（　　）

（2）由于真核细胞的基因含有不表达的DNA片段，一般使用人工合成的方法（　　）

（3）目前人工合成目的基因的方法主要有两种，分别是逆转录法和化学合成法（　　）

（4）PCR技术的原理是DNA复制，需要RNA聚合酶催化DNA合成（　　）

答案　

（1）√　

（2）√　（3）√　（4）×

解析　PCR技术扩增的原理是DNA半保留复制，需要耐高温的DNA聚合酶催化，并以脱氧核苷酸为原料。

易错辨析

　认清基因组文库法与逆转录法获取目的基因的不同

（1）酶：

前者需要限制酶；后者需要逆转录酶。

（2）原料：

前者不需要原料；后者需要脱氧核苷酸。

（3）结构：

前者基因中含有启动子，能转录；后者基因中没有启动子，只将编码序列导入受体细胞，故无法进行转录。

2．以下为形成cDNA（图中的单链DNA）过程和PCR扩增过程示意图。

据图分析，下列说法正确的是（　　）

A．催化①过程的酶是RNA聚合酶

B．④过程发生的变化是引物与单链DNA结合

C．催化②⑤过程的酶都是DNA聚合酶，都能耐高温

D．如果RNA单链中A与U之和占该链碱基含量的40%，则一个双链DNA中，A与U之和也占该DNA碱基含量的40%

答案　B

解析　由题意可知，①②③④⑤分别表示逆转录、DNA的复制、DNA解链、引物结合到互补DNA单链及互补链的合成，B正确；①过程由逆转录酶催化完成，A错；催化②⑤过程的酶都是DNA聚合酶，过程⑤是在72℃的高温条件下进行的，只有该过程中的酶需耐高温，C错；在DNA分子中有T无U，D错。

3．如图表示基因工程中获取水稻某目的基因的不同方法。

下列相关叙述中正确的是（　　）

A．三种方法都需要酶并均在体外进行

B．①②③碱基对的排列顺序均相同

C．三种方法均属于人工合成法

D．方法a不遵循中心法则

答案　A

解析　这三种方法都是在体外进行的，且都用到酶（方法a需要逆转录酶和DNA聚合酶；方法b需要限制酶；方法c需要DNA聚合酶），A正确；通过方法a得到的目的基因不含有内含子，通过方法c得到的目的基因的碱基序列可能有多种，因此①②③碱基对的排列顺序不都相同，B错误；图示a和c属于人工合成法，而b是从供体细胞的DNA中直接分离目的基因的方法，C错误；方法a遵循中心法则，D错误。

二、构建基因表达载体

基因表达载体的构建（如图）

（1）启动子：

位于目的基因上游的一段核苷酸序列，是RNA聚合酶识别、结合的部位，能驱动基因转录合成相应的mRNA。

（2）终止子：

是一段特殊的DNA片段，是载体上终止目的基因转录的核苷酸序列。

（3）标记基因：

是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因。

常用的标记基因主要是抗性基因、某些生化表型基因。

（4）目的基因：

目的基因插在启动子和终止子之间。

结合基因表达载体模式图分析以下问题：

1．用字母和文字表示基因表达载体的组成。

答案　基因表达载体的组成：

[a]启动子＋[b]终止子＋[c]标记基因＋[d]复制原点＋[e]目的基因。

2．启动子和终止子与起始密码子和终止密码子是一回事吗？

答案　不是一回事，启动子和终止子位于DNA上，是基因表达载体必需的部分。

而起始密码子和终止密码子位于mRNA上，决定翻译的开始和结束。

3．为什么目的基因要插入启动子和终止子之间？

答案　启动子使转录开始，是RNA聚合酶识别和结合的部位；终止子位于基因的尾端，使转录终止；只有顺序正确，目的基因才能正常转录。

4．下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。

请据图回答下列问题：

限制酶

BamHⅠ

HindⅢ

EcoRⅠ

SmaⅠ

识别序列及切割位点

（1）结合下图重组质粒的构建过程分析：

图中①为同一种限制酶，②为DNA连接酶。

（2）构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ酶切割质粒？

为什么？

答案　不能。

因为SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因。

质粒上的抗性基因是标记基因。

标记基因用于鉴定受体细胞是否成功导入目的基因，以便将含目的基因的细胞筛选出来，若被破坏，无法进一步筛选。

（3）与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么？

答案　可以防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化。

总结提升　1选用同一种限制酶切割目的基因和载体的原因：

选用同一种限制酶切割会产生相同的黏性末端，可以在DNA连接酶的作用下将切割的目的基因和载体连接起来。

2基因工程操作时往往用两种限制酶分别切割目的基因的两端以及载体的原因：

①如果用一种限制酶切割，目的基因两侧的末端以及质粒切口的两个末端都是互补的，因此连接时可能会出现载体与载体、目的基因与目的基因、目的基因与载体三种连接情况，而符合要求的只有载体与目的基因的连接。

②如果用两种不同的限制酶进行切割就可以有效避免载体与载体以及目的基因与目的基因的连接，提高连接的有效性。

4．下图为基因表达载体的模式图，下列有关基因工程中载体的说法，错误的是（　　）

A．基因表达载体的构建是在生物体外完成的

B．任何基因表达载体的构建都是一样的，没有差别

C．图中启动子位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位

D．抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因

答案　B

解析　由于受体细胞有植物、动物和微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方式不同，所以基因表达载体的构建也会有所差别，不可能千篇一律。

5．如图是利用基因工程技术培育转基因植物生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性核酸内切酶。

下列说法错误的是（　　）

A．图示过程是基因工程的核心步骤

B．表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠ

C．抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来

D．除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构

答案　B

解析　图示过程为基因表达载体的构建过程，是基因工程中的核心步骤。

构建过程中需要将目的基因完整切割下来，此时要用到限制酶PstⅠ、EcoRⅠ。

限制酶SmaⅠ不可用，它会破坏目的基因的完整性。

抗卡那霉素基因是标记基因，目的是便于鉴定和筛选含有目的基因的细胞。

基因表达载体包括启动子、目的基因、终止子和标记基因等。

1．基因工程的基本操作程序有：

①使目的基因与载体相结合；②将目的基因导入受体细胞；③检测目的基因的表达是否符合特定性状要求；④获取目的基因。

正确的操作顺序是（　　）

A．③②④①B．②④①③

C．④①②③D．③④①②

答案　C

解析　基因工程的主要操作步骤顺序是：

获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测和鉴定。

2．如图为基因表达载体的模式图，若结构X是表达载体所必需的，则X最可能是（　　）

A．氨苄青霉素抗性基因

B．启动子

C．限制酶

D．DNA连接酶

答案　B

解析　启动子是该表达载体所必需的，它应位于插入基因的前端，功能是启动插入基因的转录过程。

3．以下甲、乙两图表示从细菌细胞中获取目的基因的两种方法，下列说法中错误的是（　　）

A．甲方法可建立该细菌的基因组文库

B．乙方法可建立该细菌的cDNA文库

C．甲方法要以脱氧核苷酸为原料

D．乙方法需要逆转录酶参与

答案　C

解析　甲方法是从细菌的DNA中直接提取，故可以建立该细菌的基因组文库；乙方法是由mRNA逆转录获取目的基因，故可以建立该细菌的cDNA文库。

乙方法需要逆转录酶并以脱氧核苷酸为原料。

4．下列有关PCR技术的说法，不正确的是（　　）

A．PCR技术的原理是DNA双链复制

B．PCR扩增中必须有解旋酶才能解开双链DNA

C．PCR是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术

D．利用PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列

答案　B

解析　PCR扩增中不使用解旋酶，是利用高温破坏氢键解开双链DNA的，B错误。

5．下图为含铁量较高的转基因水稻的培育过程示意图，请分析回答下列问题：

（1）获得铁结合蛋白基因有两条途径：

一是以铁结合蛋白基因的mRNA为模板，在逆转录酶的催化下，合成互补的单链DNA，然后在__________作用下合成双链DNA，从而获得所需基因；二是根据目标蛋白质的__________序列，推测出相应的mRNA序列，再推测其DNA的序列，利用________________（仪器）合成目的基因。

（2）重组Ti质粒的结构除了含有标记基因、目的基因、终止子和复制原点外，还必须有________________，它是____________结合的部位。

答案　

（1）DNA聚合酶　氨基酸　DNA合成仪　

（2）启动子　RNA聚合酶

课时作业

[学考达标]

1．基因工程的核心是（　　）

A．目的基因的获取

B．基因表达载体的构建

C．将目的基因导入受体细胞

D．目的基因的检测与鉴定

答案　B

解析　构建目的基因表达载体后才能使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能发挥作用；只有构建表达载体后，才能根据载体上的标记基因鉴别目的基因是否导入了受体细胞，从而筛选出含目的基因的受体细胞，避免进行无效工作。

2．下列属于PCR技术的条件的是（　　）

①单链的脱氧核苷酸序列引物　②目的基因所在的DNA片段　③脱氧核苷酸　④核糖核苷酸　⑤DNA连接酶　⑥DNA聚合酶　⑦限制性核酸内切酶

A．①②③⑤B．①②③⑥

C．①②③⑤⑦D．①②④⑤⑦

答案　B

解析　PCR技术需要一对引物，即一对单链的脱氧核苷酸序列引物，①正确；PCR技术需要模板，即目的基因所在的DNA片段，②正确；需要脱氧核苷酸作为原料，③正确；核糖核苷酸是合成RNA的原料，而PCR合成的是DNA，④错误；采用PCR合成DNA时，不需要DNA连接酶，而需要DNA聚合酶，⑤错误、⑥正确；体外合成DNA时，不需要限制性核酸内切酶，⑦错误。

3．下列关于cDNA文库和基因组文库的说法中，正确的是（　　）

A．同一物种的cDNA文库只有1种

B．某真核生物的cDNA文库中的某基因一定比基因组文库中的该基因短

C．可以利用逆转录法获取cDNA文库和基因组文库

D．只有cDNA文库的基因可实现物种间的基因交流

答案　B

解析　由于cDNA文库中只含有某种生物的部分基因，因此该种基因文库可能有多种，A错误；mRNA是由基因中的外显子转录形成的，因此cDNA文库中的基因不包含启动子和内含子等结构，与该生物的基因组文库中的基因结构不同，B正确；可以利用逆转录法获取cDNA文库，而不能获得基因组文库，C错误；cDNA文库可以进行物种间的基因交流，基因组文库中部分基因也可实现物种间的基因交流，D错误。

4．下列关于构建基因表达载体的相关叙述中，不正确的是（　　）

A．需要限制酶和DNA连接酶

B．抗生素抗性基因可作为标记基因

C．在细胞外进行

D．启动子位于目的基因的首端，是启动翻译的一段DNA序列

答案　D

解析　构建基因表达载体过程中需要用限制酶切割目的基因和载体，最后用DNA连接酶把目的基因和载体连接起来，A正确；抗生素抗性基因一般可以用作标记基因，B正确；基因表达载体的构建过程一般在体外进行，C正确；启动子位于目的基因的首端，是启动转录的一段DNA序列，D错误。

5．下列对基因表达载体构建的叙述，不正确的是（　　）

A．需要限制酶和DNA连接酶等特殊工具

B．基因表达载体中有的含有启动子和密码子

C．标记基因不一定是抗生素抗性基因

D．基因表达载体的构建是基因工程的核心

答案　B

解析　基因表达载体是目的基因与载体的结合，在此过程中需用同一种限制酶切割目的基因与载体，用DNA连接酶将相同的末端连接起来，A正确；基因表达载体含有启动子、终止子、标记基因和目的基因，密码子位于mRNA上，B错误；抗生素抗性基因可作为标记基因，但标记基因不都是抗生素抗性基因，C正确；基因表达载体的构建是基因工程的核心，在细胞外进行，使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用，D正确。

6．下列哪项不是表达载体所必需的组成成分（　　）

A．目的基因B．启动子

C．终止子D．抗青霉素基因

答案　D

解析　A、B、C三项均为表达载体的必要的组成成分；具有标记基因也是表达载体所必需的组成成分，但抗青霉素基因只是标记基因中的一种，不是所有的表达载体都必需含有。

[高考提能]

7．PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，下列有关PCR过程的叙述，不正确的是（　　）

A．变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键

B．复性过程中引物与DNA模板链的结合依靠碱基互补配对原则完成

C．延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸

D．PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高

答案　C

解析　高温变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，A正确；低温复性过程中引物与DNA模板链的结合依靠碱基互补配对原则完成，B正确；中温延伸过程中需要热稳定的DNA聚合酶、ATP、四种脱氧核糖核苷酸，C错误；PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高，D正确。

8．“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物（注：

引物的作用是与模板链形成双链后在DNA聚合酶的作用下就可以继续链的延伸），两种引物及其与模板链的结合位置如下图甲所示。

经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，如下图乙所示，其中第⑤种DNA分子有几个（　　）

A．8B．6C．4D．2

答案　A

解析　由图分析可知：

X基因第一次复制得到两个两种DNA分子：

①和②；X基因第二次复制得到四个四种DNA分子：

①复制得①和③、②复制得②和④；X基因第三次复制得到八个五种DNA分子：

①复制得①和③、③复制得③和⑤、②复制得②和④、④复制得④和⑤；X基因第四次复制得到16个五种DNA分子：

①复制得①和③、②复制得②和④、两个③复制得两个③和两个⑤、两个④复制得两个④和两个⑤、两个⑤得到4个⑤。

从上面的推测可知，第四轮循环产物中有8个⑤。

9．下图表示基因工程中目的基因的获取示意图，不正确的是（　　）

A．③表示PCR技术，用来扩增目的基因

B．从基因文库中要得到所需的目的基因可以根据目的基因的相关信息来获取

C．若获取的目的基因相同，则图中基因组文库小于cDNA文库

D．若基因比较小，核苷酸序列又已知，则可以直接通过人工合成的方法获取

答案　C

解析　可以利用PCR技术，大量扩增目的基因，A正确；可以根据目的基因的相关信息，如核苷酸序列、基因功能、基因在染色体上的位置等，从基因文库中得到所需的目的基因，B正确；基因组文库包括一种生物所有的基因，cDNA文库只包含一种生物的部分基因，故基因组文库大于cDNA文库，C错误；若基因比较小，核苷酸序列又已知，则可以直接通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成，D正确。

10．在基因表达载体的构建中，下列说法不正确的是（　　）

①一个基因表达载体的组成只包括目的基因、启动子、终止子　②有了启动子才能驱动目的基因转录出mRNA　③终止子的作用是使转录在所需要的地方停止　④所有基因表达载体的构建是完全相同的

A．②③B．①④C．①②D．③④

答案　B

解析　基因表达载体的组成包括目的基因、标记基因、启动子、终止子，①错误；有了启动子才能驱动目的基因转录出mRNA，②正确；终止子的作用是使转录在所需要的地方停止，③正确；由于受体细胞有植物、动物以及微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此基因表达载体的构建不是完全相同的，④错误。

11．家蚕细胞具有高效表达外源基因的能力，将人的干扰素基因导入家蚕细胞并大规模培养，可以从家蚕细胞中提取干扰素用于制药。

（1）在人的DNA分子上获取干扰素基因时，要用到限制酶。

假设该限制酶能专一性地识别DNA上GAATTC序列，并在某一位点切割某化学键，该化学键是______。

A．G与A之间的键B．G与C之间的键

C．A与T之间的键D．两个核苷酸之间的键

（2）在此基因工程操作过程中的核心步骤是__________________________________。

启动子位于基因的__________，是__________________识别和结合的部位。

（3）人的干扰素基因一般来自cDNA文库，其属于______________（填“基因组”或“部分基因”）文库。

（4）通过PCR技术可大量获取目的基因，PCR技术的原理是____________________。

答案　

（1）D　

（2）构建基因表达载体　首端　RNA聚合酶　（3）部分基因　（4）DNA分子半保留复制

解析　

（1）该限制酶切割的是识别序列上两个核苷酸之间的磷酸二酯键。

（2）基因工程的核心步骤是第二步：

构建基因表达载体。

在基因表达载体上，目的基因的首端（上游）是启动子，这是一段特殊的DNA片段，是RNA聚合酶识别和结合的位点，启动目的基因的转录。

（3）cDNA文库属于部分基因文库，它只含有该种生物的部分基因。

（4）PCR技术是一种体外DNA复制技术，原理是DNA双链复制。

12．我国曾经发生过因“非典型性肺炎”而死亡的病例，经研究发现，该病是由SARS病毒（一种RNA病毒）感染所引起的疾病。

SARS病毒表面的S蛋白是主要的病毒抗原，在SARS病人康复后的血清中有抗S蛋白的特异性抗体。

某研究小组为了研制预防SARS病毒的疫苗，开展了前期研究工作，其简要的操作流程如图，请据图回答下列问题：

（1）实验步骤①所代表的反应过程是______________________________________。

（2）步骤②构建重组表达载体A和重组表达载体B必须使用限制性核酸内切酶和___