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牙刷、果核、饮料罐、水杯、面罩及咬痕等。
原理:
在Chelex中参加蛋白酶K,有助于口腔上皮细胞的消化。
操作步骤
1、取3×
3mm2唾液斑样品〔过滤嘴纸质外层、唾液斑转移纱线〕或剪取牙刷刷毛1束,放入0.5ml的离心管中,参加0.5ml纯水,振荡混匀,室温浸泡15-30分钟。
2、13,000rpm离心3分钟,去除上清液,保存载体。
3、参加100μl5%Chelex-100溶液和5μl2mg/ml蛋白酶K,56°
C保温2小时以上,
振荡5-10秒。
4、沸水中煮8分钟〔或在热循环仪上100°
C保温8分钟〕,振荡5-10秒。
5、13,000rpm离心3分钟,4°
C保存备用。
1、多枚烟蒂应分别放入不同纸袋内送检,标明商标和提取地点。
2、口腔拭子应在室温下自然晾干,放纸袋内送检。
3、饮料罐、水杯口上的唾液斑可分两步提取转移,先用湿棉签或纱布擦拭,再用干棉签或纱布擦拭,一并放入离心管中提取DNA。
擦拭时尽量少用载体。
4、对于量少的检材可不经水洗,直接参加5%Chelex-100溶液和蛋白酶K保温。
Chelex法提取组织DNA
人体的各种器官组织如心脏、脑、肌肉、软骨及毛根等。
在5%的Chelex-100中参加蛋白酶K溶液,有助于组织细胞的消化和DNA释放。
1、剪取组织约1mg,放入0.5ml的离心管中,参加200μl5%Chelex-100溶液和10μl的2mg/ml蛋白酶K;
剪单根毛发的毛根,参加50μl5%Chelex-100溶液和5μl2mg/ml的蛋白酶K,56º
C保温2小时以上,振荡5-10秒。
2、沸水中煮8分钟〔或在热循环仪上100º
C保温8分钟〕,振荡5-10秒。
3、13,000rpm离心3分钟,4º
C保存备用。
考前须知
1、燃烧的尸体应取深层肌肉,严重腐烂尸体应提取软骨。
2、多根毛发的毛根应分别提取DNA。
3、带毛根的毛发枯燥状态下保存送检,组织应冷冻保存送检。
4、组织DNA含量较大,取材时不要过量。
5、假设组织外表较脏,应先用纯水冲洗,去除烟尘、泥土等杂质。
6、毛根外表假设粘有血迹或其他斑迹,应先用脱脂棉蘸纯水擦拭干净。
Chelex法提取指〔趾〕甲DNA
适用范围
该方法适用于人类指〔趾〕甲。
原理
指〔趾〕甲的主要成份为α-角蛋白,也含有人体细胞。
在二硫代苏糖醇〔DTT〕存在的条件下,蛋白酶K可将α-角蛋白水解,在高温下破坏细胞内的膜构造,释放出细胞内的线粒体DNA、核DNA。
样品外表清洁,面积在5mm2以上。
1、清洁指〔趾〕甲的外表:
先用洗涤剂或去污剂的稀释溶液擦洗指〔趾〕甲的外表,然后用手术刀片再刮
去一层外表,最后用纯水清洗,取出后用滤纸压干。
2、将适量指〔趾〕甲样品剪为碎片,转移至0.5ml的离心管中,参加100µ
l5%Chelex-100溶液,10µ
l4MDTT溶液,10µ
l5mg/ml蛋白酶K溶液,混匀,56°
C保温4小时以上。
3、沸水中煮8分钟〔或在热循环仪上100º
4、13,000rpm离心5分钟,4°
1、对于一些难于酶解的检材可以适时、适量补加蛋白酶K。
2、Chelex法提取后的检材,可使用Promega公司的DNAIQ系统进展纯化,浓缩。
Chelex-100法提取混合斑中女性DNA
该方法适用于混合斑中女性DNA的提取。
在没有DTT存在的情况下,混合斑中的精子不会裂解释放出DNA,用Chelex-100法提取到的混合斑中DNA主要为女性DNA。
3mm2混合斑检材放入0.5ml的离心管中,参加200μl5%Chelex-100溶液和10μl2mg/ml蛋白酶K,56º
C保温1小时以上,振荡5-10秒。
2、13,000rpm离心3分钟,吸取上清液至0.5ml的离心管中,沸水中煮8分钟〔或在热循环仪上100º
1、通常STR检验分型结果为单一的女性基因型,男性谱带的峰值很低,与背景噪音相当。
2、特殊情形下,如混合斑中假设混有男性血或含有大量男性上皮细胞等,那么STR分型为混合谱带。
Chelex法提取混合斑中精子DNA
该方法适用于阴道拭子和各种载体上含有精子的混合斑。
利用女性上皮细胞与精子构造上的差异,首先在蛋白酶K和SDS作用下裂解上皮细胞,别离去除上清(女性DNA)、保存沉淀(精子的头部),漂洗去除残留的女性DNA;
在DTT、蛋白酶K、Chelex(螯合树脂,防止煮沸过程中DNA的降解)存在的情况下,进展二次消化,释放出精子DNA。
1、将带有精子的检材约2cm2剪碎,装入1.5ml离心管A中,加lmlTNE溶液或去离子水,37℃浸泡30分钟。
〔可13000rpm离心3分钟,后取100ul上清溶液做抗人前列腺特异抗原〔PSA〕金标试剂条检验,再在A管中补加100ul的TNE,振荡〕然后参加10%SDS〔约100ul〕至终浓度1%,加蛋白酶K〔约10ul〕至终浓度100ug/ml,37℃保温2小时以上〔时间长些效果会更好,因而可过夜〕。
2、套管离心〔将A管底部用针穿一个洞,套在另一个管B中〕,13000rpm离心5分钟〔或可用5000rpm离心10分钟、或可用10000rpm离心8分钟〕,弃A管。
3、弃B管中上清液,沉淀物参加1mlTNE溶液或去离子水振荡重悬,13000rpm离心5分钟离心,弃上清液;
如此反复漂洗一至五次,后B管中保存20-30ul的液量做精子DNA提取。
〔沉淀物可保存一半以备女性物质去除不净时再次进展消化。
〕
4、沉淀物中参加200ul5%Chelex-l00溶液、20ul10mg/ml蛋白酶K和10ul1MDTT,56℃30分钟至4小时〔或过夜〕。
5、振荡5-10秒,98℃8-10分钟,振荡5-10秒。
6、13000rpm离心3分钟,4℃或-20℃保存备用。
1、检材用量不要过大,以利于充分浸泡、消化,并防止DNA模板浓度过高,导致小片段优势扩增。
2、女性物质过多时,可延长第一步消化时间,增加漂洗次数;
或将保存的一半沉淀物再次进展消化。
3、遇有抑制物干扰时,可通过稀释或用DNAIQ系统纯化模板DNA来解决。
DNAIQ系统纯化DNA
该方法适用于DNA的纯化。
本方法运用DNAIQ系统,对有机法和Chelex-100法提取的DNA进展纯化。
在高浓度chaotropicsalt〔NaI、硫氰酸胍和盐酸胍等〕存在的条件下,核酸吸附到二氧化硅上,而在低盐条件下被洗脱下来。
1、剪取适量检材于1.5ml离心管中,加200ul配制好的裂解液〔100ul裂解液+1ul1MDTT〕,95℃保温30分钟;
2、套管离心,去掉载体,将上清液转移至另一个1.5ml的离心管;
3、离心管中参加2倍体积配制好的裂解液和7ul树脂,漩涡振荡使树脂悬浮,室温放置5分钟,期间震荡3-5次,以使树脂保持悬浮;
4、旋涡振荡后将离心管置于磁架上,小心弃去液体;
5、加100ul配制好的裂解液,旋涡振荡使树脂悬浮,将离心管放在磁力架上,小心弃去液体;
6、加100ul配制好的1х洗液〔2х洗液:
无水乙醇:
异丙醇=2:
1:
1〕,旋涡振荡使树脂充分悬浮,将离心管放在磁力架上,小心弃去液体;
7、重复三次步骤7,最后一次尽量将上清液吸干净;
8、翻开离心管盖子,室温下空气枯燥5分钟;
9、参加50ul纯水,旋涡振荡使树脂悬浮,离心管放在加热块上,65℃保温5分钟,期间振荡3-5次;
10、取出离心管,旋涡振荡使树脂悬浮后,立即将离心管置于磁力架上,小心将DNA溶液吸出至干净管中备用;
1、待纯化的样品在参加裂解液后仍呈粘稠状,会影响磁铁架吸附树脂,导致离心管放入磁架后树脂不贴壁,仍呈悬浮状,此时应用裂解液进一步稀释,或步可将样品在56℃加热1分钟,溶液即可澄清;
。
2、每步应尽量吸净液体。
3、旋涡振荡充分,使树脂在每次洗涤中不发生凝结。
4、枯燥时间不要超过20分钟。
5、低温洗脱导致回收率低,洗脱时应置65o保温5分钟。
6、7μl树脂只能吸附约100ngDNA,因此无需参加过多的DNA。
Micoron100柱纯化方法
1、分别标记两个编号一样的1.5ml管×
〔A管、B管〕;
2、将已用CHELEX100法或有机法等已制备好的DNA,13000rpm离心3分钟;
3、将micoron100柱放在离心管A上,往柱子里加适量已制备的DNA〔约30-50ul即可〕,再往柱子里加100ul去离子水,盖上盖子;
4、将离心管A〔套有柱子〕1000rpm离心5-10分钟〔柱子内约保存20-30ul的溶液〕;
5、从离心管A上拆下micoron-100柱〔弃A管〕,将micoron-100柱翻转后放在离心管B上,盖上盖子;
6、将离心管B〔套有柱子〕13000rpm离心5分钟;
7、弃柱子,收集的DNA溶液保存在离心管B中备用。
抗人血红蛋白〔anti-Hb〕金标试剂条检验人血液〔斑〕
该方法适用于疑含有人血的所有检材。
抗人血红蛋白金标试剂条检验人血的根本原理是双抗体夹心法。
吸附于试剂条加样区的金标记单克隆抗人Hb抗体与含有人血的检材〔样本〕浸泡液反响后,形成金标记抗体抗原复合物,并向试剂条吸附区扩散,当扩散至试剂条预粘附有线性未标记的单克隆抗人Hb处时,与未标记的单克隆抗人Hb反响,并沉淀于该处,形成紫红色沉淀带〔检测线〕。
如果检材〔样本〕浸泡液中无Hb那么不能形成紫红色沉淀带。
吸附于试剂条加样区的多余金标记单克隆抗人Hb抗体越过检测线,继续向试剂条吸附区扩散,当扩散至试剂条预粘附有线性标记的羊抗鼠IgG处时,形成紫红色沉淀带〔质控线〕。
人血稀释8万倍以下或人Hb含量1000ng/ml以上。
剪取适量大小疑含有人血斑检材或吸取适量疑含有人血液检材,于0.5ml离心管内,参加450μl纯水,室温放置30分钟,不时振荡,13,000rpm,5分钟,移上清于另一0.5ml离心管内,将试剂条带MAX标记一端插入上清中,室温静置5分钟,观察结果。
结果
阳性:
阳性二条带,质控线及检测线均为阳性。
加样区反响区吸附区
检测线质控线
阴性一条带,仅有质控线。
1、视检材情况确定检材取量、纯水用量及浸泡时间。
一般检材室温浸泡30分钟,陈旧检材可4℃浸泡过夜。
2、试剂条应置于检材浸泡离心上清液内〔不应超过MAX线〕5分钟内观察结果。
3、试剂条质控线阳性时结果判断才有效。
4、假阴性的原因包括检材太浓而表现为前滞作用或试剂条灵敏度低等。
5、假阳性的原因包括抗体的非特异性反响或试剂条反响后久置等。
6、试剂条应在室温枯燥条件下保存,在有效期内使用。
抗人前列腺特异抗原〔PSA〕金标试剂条检验人精液〔斑〕
该方法适用于疑含有人前列腺特异蛋白的所有检材,主要为与性犯罪有关的精液〔斑〕,包括阴道、口腔、肛门、皮肤擦拭物、卫生纸、衣物等可能粘附有人精液(斑)的所有生物检材。
抗人前列腺特异抗原PSA金标试剂条检验人精液〔斑〕的根本原理是双抗体夹心吸附于试剂条加样区的金标记单克隆抗人PSA抗体与含有人精液〔斑〕斑的检材〔样本〕浸泡液反响后,形成金标记抗体抗原复合物,并向试剂条吸附区扩散,当扩散至试剂条预粘附有线性未标记的单克隆抗人PSA处时,与未标记的单克隆抗人PSA反响,并沉淀于该处,形成紫红色沉淀带〔检测线〕。
如果检材〔样本〕浸泡液中无PSA那么不能形成紫红色沉淀带。
吸附于试剂条加样区的多余金标记单克隆抗人PSA抗体越过检测线,继续向试剂条吸附区扩散,当扩散至试剂条预粘附有线性标记的羊抗鼠IgG处时,形成紫红色沉淀带〔质控线〕。
人精液稀释4万倍以下或人精液特异蛋白含量100ng/ml以上。
剪取适量大小疑含有人精斑检材或吸取适量疑含有人精液检材,于0.5ml或1.5ml离心管内,参加450μl或1ml纯水,室温浸泡30分钟,期间反复搅动,13,000rpm,5分钟,将试剂条带MAX标记一端插入上清中,室温静置5分钟,观察结果。
陈旧检材室温浸泡30分钟后再反复搅动离心后检验。
5、试剂条应室温枯燥保存,在有效期内使用。
有机法提取血液DNA
该方法适用于提取抗凝血中大分子基因组DNA。
先用2×
蔗糖-TritonX-100溶液破红细胞,离心收集白细胞核,裂解核膜,释放出染色体DNA,经蛋白酶消化,蛋白变性剂处理去除其中的蛋白质,再经乙醇沉淀获得纯DNA。
1、取抗凝血3ml〔或3×
3mm2血斑样品〕,参加等体积的2×
蔗糖-TritonX-100溶液,颠倒混匀至液体透亮。
2、3,000rpm离心15分钟,小心去除上清液,得到细胞核沉淀。
3、用1mlEDTA-Na2溶液悬浮细胞核沉淀,移入匀浆器中匀浆。
4、匀浆液移至干净试管中,用0.7mlEDTA-Na2溶液冲洗匀浆器、回收。
5、向试管中参加200μl10%SDS溶液和100μl2mg/ml蛋白酶K溶液,缓慢转动试管混匀。
6、将试管放于37oC水浴中,反响4小时左右。
7、向试管中参加等体积的饱和酚,缓慢颠倒混匀5分钟。
8、3,000rpm离心10分钟,将上层水相移至干净试管中。
9、加等体积1:
1酚和氯仿混合液,颠倒混匀5分钟,重复步骤5.8。
10、加等体积的氯仿,颠倒混匀5分钟,重复步骤5.8。
11、加3MNaCl至终浓度0.3M混匀,然后参加2.5倍体积的冷无水乙醇,缓慢混匀,得到线团状DNA沉淀。
12、将DNA沉淀移至1.5ml离心管中,加1ml70%乙醇漂洗。
8,000rpm离心5分钟,倾掉液体,将沉淀于真空枯燥器或37oC烘箱中枯燥。
13、加100μlTE溶解,放4oC备用。
1、保证重蒸饱和酚的质量。
2、提取过程中防止剧烈振荡。
3、酚-氯仿抽提时,防止扰动和吸到中间的蛋白质层。
有机法提取组织DNA
该方法适用于提取组织中大分子基因组DNA。
用蛋白酶K和外表活性剂裂解组织细胞,释放出DNA,经蛋白酶消化,蛋白变性剂处理去除其中的蛋白质,再经乙醇沉淀、获得纯DNA。
1、50mg组织剪碎,放入匀浆器中,加1mlEDTA-Na2溶液,匀浆。
2、液移至试管中,用0.7mlEDTA-Na2溶液冲洗匀浆器、回收。
3、管中参加200μl10%SDS溶液和100μl2mg/ml蛋白酶K溶液,缓慢转动试管混匀。
4、管放于37º
C水浴中,反响4小时左右。
5、管中参加等体积的饱和酚,缓慢颠倒混匀5分钟。
6、000rpm离心10分钟,将上层水相移至干净试管中。
7、体积1:
1酚和氯仿混合液,颠倒混匀5分钟,重复步骤5.6。
8、体积的氯仿,颠倒混匀5分钟,重复步骤5.6。
9、MNaCl至终浓度0.3M混匀,然后参加2.5倍体积的冷无水乙醇,缓慢混匀,得到线团状DNA沉淀。
10、A沉淀移至1.5ml离心管中,加1ml70%乙醇漂洗。
8,000rpm离心5分钟,倾掉液体,将沉淀于真空枯燥器中或37º
C烘箱枯燥。
11、0μlTE溶解,放4º
C备用。
AmpFlSTRIdentifiler试剂盒操作手册
AmpFlSTRIdentifiler试剂盒概况
新一代法医鉴定及亲子鉴定试剂盒AmpFlSTRIdentifilerPCR扩增试剂盒是一个多重短串联重复序列〔STR〕检测试剂盒。
它采用美国应用生物系统公司〔ABI〕最新的五色荧光、一个泳道技术,可以同时扩增和同时检测16个STR位点〔15个4核苷酸重复位点加上Amelogenin性别判定标记〕。
5色荧光中,6-FAM〔兰色〕、VIC〔绿色〕、NED〔黄色〕和PET〔红色〕用于标记样品,LIZ〔橙黄色〕〕用于标记GeneScan-500分子量内标。
AmpFLSTRIdentifilerPCR扩增试剂盒包含美国binedDNAIndexSystem(CODIS)所要求的全部13个位点,另外增加2个位点:
D2S1338和D19S433。
它整合了ABI公司先前推出的ProfilerPlus、COfiler和SGMPlus试剂盒中的全部STR位点,满足目前所有国际罪犯数据库的要求,如CODIS、ENFSI、Interpol以及SGMPlus体系。
AmpFlSTRIdentifiler试剂盒特点
1、单管同时扩增16个位点,包括15个个体识别位点以及一个性别鉴定位点Amelogenin。
2、采用与以往试剂盒完全一样的引物序列,所有位点扩增产物与ABI现有ProfilerPlus,COfiler及SGM试剂盒扩增结果完全一致,罪犯DNA数据库工作可以在不同试剂盒中自由切换。
3、五色荧光技术,实现了一色荧光标记分子量内标,其余四色荧光标记待测样品,在维持扩增产物大小不变的条件下,有效地提高了单个泳道可以分辨的片段数。
4、扩增产物小:
全部16个位点的PCR扩增产物均小于350bp,扩增效率及重现性高,支持DNA降解样品的扩增。
5、AmpFlSTRIdentifiler试剂盒的一个包装足以进展200次25μl反响体系的PCR扩增。
AmpFlSTRIdentifiler试剂盒位
保存方法
PCR扩增
AmpFlSTRIdentifiler扩增体系
AmpFlSTRIdentifiler试剂
体系
标准体系〔25μL〕
经济体系〔10μL〕
8μL
AmpFlSTRPCRReactionMix〔缓冲液〕
10.5μL
4μL
3μL
AmpFlSTRIdentifilerPrimerSet〔引物〕
5.5μL
2μL
1.8μL
AmpliTaqGoldDNAPolymerase〔Taq酶〕
0.5μL
0.2μL
水
2.8μL
DNA模板
10μL
1μL
AmpFlSTRY-filer扩增体系
试剂
缓冲液
9.2μL
3.7μL
引物
5μL
Taq酶
0.8μL
0.3μL
按下述程序扩增DNA:
95℃11min→(94℃1min→59℃1min→72℃1min)×
28个循环→60℃60min→4℃保温。
DNA保存
如果DNA保存时间小于2周,保存于2到6℃;
如果DNA保存时间大于2周,保存于-15到-25℃。
电泳样品准备
按下表配制,用Hi-DiFormamide〔甲酰胺〕补充终体积至10μL。
每次电泳〔15个样品〕确认至少一个AmpFlSTRIdentifilerAllelicLadder。
Hi-DiFormamide〔甲酰胺〕
Hi-DiFormamide〔甲酰胺〕通常25ml/瓶,因而将其分装在1.5ml离心管内,1ml/管,-20℃保存。
9700PCR扩增仪作业指导书
操作规程:
1、接好电源插头。
2、按下电源开关。
3、滑开热盖,放入需扩增的样品于加热模块中,滑上热盖并压紧。
4、按F1选RUN,用上、下箭头选择需要扩增的程序文件,按START键,选择待扩增样品体积〔5~100ul〕,按START键开场扩增。
5、扩增完毕后滑开热盖,取出样品,滑上热盖,关闭仪器。
保养内容:
1、需每周清洗外观。
2、每日用中性清洁剂清洁加热模块及热盖,防止潜在样品间相互污染。
3、需每日确认电源开关是否良好。
1、短时间内不得连续开关仪器;
2、扩增完毕后及时取出样品,关闭仪器,仪器不宜长时间处于工作状态。
4、不得有其他物品堵塞仪器散热风口。
3100型基因分析仪作业指导书
电泳操作规程: