南农 细胞生物学 6Word格式.docx
《南农 细胞生物学 6Word格式.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《南农 细胞生物学 6Word格式.docx（47页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。
在这里我们把核纤层放在细胞骨架结构系统中介绍，本节着重介绍核被膜与核孔复合体。
一、核被膜
（一）结构组成
核被膜由内外两层平行但不连续的单位膜构成。
面向核质的一层膜被称作内（层）核膜（innernuclearmembrane），而面向胞质的另一层膜称为外（层）核膜（outernuclearmembrane）。
两层膜厚度相同，均为7．5nm。
两层膜之间有20～40nm的透明空隙，称为核周间隙（perinuclearspace）或核周池（perinuclearcisternae），其宽度随细胞种类不同而异，并随细胞的功能状态而改变。
内、外核膜各有特点：
①外核膜表面常附有核糖体颗粒，且常常与糙面内质网相通连，使核周间隙与内质网腔彼此相通。
从这种结构上的联系出发，外核膜可以看作是糙面内质网的一个特化区域。
②内核膜表面光滑，无核糖体颗粒附着，但紧贴其内表面有一层致密的纤维网络结构，即核纤层。
内核膜上有一些特有的蛋白成分，如核纤层蛋白B受体（1aminBreceptor，LBR）。
双层核膜互相平行但并不连续，内、外核膜常常在某些部位相互融合形成环状开口，称为核孔（nuclearpore）。
在核孔上镶嵌着一种复杂的结构，叫做核孔复合体。
核孔周围的核膜特称为孔膜区（poremembranedomain），它也有一些特有的蛋白成分，如核孔复合体特有的跨膜糖蛋白gp210、Poml21等。
（二）核被膜在细胞周期中的崩解与装配
在真核细胞的细胞周期中，核被膜有规律地解体与重建。
在分裂期，双层核膜崩解成单层膜泡，核孔复合体解体，核纤层去装配；
到分裂末期，核被膜开始围绕染色体重新形成。
那么，子细胞的核被膜是来源于旧核被膜碎片?
还是来自其他膜结构?
对此一直有两种意见。
通过对变形虫的研究，很多人支持第一种说法，即新核膜来自旧核膜。
将变形虫培养在含有3H—胆碱的培养基中，3H—胆碱掺人到膜脂的磷脂酰胆碱中，这样核膜便被3H标记。
将带有放射性标记的核取出，移植到正常的去核变形虫中，追踪观察一个细胞周期，结果发现子代细胞形成后，原有的放射性标记全部平均分配到子细胞的核被膜中，说明旧核膜参与了新核膜的构建。
对于核膜装配的机制及其与核孔复合体、核纤层的关系，目前尚无定论。
一种以非洲爪蟾（Xenopuslaevis）卵提取物为基础的非细胞核装配体系（cell-freenuclearassemblysystem）为研究该问题提供了很好的实验模型。
非洲爪蟾的卵母细胞成熟后处于第二次减数分裂中期，此时的卵母细胞体积很大，直径可达1mm，其中储存了大量的营养物质，为受精后快速卵裂做准备，一个成熟的卵母细胞所储备的原料可供形成103—104个细胞核。
现已设法将这种卵提取物在体外（invitro）成功地模拟出细胞核的构建及解体过程。
目前越来越多的证据表明，一种直径200nm左右的单层小膜泡直接参与了核膜的形成。
它们首先附着到染色质表面，在染色质表面排列并相互融合形成双层膜，同时在膜上的某些部位内、外膜相互融合并形成核孔复合体结构。
对HeLa细胞的有丝分裂过程进行研究发现，核被膜在细胞周期中发生有序的去装配与重装配。
从处于分裂期的HeLa细胞中可以分离出两种膜泡组分：
一组富含LBR，另一组富含gp210。
这说明核被膜的去装配不是随机的，而是具有区域特异性（domain-specific）。
在有丝分裂后期核被膜重新装配时，富含LBR的膜泡首先与染色质结合，而富含gp210的膜泡与染色质结合较晚。
此外，核被膜的去装配、重装配变化受细胞周期调控因子的调节，这种调节作用可能通过对核纤层蛋白、核孔复合体蛋白等进行磷酸化与去磷酸化修饰来实现。
二、核孔复合体
1949—1950年间，H．G．Callan与S．G．Tomlin在用透射电子显微镜观察两栖类卵母细胞的核被膜时发现了核孔，随后人们逐渐认识到核孔并不是一个简单的孔洞，而是一个相对独立的复杂结构。
1959年M．L．Watson将这种结构命名为核孔复合体（nuclearporecomplex，NPC）。
迄今已知所有的真核细胞，从酵母到人，其间期细胞核普遍存在核孔复合体。
核孔复合体在核被膜上的数量、分布密度与分布形式随细胞类型、细胞核的功能状态而有很大的差异。
一般来说，转录功能活跃的细胞，其核孔复合体数量较多。
一个典型的哺乳动物细胞核被膜上的核孔复合体总数约3000～4000个，相当于10～60个/μm2。
（一）结构模型
核孔复合体镶嵌在内外核膜融合形成的核孔上，核孔的直径约为80～120nm，而核孔复合体稍大一些，直径为120～150nm，因为它有一部分结构嵌入核被膜内。
有关核孔复合体的结构一直是一个令人感兴趣的问题，自被发现以来，不断有新的结构模型提出，但至今并不完善，仍有一些关键性的问题有待阐明。
这主要是因为分离纯化核孔复合体的方法还不够完善，并且还受到电镜制样技术与观察方法的限制。
研究核孔复合体形态结构的经典方法主要有三种：
树脂包埋超薄切片技术、负染色技术与冷冻蚀刻技术（图8—2）。
20世纪80年代以来，计算机图像处理技术应用于电镜的图像分析，高分辨率场发射扫描电镜技术（HR—FESEM）的发展，以及快速冷冻—冷冻干燥制样技术的发展，使人们对核孔复合体的形态结构有了更深入的了解。
综合已有的资料人们提出了一个最新的核孔复合体结构模型（图8—3）。
细胞核用电镜超薄切片技术（A）和冷冻蚀刻技术（B）显示的核孔复合体（NPC）图8—3核孔复合体结构模型（引自B．Alberts）
对于这个模型的结构组成目前有两种理解：
①从横向上看，核孔复合体由周边向核孔中心依次可分为环、辐、栓三种结构亚单位；
②从纵向上看，核孔复合体由核外（胞质面）向核内（核质面）依次可分为胞质环、辐（十栓）、核质环三种结构亚单位，形成“三明治”（sandwich）式的结构。
综合起来，核孔复合体主要有以下4种结构组分：
④胞质环（cytoplasmicring）：
位于核孔边缘的胞质面一侧，又称外环，环上有8条短纤维对称分布伸向胞质；
⑤核质环（nuclearring）：
位于核孔边缘的核质面一侧，又称内环，内环比外环结构复杂，环上也对称地连有8条细长的纤维，向核内伸人50～70nm，在纤维的末端形成一个直径为60nm的小环，小环由8个颗粒构成。
这样整个核质环就像一个“捕鱼笼”（fish-trap）样的结构，也有人称为核篮（nuclearbasket）结构；
⑥辐（spoke）：
由核孔边缘伸向中心，呈辐射状八重对称。
它的结构也比较复杂，可进一步分为三个结构域：
主要的区域位于核孔边缘，连接内、外环，起支撑作用，称作“柱状亚单位”（columnsubunit）。
在这个结构域之外，接触核膜部分的区域称为“腔内亚单位”（1uminalsubunit），它穿过核膜伸人双层核膜的膜间腔。
在“柱状亚单位”之内，靠近核孔复合体中心的部分称作“环带亚单位”（annularsubunit），由8个颗粒状结构环绕形成核孔复合体核质交换的通道；
③栓：
或称中央栓（centralplug），位于核孑L的中心，呈颗粒状或棒状，所以又称为中央颗粒（centralgranule）；
由于推测它在核质交换中起一定的作用，所以还把它叫做“transporter”。
不过不是在所有的核孔复合体中都能观察到这种结构，因此有人认为它不是核孔复合体的结构组分，而只是正在通过核孔复合体的被转运的物质。
由上述结构模型可见，核孔复合体对于垂直于核膜通过核孔中心的轴呈辐射状八重对称结构，而相对于平行于核膜的平面则是不对称的，即核孔复合体在核质面与胞质面两侧的结构明显不对称，这与其在功能上的不对称性是一致的。
最近，对于"
fish-trap”结构又有新的发现。
H．Ris与M．Malecki运用高分辨率场发射扫描电镜（HR—FESEM）观察非洲爪蟾卵母细胞核膜上的核孔复合体，发现"
fish-trap"
并非中断并游离在核质中，而是与一种称为“cable”的网络通道相连通。
这种cable由与“fish-trap”类似的结构单位串联而成，看上去像是“fish-trap”上的纤维与小环在核质中的周期性重复与延续。
从"
fish-trap”末端小环的8个颗粒上又发出8条细长的纤维，在纤维上周期性地间隔有8个颗粒构成的环状结构。
不同的“fish—trap"
发出的cable相互交叉，使cable成为一个遍布核质、相互贯通的复杂的网络。
这种与“fish—trap"
相连、相似的cable有何功能尚不清楚，推测它很可能与核孔复合体的核质转运功能有关。
（二）核孔复合体成分的研究
核孔复合体主要由蛋白质构成，其总相对分子质量约为125000X103’，推测可能含有100余种不同的多肽，共1000多个蛋白质分子。
最近两年，分离鉴定核孔复合体蛋白成分的工作进展很快，特别是生化与遗传学技术相结合，在酵母中已鉴定出30余种与核孔复合体相关的蛋白成分。
迄今已鉴定的脊椎动物的核孔复合体蛋白成分也已达到十多种（表8—1），其中gp210与p62是最具有代表性的两个成分，它们分别代表着核孔复合体蛋白的两种类型。
实际上，这两类蛋白成分在从酵母到人的多种生物中都已被发现证实，它们在不同的物种中有很强的同源性；
核孔复合体的整个结构在进化上是高度保守的。
目前人们倾向于把所有的核孔复合体蛋白统一命名为“核孔蛋白”（nucleoporin，Nup）。
表8—1已知的脊椎动物核孔复合体的蛋白成分简表蛋白名称
gp210代表一类结构性跨膜蛋白，是第一个被鉴定出来的核孔复合体蛋白，相对分子质量为210X103，位于核膜的“孔膜区”，故认为它在锚定核孔复合体的结构上起重要作用。
其糖基化修饰位点在天冬酰胺残基上，为N连接甘露糖残基寡糖链，因而与刀豆球蛋白A（ConA）有较强的结合作用。
它在糙面内质网上新合成时，N端带有信号肽，但并不参与核孔复合体结构的形成。
目前认为gp210主要有三方面的功能：
①介导核孔复合体与核被膜的连接，将核孔复合体锚定在“孔膜区”，从而为核孔复合体装配提供一个起始位点；
②在内、外核膜融合形成核孔中起重要作用。
gp210氨基酸序列中有两段疏水区，其中靠近C端的疏水区位于孔膜区，是跨膜结构域，另一段疏水区则位于核周间隙内，推测当核孔复合体装配开始时，gp210位于核周间隙内的肽段构象发生变化，从而使其中的疏水区暴露，使之与核膜相互作用，通过这一方式诱导内外核膜融合；
③在核孔复合体的核质交换功能活动中起一定作用，如gp210核周间隙内肽段的抗体能够降低蛋白质人核转运的速度。
后来又报道发现另外一种位于孔膜区的蛋白成分，命名为Poml21。
p62代表一类功能性的核孔复合体蛋白。
它带有O连接N—乙酰葡萄糖胺残基（O-linkedGlcNac）寡糖修饰，因此与麦胚凝集素（WGA）有较强的亲和性。
脊椎动物的p62分子主要分为两个结构域：
①疏水性N端区，具有XFXFX（F：
苯丙氨酸；
x：
任意氨基酸）形式的重复序列，由其氨基酸序列推测适合形成β—折叠结构；
糖基化修饰发生在这个区域中接近C端区的肽段。
这个区域可能在核孔复合体功能活动中直接参与核质交换。
②C端区，具有疏水性的七肽重复序列，类似一些纤维蛋白（如中间纤维蛋白、核纤层蛋白）的杆状区，适合形成α—螺旋。
推测这个区域可能通过卷曲螺旋与其他核孔复合体蛋白成分相互作用，从而将p62分子稳定到核孔复合体上，为其N端进行核质交换活动提供支持。
p62对核孔复合体行使正常的功能非常重要。
目前，这一类核孔复合体蛋白成分已有很多被鉴定出来，其中有些像p62一样带有O连接GlcNac类型的糖基化修饰，并且含有一些重复序列，如Nupl53中的FXFG（F：
苯丙氨酸，X：
任意氨基酸，G：
甘氨酸），Nup98中的GLFG（L：
亮氨酸），也有些没有任何糖基化修饰或类似的重复序列。
（三）核孔复合体的功能：
核质交换的双向选择性亲水通道
从功能上讲，核孔复合体可以看作是一种特殊的跨膜运输蛋白复合体，并且是一个双功能、双向性的亲水性核质交换通道。
双功能表现在它有两种运输方式：
被动扩散与主动运输。
双向性表现在既介导蛋白质的人核转运，又介导RNA、核糖核蛋白颗粒（RNP）的出核转运（图8—4）。
1．通过核孔复合体的被动扩散
核孔复合体作为被动扩散的亲水通道，其有效直径为9～10nm，有的可达12．5nm，即离子、小分子以及直径在10nm以下的物质原则上可以自由通过。
对静止期核孔的有效大小是通过将标记的非核组成成分注射到细胞质中，计算它们向核内扩散的速率来研究的。
将聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）包被的胶体金颗粒，通过显微注射引入变形虫细胞质内，然后在电镜下检查金颗粒的分布，结果发现它们是经过核孔复合体的中心进入细胞核的，估计中央通道的直径为12．5nm。
通过核孔复合体的扩散速度与分子大小成反比，相对分子质量小于5．0X103的小分子可以自由扩散，17X103的蛋白质在2min内可达到核质间平衡，44X103的蛋白质需30min达到平衡，而大于60X103的
球蛋白则几乎不能进入核内。
根据这些定量分析资料推断，核孔复合体是一个圆形亲水通道，其功能直径为9nm，长约15nm的通道。
这与电镜照片上可以看到的通道的大小是基本一致的。
对于球形蛋白质，这种有效直径相当于允许相对分子质量在40X10’3一60X10’3以下的蛋白质分子自由穿过核孔。
但实际上并不是所有符合这个条件的蛋白质都可以随意出入细胞核。
有许多小分子的蛋白质，如组蛋白Hl，其相对分子质量虽只有21X103’，但由于它本身带有具信号功能的氨基酸序列，所以是通过主动运输进入细胞核的；
有的小分子蛋白质本身虽然没有信号序列，但可以与其他有信号序列的成分结合，一起被主动运输到核内。
因此，核孔复合体的这种被动扩散通道并不意味着所有10nm以下的小分子在核被膜两侧就一定均匀分布。
有些小分子蛋白质可能会因为与其他大分子相结合，或与一些不溶性结构成分（如中间纤维、核骨架等）结合而被限制在细胞质或细胞核内。
④④④④
b爪蟾卵母细胞核质蛋白注射实验（引自B．Alberts）
2．通过核孔复合体的主动运输
生物大分子的核质分配如亲核蛋白的核输入，RNA分子及RNP颗粒的核输出，在细胞核功能活性的控制中起着非常重要的作用。
对于真核细胞来说，典型的哺乳类细胞的核被膜上有3000～4000个核孔（约11个～m2），如果细胞正在合成DNA，为了确保染色质包装，则需要每3min从细胞质向核内输入106个组蛋白分子，这意味着每个核孔每分钟要运进100个组蛋白分子。
如果细胞在迅速生长，则需要每个核孔每分钟从细胞核向细胞质输出三对核糖体大小亚基，以确保蛋白质合成的需要。
现在已知，这种大分子的核质分配主要是通过核孔复合体的主动运输完成的，具有高度的选择性，并且是双向的。
其主动运输的选择性表现在以下三个方面：
①对运输颗粒大小的限制。
主动运输的功能直径比被动运输大，约10—20nm，甚至可达26nm。
像核糖体亚单位那样大的RNP颗粒也可以通过核孑L复合体从核内运输到细胞质中，表明核孔复合体的有效直径的大小是可被调节的；
②通过核孑L复合体的主动运输是一个信号识别与载体介导的过程，需要消耗ATP能量，并表现出饱和动力学特征；
③通过核孔复合体的主动运输具有双向性，即核输入与核输出，它既能把复制、转录、染色体构建和核糖体亚单位装配等所需要的各种因子如DNA聚合酶、RNA聚合酶、组蛋白、核糖体蛋白等运输到核内；
同时又能将翻译所需的RNA、装配好的核糖体亚单位从核内运送到细胞质。
有些蛋白质或RNA分子甚至两次或多次穿越核孔复合体，如核糖体蛋白、snRNA等。
近几年对于亲核蛋白的人核转运机制的研究进展较快。
亲核蛋白（karyophilicprotein）是指在细胞质内合成后，需要或能够进入细胞核内发挥功能的一类蛋白质。
大多数的亲核蛋白往往在一个细胞周期中一次性地被转运到核内，并一直停留在核内行使功能活动，典型的如组蛋白、核纤层蛋白等；
但也有一些亲核蛋白需要穿梭于核质之间进行功能活动，如importins。
通过研究核质蛋白（nucleoplasmin）的入核转运，人们逐步发现了指导亲核蛋白人核的信号。
核质蛋白，相对分子质量165X103，是一个五聚体，在非洲爪蟾卵母细胞核中含量丰富。
用蛋白水解酶进行有限的水解，可以分别得到头部片段（N端）与尾部片段（C端）。
将带有放射性标记的完整核质蛋白或头、尾片段分别注射到爪蟾卵母细胞的细胞质中，结果发现，完整的核质蛋白能够在细胞核内迅速地积累，同时发现尾部片段也能被高效地转运到核内，而头部片段却被拒之核外（图8—5）。
显然有某种亲核的输入信号存在于尾部片段。
如果把尾部片段包裹在直径20nm的胶体金颗粒上，然后注射到细胞质中，这种金颗粒也能在核内积累；
换用完整的核质蛋白包裹胶体金颗粒可以得到同样的结果。
现在已经证实，亲核蛋白一般都含有特殊的氨基酸序列，这些内含的特殊短肽保证了整个蛋白质能够通过核孔复合体被转运到细胞核内。
这段具有“定向”、“定位”作用的序列被命名为核定位序列或核定位信号（nuclearlocalizationsequence或nuclearlocalizationsignal，NLS）。
第一个被确定序列的NLS来自猴肾病毒（SV40）的T抗原（相对分子质量92X103）。
这个NLS由7个氨基酸残基构成：
Pro—Lys—Lys—Lys—Arg—Lys—Val。
其中仅一个氨基酸残基突变就会导致该蛋白在胞质内不正常积累；
如果将这段NLS序列连接到非亲核蛋白上，则非亲核蛋白就会被转运到核内。
此后，又陆续鉴定出一些其他亲核蛋白的NLS。
目前认为NLS是存在于亲核蛋白内的一些短的氨基酸序列片段，富含碱性氨基酸残基，如Lys、Arg，此外还常常含有Pro。
这些氨基酸残基片段可以是一段连续的序列，如上述SV40T抗原的NLS，也有分成两段存在于亲核蛋白的氨基酸序列中，两段之间往往间隔约10个氨基酸残基，如核质蛋白的NLS。
在不同的NLS之间尚未发现共有的特征序列。
与指导蛋白质跨膜运输的信号肽不同，NLS序列可存在于亲核蛋白的不同部位，并且在指导亲核蛋白完成核输入后并不被切除。
亲核蛋白通过核孔复合体的转运是分步进行的，根据整个过程对能量的需求可粗略的分为两步：
结合（binding）与转移（translocation）。
亲核蛋白首先结合到核孔复合体的胞质面，这一步不需要能量，但依赖正常的NLS；
随后的转移步骤则需要GTP水解供能。
亲核蛋白除了本身具有NLS外，其人核转运还需要一些胞质蛋白因子的帮助。
目前比较确定的因子有importina、importin卢、Ran（一种GTP结合蛋白）和NTF2等。
在它们的参与下，亲核蛋白的人核转运可分为如下几个步骤（图8—6）：
①亲核蛋白通过NLS识别importina，与可溶性NLS受体importin。
／improtinβ异二聚体结合，形成转运复合物；
②在importinβ的介导下，转运复合物与核孔复合体的胞质纤维结合；
③转运复合物通过改变构象的核孔复合体从胞质面被转移到核质面；
④转运复合物在核质面与Ran—GTP结合，并导致复合物解离，亲核蛋白释放；
⑤受体的亚基与结合的Ran返回胞质，在胞质内Ran—GTP水解形成Ran—GDP并与importinβ解离，Ran—GDP返回核内再转换成Ran—GTP状态，
亲核蛋白从细胞质向细胞核输入的过程示意图
应该指出，NLS只是亲核蛋白人核的一个必要条件，某种亲核蛋白是否被转运人核还受到其他因素的影响。
已经发现有很多带有NLS的蛋白质由于种种原因滞留在胞质内。
它们有的是因为其NLS的活性被封闭（masking），如磷酸化修饰；
有的是由于与“胞质滞留因子”（cytoplasmicretentionfactor）的结合，如与细胞骨架的结合导致亲核蛋白不能自由活动。
总之，蛋白质人核转运作为一种重要的核质物质交换与信息交流活动，是受到多种因素综合调节的。
对于RNA及核糖体亚单位的出核转运机制了解得较少。
真核细胞中RNA一般要经过转录后加工、修饰成为成熟的RNA分子后才能被转运出核。
①由RNA聚合酶I转录的rRNA分子，总是在核仁中与从胞质中转运进来的核糖体蛋白结合形成核糖体亚单位，以核糖核蛋白颗粒（RNP）的形式离开细胞核，转运过程需要能量；
②由RNA聚合酶Ⅲ转录的5SrRNA与tRNA的转运是一种由蛋白质介导的过程；
③由RNA聚合酶Ⅱ转录的核内不均一RNA（heterogeneousnuclearRNA，hnRNA），首先需要在核内进行5，端加帽和3，端附加多聚A序列以及剪接等加工过程，然后形成成熟的mRNA出核。
出核转运也是一个需要载体的主动运输过程。
最近的研究表明，在细胞核中既有正调控信号保证mRNA的出核转运，也有负调控信号防止mRNA的前体被错误地运输。
由DNA转录出来的mRNA前体只有在核内经过转录后加工、修饰成为成熟的RNA分子后才能被转运出核。
目前认为5’端的m7GpppG"
帽子”结构对mRNA的出核转运是必要的。
防止mRNA的错误出核与剪接体（spliceosome）有关，实验证明在剪接体形成与mRNA出核转运之间存在竞争。
mRNA的出核转运过程是有极性的，其5，端首先通过核孔复合体，3，端最后离开细胞核。
此外，RNA分子的出核转运需要蛋白分子的帮助。
真核细胞的snRNA、mRNA与tRNA，无论在细胞质
升级会员 