药物分析一体化实验Word下载.docx

药物分析一体化实验Word下载.docx

《药物分析一体化实验Word下载.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《药物分析一体化实验Word下载.docx（8页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。

-氯苯基）甲醇（缩合物）。

生成的醇与氯化亚砜进行分子内的亲和取代反应，最后与咪唑缩合反应生成克霉唑。

反应式：

（二）克霉唑的含量测定

克霉唑在紫外光260nm下有最佳吸收波长，本实验采用高效液相色谱法外标法室温检测。

高效液相色谱仪的系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。

（1）输液泵：

①流量稳定；

②流量范围宽；

③输出压力高；

④液缸容积小；

⑤密封性能好，耐腐蚀。

（2）进样器：

一般HPLC分析常用六通进样阀，六通阀进样方式有部分装液法和完全装液法两种。

（3）色谱柱：

色谱是一种分离分析手段，分离是核心，因此担负分离作用的色谱柱是色谱系统的心脏。

对色谱柱的要求是柱效高、选择性好，分析速度快等。

（4）检测器：

HPLC的检测器分为两类①通用型检测器可连续测量色谱柱的流出物的全部特性变化；

②专用型检测器用以测量被分离样品组分某种特性的变化。

储液器中的流动相被高压泵打入系统,样品溶液经进样器进入流动相,被流动相载入色谱柱（固定相）内,由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数,在两相中作相对运动时,经过反复多次的吸附-解吸的分配过程,各组分在移动速度上产生较大的差别,被分离成单个组分依次从柱内流出,通过检测器时,样品浓度被转换成电信号传送到记录仪,数据以图谱形式打印出来。

（三）克霉唑的抗菌实验

霉唑属吡咯类抗真菌药，具广谱抗真菌活性，对白念珠菌则可抑制其自芽孢转变为侵袭性菌丝的过程。

作用机制：

该品通过干扰细胞色素P-450的活性，从而抑制真菌麦角固醇等固醇的生物合成，损伤真菌细胞膜并改变其通透性，以致重要的细胞内物质外漏;

可抑制真菌的甘油三脂和磷脂的生物合成;

也可抑制氧化酶和过氧化酶的活性，引起细胞内过氧化氢积聚导致细胞亚微结构变性和细胞坏死。

白色念珠菌所致的皮肤念珠菌病和外阴阴道炎，由红色毛癣菌、须癣毛癣菌、絮状表皮癣菌和犬小孢子菌所致的体癣、股癣、足癣和糠秕马拉色菌所致的花斑癣，也可用于治疗甲沟炎、须癣和头癣。

三、实验试剂及仪器

试剂：

乙醇、邻氯苯甲酸、对甲苯磺酸、碳酸氢钠、氯仿、镁、碘、无水乙醚、溴代苯、稀硫酸、氯化钙、甲苯、活性炭、石油醚、无水丙酮、霉唑重结晶产物、克霉唑对照品（100037）、甲醇（色谱）等

琼脂粉、改良马丁培养基、二甲亚砜、白色念珠菌

仪器：

真空抽气泵、旋转蒸发仪、三用紫外线分析仪、电子天平、真空干燥箱、电动搅拌器、红外灯、高效液相色谱、全自动酶标仪、台式恒温振荡器、SW-CJ-2FD洁净工作台、DH3600B电热恒温培养箱、立式压力蒸汽灭菌器、PL403电子天平、超纯水系统、试管、烧杯、量筒、刻度吸管、圆底烧瓶、锥形瓶、培养皿、细胞培养板、新华1号滤纸、EP管、接种环、枪头、移液枪等

四、实验内容

（一）克霉唑的含量测定

1、邻氯苯甲酸乙酯的生成

在250mL干燥的三口烧瓶上，依次配置搅拌器、油浴锅和带有CaCl2干燥管的回流冷凝管。

向三口瓶中加入1g邻氯苯甲酸和对0.189g甲基苯磺酸,4.5g无水乙醇，待溶解后，将温度调至78℃，保持此温度，然后搅拌回流带水12h。

向三口瓶中加入足量的饱和碳酸氢钠溶液并充分搅拌，然后加入适量的氯仿并搅拌。

测定上层溶液PH应大于等于7，下层溶液PH应等于7。

取下层溶液作为反应液，并将反应液转移至分液漏斗中进行萃取。

分取下层溶液旋蒸除尽溶剂，得到液状产物，产物呈淡黄或浅黄绿色。

计算收率。

2、二苯基-（2'

-氯苯基）甲醇（缩合物）的生成

在250ml干燥的四口瓶中，依次配置搅拌器、油浴锅和带有CaCl2干燥管的回流冷凝管及温度计。

向四口瓶中加入0.215g镁和0.019g碘,0.7g无水乙醚，室温下缓慢滴加溴代苯1.942g-乙醚0.8g，缓慢搅拌使溶液混合，滴加完毕后升温至56-70℃回流1.5h。

冷却60℃以下，改装成蒸馏装置，在向四口瓶中滴加邻氯苯甲酸乙酯1g-苯2.5g混合溶液，同时蒸出乙醚（在此步时，蒸乙醚时的温度控制在60度以下）待乙醚完全蒸出后，升至内温达77-80℃，继续搅拌回流4h，放置10h。

搅拌下向反应液中加入苯0.7g，再加入冷至5℃以下的8%稀硫酸，冰水浴下搅拌20分钟左右，酸度不够可加酸，保持溶液的pH值为1-2。

将反应液转移至分液漏斗中，静置，分取上层苯溶液，旋蒸尽可能除尽苯。

安装水蒸气蒸馏装置，将旋蒸液加入三口瓶中进行蒸馏，蒸馏至馏出液只有少许油状物时停止蒸馏，将反应物趁热转移至分液漏斗中进行萃取。

分取下层溶液进行旋蒸，冷冻放置直至呈现浅黄色稠状（若颜色较深可以进行硅胶色谱柱纯化处理）。

3、二苯基-（2'

-氯苯基）氯甲烷的生成

称取1g二苯基-（2'

-氯苯基）甲醇粗品，加入三口瓶中，然后加入1g甲苯及0.043g活性碳,加热使粗品溶解，继续升温回流脱水，待脱水后，趁热抽滤，滤渣用少量甲苯洗涤，合并洗滤液。

将洗滤液加入干燥的三口瓶中，温度调至50-60℃，缓慢滴加0.83g氯化亚砜，继续缓慢升温至90℃左右，回流反应5h，然后将反应液冷却至室温后，5℃以下放置24小时左右，析出白色沉淀，抽滤，滤饼用石油醚洗涤2-3次，得白色粉末状或块状固体，产品真空干燥。

4、克霉唑的制备

将咪唑加入三口瓶中，用适量无水丙酮溶解。

在25~28℃时缓慢加入二苯基-（2'

-氯苯基）氯甲烷1g。

先慢慢升温至45℃后然后设置温度为30℃，待自然降温至30℃左右，保温反应3小时，此时反应液中有白色固体析出。

向反应物中加入无水丙酮，于55~57℃回流使溶解，然后加入少量活性炭，回流脱色半小时。

趁热过滤，滤饼用丙酮洗2~3次。

滤液旋蒸，除去3/4量的丙酮，冷却至室温后5℃以下放置15小时以上可见白色固体析出。

，抽滤，将滤饼用热水洗至洗液为透明，得白色块状固体，干燥。

测定熔点并计算收率。

1、色谱条件

色谱柱：

4.6×

150nm

流动相：

甲醇—水（碳酸氢钠2g，三乙胺2.5ml,加水至1000ml,冰醋酸调PH2.5，微孔滤膜滤过），比例为65：

35。

流速：

1.0ml﹒min-1

柱温：

25℃

检测波长：

260nm

进样量：

20ul

2、标准曲线的绘制

精密称取克霉唑标准品50.24mg置于100ml容量瓶中，加入适量的流动相，待完全溶解后用流动相稀释至刻度，摇均，作为对照品贮备液。

用移液管精密移取对照品贮备5.0ml、

10.0ml、15.0ml、20.0ml、25.0ml分别置于25ml的容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇

均。

分别取上述不同浓度的对照品溶液用微孔滤膜滤过后注入液相色谱进样瓶中，按照色

谱条件对5种不同浓度的对照品溶液各进样20ul，记录不同浓度对照品溶液的峰面积，以

对照品溶液浓度（C）与其相应峰面积（A）作图求线性回归方程及相关系数。

3、样品含量的测定

精密称取克霉唑样品0.0300g,用流动相溶解后转移至100ml的容量瓶中，用流动相稀

释至刻度，摇均。

精密称取克霉唑标准品0.0298g,用流动相溶解后转移至100ml的容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇均。

分别取上述样品和标准品溶液用微孔滤膜滤过后注入液液相色谱进样瓶中。

按照色谱条件对标准品和样品溶液各进样20ul。

分别记录标准品和样品溶液的出峰时间、峰面积、峰面积百分比

改良马丁液体培养基：

用分析天平准确称取改良马丁培养基2.85g，加入100mL蒸馏水，放入灭菌锅（设定：

温度：

121℃，灭菌时间：

15min），搅拌使之充分溶解后，121℃高压灭菌15min，于4℃保存备用。

改良马丁固体培养基：

用分析天平准确称取改良马丁培养基2.85g，琼脂1.4g，加入100mL蒸馏水，放入灭菌锅（设定：

15min），灭菌完毕后，在超净工作台上，等其温度降至约50-60℃时，以25mL/皿倒入无菌培养皿中，制作平板固体培养基。

菌种的活化：

将过夜培养的菌种按2.5%的接种量，接种至含10mL改良马丁培养基的摇菌管中，于28℃，180rpm继续振摇培养20~24h，使其达到对数生长期，用于后续实验。

将部分过夜培养的菌种涂布于固体培养平板中，倒置培养过夜，待菌落生长大小适当时，保存于4℃，可用于一周内的菌种培养活化使用。

克霉唑浓度的配制：

直接用DMSO配成浓度为1mg/mL，再配4,2,1/2,1/4~1/512μg/mL其DMSO含量为3.5%。

96孔板MIC:

将药物按由高到低浓度自左至右加入96孔板中，然后加入菌液，在280C培养箱培养20-24小时，加入MTT溶液，继续培养2h后，以肉眼观察无细菌生长的最低药物浓度的孔作为两药物是否具有协同作用的判断指标，或使用酶标仪测定其在570nm波长处的吸光度值，以吸光度值的变化作为判断指标。

五、实验结果与讨论

1、克霉唑合成过程中的产率和总产率计算

克霉唑合成产率

步骤

产品

产率

1

邻氯苯甲酸乙酯

2

二苯基-（2'

-氯苯基）甲醇（缩合物）

3

4

-氯苯基）氯甲烷

克霉唑

2、克霉唑标准曲线的绘制和含量测定

克霉唑对照品的浓度与面积表

浓度10-1mg/ml

面积mAU˙min

对照品1

1.004

对照品2

2.008

对照品3

3.012

对照品4

4.016

对照品5

5.020

克霉唑含量测定表

浓度mg/ml

出峰时间min

面积mAU*min

面积百分比%

标准品

0.2980

样品

0.3000

3、抗菌实验结果

用96孔板测MIC结果

克霉唑浓度（μg/mL）

培养基

1/2

1/4

1/8

1/16

1/32

1/64

1/128

1/256

1/512

1/1024

六、思考题

1、试用反应机理说明格式试剂制备过程中需要无水操作的原因

2、高效液相色谱仪的使用有哪些注意事项

3、活化菌时应注意哪些事项？

4、在抗菌实验中，配置药品要考虑哪些因素？