赤霉素残留量的测定液相色谱质谱质谱联用法编制说明.docx
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赤霉素残留量的测定液相色谱质谱质谱联用法编制说明
《贵州省食品安全地方标准植物性农产品中赤霉素残留量的测定液相色谱－质谱/质谱联用法》编制说明
（征求意见稿）
一、工作简况
1.1目的意义
植物生长调节剂（PlantGrowthRegulator）调节作物正常生理作用和代谢过程的一类农药。
近年来，在我国农产品生产加工中的应用日益广泛，已经成为增加蔬菜水果产量、改善品质、提高经济效益的重要手段之一。
然而随着研究的深入，有关植物生长调节剂安全性的报道也增多。
例如植物天然激素赤霉素，试验发现赤霉素可能影响动物的生长发育，甚至导致机体发生癌变。
植物生长调节剂在水果、蔬菜以及茶叶中的残留问题也逐渐受到关注，因此，欧盟、日本、韩国、澳大利亚等多个国家都制定了不同农产品（蔬菜水果）中的残留限量标准。
赤霉素是目前我国比较常用的植物生长调节剂，赤霉素也是天然植物激素，对水果、蔬菜和茶叶生长有促进作用。
此外，赤霉素还可以改善水果品质，延长贮藏期。
赤霉素的理化性质详见表1。
目前我国还未指定赤霉素的限量标准，目前澳大利亚、美国、韩国及日本等水果蔬菜进出口大国制定了农产品中赤霉素的限量标准涉及多达110多种农产品。
而在我国，目前在水果中赤霉酸残留量的测定已有食品安全国家标准（GB23200.21-2016）外，北京市在豆芽产品中制定了检测方法标准（DB11/T379-2006）外，目前还没有其他的方法标准。
表1赤霉素的物理化学性质
名称化学文摘号CASNo.分子量水溶性（mg/L）logKowpKa结构式
赤霉素77-06-5346.385×1030.244.0
据不完全统计，目前关于赤霉素检测方法文献方法多达70多种，主要包括液相色谱法（HPLC）、液相色谱法-质谱法（HPLC-MS）等，应用最广泛的是HPLC。
赤霉素的方法标准主要采用高效液相色谱方法，如在水果中赤霉酸残留量的测定已有食品安全国家标准（GB23200.21-2016），豆芽中赤霉酸残留量的测定已有北京市地方标准（DB11/T379-2006）。
日本厚生劳动省制定的“LC/MS农用化学品同时检测方法Ⅱ”采用液相色谱－质谱法能够同时检测赤霉素、噻苯隆及氯吡脲等三种植物生长调节剂。
1.2任务来源
承担单位：
中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所
主要起草人：
金芬、王静、邵华、金茂俊、佘永新、郑鹭飞、王珊珊、史晓梅、张鹏
1.3主要工作过程
项目主持单位组织专家成立了标准编制工作组，并负责编制起草工作，确定标准的主要技术内容。
编制组成立后，进行了广泛的调查和研究工作，主要包括以下几个方面：
（1）了解目前国际上不同种类蔬菜、水果、茶叶中赤霉素的限量值。
（2）收集国内外有关蔬菜、水果、茶叶中赤霉素测定方法和标准等资料。
比较研究了国内外的不同测定方法的有缺点，并在此基础上进行改善，为方法最终的确定提供了大量的数据支撑。
（3）调查了国内许多单位蔬菜、水果、茶叶中中赤霉素测定方法的仪器设备和使用情况，为方法的普适性提供依据。
（4）为确定方法分析步骤、仪器测试条件及方法技术参数的评价，本单位和相关协作实验室进行了大量的方法研究、验证实验和数据统计、为标准的起草制定了可靠的第一手资料。
在广泛的调查研究和必要的试验验证的工作基础上，根据GB/T1.1-2009《标准化工作导则第一部份：
标准的结构和编写规则》及GB/T20001.4-2001《标准编写第四部份：
化学分析方法》所规定的内容和格式编写完成标准草案，现已形成征求意见稿。
二、标准编制原则和确定标准主要内容的论据
2.1编制原则
本标准的编写制定过程以提高测试方法选择性、精密度、灵敏度、准确度和分析效率，降低分析成本为总原则，力求反映科学技术的先进成果和先进经验。
遵循了标准制定过程中的先进性、经济性和适用性原则。
在标准的制定过程中严格遵循国家有关方针、政策、法规和规章，严格执行强制性国家标准和行业标准。
与同体系标准及相关的各种基础标准以及配套使用的取样、试剂规格等标准相衔接，遵循了政策和协调统一性原则。
在标准制定过程中力求做到：
技术内容的叙述正确无误；文字表达准确、简明、易懂；标准的构成严谨合理；内容编排、层次划分等符合逻辑与规定。
2.2确定主要技术内容的依据
目前，赤霉素的测定，日本厚生劳动省已经有标准方法。
此方法为“LC/MS农用化学品同时检测方法Ⅱ”。
该方法在样品的提取净化部分采用乙腈提取，盐酸-氯化钠水溶液液液萃取，硅胶固相萃取小柱净化，前处理方法相对比较繁琐。
而基质分散固相萃取法相对于固相萃取法来说更加快速、环保。
目前已经有很多基于基质分散固相萃取前处理的检测方法面世。
最著名的为美国QuEChERS方法，该方法在农药多残留的测定上显示了快速、简单、绿色环保等优点；但该方法在植物生长调节剂的应用上还研究较少。
因此，在现有日本厚生省方法及美国的QuEChERS方法基础上，我们对样品的提取净化过程进行改进和优化，研究确定了使用相对简单快速的前处理的液相色谱-质谱法进行检测，该方法可有效的测定农产品中赤霉素（水果和蔬菜）。
茶叶和茶青样品含有茶多酚等，具有更多水溶性的杂志，更深的色素，除去色素对于方法的准确性和精密度均有提高，因此，在现有文献方法的基础上，我们对茶叶和茶青的提取净化过程进行改进和优化，研究确定了使用相对简单快速的前处理的液相色谱-质谱法进行检测，该方法可有效的测定茶青和茶叶中赤霉素。
三、方法的确定
3.1称样量的确定
本方法参考日本厚生劳动省方法确定称样量为5-20g和QuEChERS方法的称样量。
在日本厚生劳动省“LC/MS农用化学品同时检测方法Ⅱ”方法中称样量为5-20g，提取溶剂乙腈的体积为50mL；而QuEChERS方法的称样量为10g，提取溶剂的体积为10mL。
我们对不同称样量的提取效果进行了比较，确定了蔬菜水果样品等称样量为10g。
此外，在我国的常规实验室所配置的离心机与离心管通常为50mL，根据QuEChERS方法样品量与提取溶剂1:
1的比例，10g的称样量更易于操作，所以本实验确定样品的称样量为10g。
而对柑橘类样品的分析要求是果皮和果肉分别测定残留量，考虑到柑橘类样品果皮部分密度较小，不易离心，且果皮部分的残留量较果肉部分高，所以柑橘类果皮的称样量确定为5g。
由于茶青和茶叶颜色较深，茶叶提取物中水溶性杂质较多，色素、生物碱、脂多糖等大分子杂质水溶性杂质较多，考虑到基质干扰，因此茶叶的称样量为2g，茶青的称样量为5g。
3.2提取液的确定
依据现有标准和文献方法，试验比较了乙腈溶液以及乙腈-乙酸混合液两种提取液对赤霉素的提取效果，详见表2。
因为赤霉素结构中含有羧基，它们受PH的影响较大。
当在乙腈溶液中加入0.1%的乙酸，果蔬样品中赤霉素的提取效果和色谱峰型都有所改善；因此，在该试验中针对果蔬等农产品使用乙腈-0.1%醋酸水的混合溶液进行提取和离心。
而对于茶叶和茶青样品，当在乙腈溶液中加入0.5%的乙酸，赤霉素的提取效果更好，因此，在该试验中针对茶叶等农产品使用乙腈-0.1%醋酸水的混合溶液进行提取和离心。
表2不同提取溶液的提取效果
提取溶液组成（V/V）
赤霉素回收率（％）
乙腈
75.6
乙腈-0.1%醋酸
94.3
乙腈-0.5%醋酸
95.2
3.3基质分散固相萃取填料的选择
依据现有标准和文献方法，试验比较了一种离子交换吸附剂（PSA）和两种惰性吸附剂（ODS、石墨化碳）共三种分散固相萃取的填料对样品的净化回收效果。
在农残分析中，PSA主要是通过离子交换作用除去样品中的金属离子、部分脂肪酸和糖，在本试验中，PSA为50mg时，对目标物赤霉素有很大程度的保留，影响了目标物的回收效果，如表3所示，赤霉素的回收率仅为52.3%。
显然，随着PSA量的增大，赤霉素的回收率不断降低，所以综合考虑回收率及净化效果，未使用PSA作为净化填料。
此外，我们比较了不同浓度的GCB的净化回收效果。
在以往的农残分析中，GCB主要用于去除叶绿素和类胡萝卜素，对具有平面结构的农药具有一定的吸附。
C18作为一种广谱型的净化填料，虽然它除杂能力没有PSA好，但是综合考虑回收率和净化效果，本实验中选择C18作为果蔬样品净化填料。
表3不同分散固相萃取填料的净化回收效果
填料
剂量（mg）
赤霉素回收率（%）
C18
20
114
100
108
200
98
PSA
50
52.3
100
43.7
150
43.7
200
40.55
GCB
20
107.3
100
88.6
200
78
3.4固相萃取柱的选择
依据现有标准和文献方法，以及基质分散固相萃取方法中填料的净化回收效果，初步选定了两种惰性吸附剂（ODS、石墨化碳）固相萃取柱对样品的净化回收效果进行评价。
此外，我们比较了不同浓度的ENVI-Carb的净化回收效果。
在以往的农残分析中，GCB主要用于去除叶绿素和类胡萝卜素，对茶叶中的色素去除效果好。
综合考虑回收率和净化效果，本实验中选择ENVI-Carb作为果蔬样品净化填料。
表4不同分散固相萃取填料的净化回收效果
SPE柱
剂量（mg）
赤霉素回收率（%）
C18
20
34
100
44
200
52
ENVI-Carb
20
84.0
100
88.6
200
90
3.4离心过滤
将高速匀浆后的样品于10000r/min下离心5min。
吸取1-2mL上述离心液清液，过0.2µm滤膜净化。
依据现有的国际标准及文献方法，多采用聚丙烯（GHP）滤膜。
而GHP滤膜的价格比较昂贵，所以在本研究中比较了两种不同材质的滤膜。
一种是waters公司的聚丙烯（GHP）滤膜，另一种是国产的有机相滤膜。
通过比较发现，两种滤膜对样品的回收率及净化效果没有显著性差异。
但国产的有机相滤膜的价格约为1元/个，比进口的GHP滤膜的价格（16元/个）便宜的多。
所以，从成本角度考虑，本方法选用经济的国产有机相滤膜。
3.5质谱条件的优化
本实验依据赤霉素分子的结构特征，分别选择在正离子和负离子模式下进行全扫描（Q1扫描），确定母离子；在碎片离子扫描模式下，通关改变CE电压条件，确定每种物质的特征碎片离子峰，最后优化MRM定量分析质谱参数如DP、FP、EP、CE和CXP等，以获得更高的灵敏度。
本实验使用的质谱仪器为AB公司的API5000，最后确定的质谱条件如下：
a）电喷雾电压（IS）：
正离子模式4500V；负离子模式-4500V；b）雾化气压力（GS1）：
40Psi；c）气帘气压力（CUR）：
5Psi；d）辅助气流速（GS2）：
40Psi；e）离子源温度（TEM）：
450︒C；f）监测离子对、碰撞电压（CE）、去簇电压（DP）、碰撞室入口电压（EP）、碰撞室出口电压（CXP）如表5所示。
表5赤霉素碎片离子信息
化合物
母离子
（Q1）
子离子
（Q3）
CE（V）
DP（V）
EP（V）
CXP（V）
赤霉素
-345.2
-143.1*
-40
-90
10
15
-221.2
-30
-90
10
15
注：
*为定量离子
3.6色谱条件的选择
3.6.1流动相梯度
表6梯度洗脱程序表
时间（min）
5mmol/L乙酸铵-0.5%乙酸水
溶液（流动相A）
5mmol/L乙酸铵-0.5%乙酸甲醇溶液（流动相B）
0
85
15
1
60
40
3.5
60
40
6
50
50
10
45
55
15
5
95
20
5
95
23
85
15
28
85
15
a）柱温：
40℃；b）流速：
0.2mL/min；c）进样体积：
5μL。
3.6.2流动相酸度的优化选择
本研究比较了5个不同乙酸浓度的流动相进行等度洗脱的效果，当流动相中不含乙酸的时候，赤霉素出现前延峰。
随着流动相中乙酸浓度的增大，流动相的pH也随之减小，赤霉素色谱峰的前延现象有所改善。
当流动相中乙酸含量为0.1%时，赤霉素的峰型对称性得到了很大改善。
综合考虑，本实验选择乙酸为0.5%。
3.6.3缓冲盐浓度的优化选择
本研究比较了4种不同浓度的乙酸铵对目标物质分离测定效果的影响。
随着流动相中乙酸铵浓度的增大，保留时间发生了明显的变化。
鉴于灵敏度和分离度的影响，综合考虑，本实验选择乙酸铵浓度为为5mM。
3.7准确度
为考察方法的准确度，我们在不同的蔬菜水果等基质中添加不同浓度的目标物进行回收率的试验。
欧盟规定赤霉素的残留限量为5mg/kg。
在本实验中选择苹果、葡萄、黄瓜等7种蔬菜水果及茶叶和茶青进行添加回收率试验，具体结果见表5。
图1不同乙酸浓度下的液相色谱-质谱（LC-MS/MS）色谱图
表6不同样品基质中目标物添加回收率结果（%）
赤霉素（GA3）
样品
添加水平（mg/kg）
重复1
重复2
重复3
平均
相对标准偏差%
桔子
0.1
88.2
99.8
100
96
7.03
0.2
111.1
108.8
114.7
112
2.66
0.4
85.3
93.5
90.5
89.8
4.62
桔子皮
0.2
98.6
103.6
99.6
101
2.63
0.4
82
100
99
93.7
10.8
0.8
92.8
92.4
90.6
91.9
1.27
苹果
0.1
89.1
85.3
84.2
86.2
2.98
0.2
110.1
113.5
113.8
112
1.83
0.4
84.5
87.4
89.8
87.2
3.04
葡萄
0.1
85.1
89.9
93.6
89.5
4.76
0.2
80.9
87.5
87.9
85.4
4.6
0.4
96.7
98.9
99.5
98.4
1.49
西瓜
0.1
109.7
111.5
112.9
111
1.44
0.2
98.8
102.3
100.5
101
1.74
0.4
80.3
85.7
88.2
84.7
4.76
番茄
0.1
76.3
85.5
90.5
84.1
8.56
0.2
94.8
101.5
104.2
100
4.83
0.4
90
101.3
102
97.8
6.88
黄瓜
0.1
93.2
88.2
90.1
90.5
2.78
0.2
90.9
93.1
95.6
93.2
2.52
0.4
98.7
105.2
109.8
105
5.33
油菜
0.1
90.3
95.3
93.5
93
2.72
0.2
88.3
85.1
89.6
87.7
2.64
0.4
83.1
87.3
89.7
86.7
3.85
茶叶
0.1
95.2
91.1
93.2
93.2
2.05
0.2
82.3
76.3
82.3
80.3
3.46
0.4
91.4
86.4
88.2
88.7
2.53
茶青
0.1
90.9
93.9
91.3
92.0
1.63
0.2
82.3
72.3
82.6
79.1
5.86
0.4
80.1
88.1
92.5
86.9
6.29
3.8精密度
3.8.1重复性
在本实验中，在同一实验室，由同一操作者使用相同仪器设备，按相同的前处理方法和测试方法，在短时间内对农产品样品中的赤霉素进行了6次测定，重复性结果见表6-10，相对标准偏差在0.04%-4.55%范围内，符合重复性试验对相对标准偏差的要求。
表7重复性结果-赤霉素
样品
6次重复测定结果
µg/kg
平均
µg/kg
标准
偏差
相对标准
偏差
RSD（%）
1
2
3
4
5
6
番茄
159.28
158.68
159.25
155.49
158.53
157.01
158.04
1.49
0.95
黄瓜
185.64
189.48
188.06
188.76
186.9
187.76
187.76
1.36
0.73
油菜
195.23
196.42
188.57
190.80
190.86
192.41
192.38
2.95
1.54
苹果
147.09
139.05
142.75
143.56
143.45
146.23
143.68
2.84
1.98
葡萄
130.66
132.08
133.48
134.33
135.85
131.86
133.04
1.88
1.41
西瓜
147.98
145.26
144.22
146.04
148.98
145.46
146.32
1.79
1.22
桔子
161.74
162.08
160.56
160.74
160.86
163.09
161.51
0.978
0.61
桔子皮
165.23
166.12
164.75
164.87
165.42
166.04
165.41
0.576
0.35
茶青
200.01
202.02
203.05
201.25
203.21
201.45
202.37
1.58
0.07
茶叶
202.76
201.13
201.57
201.89
203.24
202.19
202.13
0.78
0.04
3.8.2再现性
在本实验中，我们选择了不同部委下属的5家实验室，即农业部蔬菜品质监督检验测试中心、中国检科学院综合检测中心、农业部蜂产品质量监督检验测试中心、中国科学院生态环境研究中心环境水质学室及北京市疾病预防控制中心，分别记为实验室1、实验室2、实验室3、实验室4及实验室5，由不同操作人员使用不同的仪器，对本方法进行了验证。
通过对苹果、桔子和黄瓜3种蔬菜水果中添加3种不同浓度水平，每个样品平行测定3次，分别计算不同样品的平均值、标准偏差、相对标准偏差等各项参数，结果详见表12-17。
3.8.2.1数据汇总
本精密度试验由5个实验室对3个水平作3次测试，测试原始数据及统计结果见下表。
苹果样品
实验室i
1
2
3
4
5
水平j
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
赤霉素
0.1212
0.1804
0.4550
0.1040
0.1818
0.3343
0.0848
0.1817
0.3890
0.0801
0.1653
0.3715
0.0802
0.1903
0.3795
0.1084
0.2356
0.3852
0.0985
0.1755
0.3266
0.0816
0.1879
0.3853
0.0884
0.1631
0.3702
0.0796
0.1942
0.3801
0.1084
0.2234
0.4416
0.1094
0.1858
0.3335
0.0844
0.1816
0.3895
0.0874
0.1629
0.3776
0.0843
0.1926
0.3743
桔子样品
实验室i
1
2
3
4
5
水平j
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
赤霉素
0.0972
0.2291
0.4560
0.0836
0.1554
0.3142
0.0981
0.1982
0.4062
0.0882
0.1867
0.3832
0.0808
0.1803
0.3605
0.0974
0.2223
0.4493
0.0973
0.1409
0.3011
0.0992
0.1894
0.3891
0.0803
0.1836
0.3783
0.0886
0.1792
0.3601
0.0917
0.2312
0.4128
0.0938
0.1539
0.3339
0.0956
0.1872
0.3843
0.0856
0.1779
0.3863
0.0874
0.1828
0.3703
黄瓜样品
实验室i
1
2
3
4
5
水平j
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
赤霉素
0.0898
0.2106
0.3492
0.0757
0.1532
0.3322
0.0792
0.1961
0.3647
0.0862
0.1763
0.3695
0.08017
0.18937
0.38955
0.1036
0.1880
0.3610
0.0665
0.1708
0.3414
0.0788
0.1937
0.3584
0.0884
0.1831
0.3702
0.07863
0.18418
0.38017
0.1130
0.1920
0.4018
0.0681
0.1678
0.3918
0.0725
0.1855
0.365
0.0874
0.1629
0.3783
0.08635
0.18256
0.38423
表8植物性农产品中赤霉素残留实验室间原始数据表（单位：
mg/kg）
苹果样品
实验室i
1
2
3
4
5
水平j
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
赤霉素
0.1127
0.2131
0.4273
0.1040
0.1810
0.3315
0.0836
0.1837
0.3879
0.0853
0.1638
0.3731
0.0814
0.1923
0.3780
桔子样品
实验室i
1
2
3
4
5
水平j
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
赤霉素
0.0954
0.2275
0.4394
0.0916
0.1501
0.3164
0.0976
0.1916
0.3932
0.0847
0.1827
0.3826
0.0856
0.1808
0.3636
黄瓜样品
实验室i
1
2
3
4
5
水平j
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
赤霉素
0.1021
0.1969
0.3707
0.0701
0.1639
0.3551
0.0768
0.1918
0.3627
0.0873
0.1741
0.3727
0.0817
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