新支流法规程标准.docx

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新支流法规程标准

鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感（H9亚型）、传染性法氏囊病四联灭活疫苗（LaSota株+M41株+YBF003株+S-VP2蛋白）

制造及检验试行规程（草案）

本品系用鸡新城疫病毒LaSota株、传染性支气管炎病毒M41株、H9亚型禽流感病毒YBF003株分别接种易感鸡胚培养、收获感染胚液、超滤浓缩后经甲醛溶液灭活；鸡传染性法氏囊病毒系用表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的埃希氏大肠杆菌基因工程菌E.coliBL21/pET28a-VP2（简称S-VP2蛋白）经过发酵培养、诱导表达、菌体破碎、离心去除菌体碎片、提纯、灭活残留细菌；将四种抗原按适当比例混合后加入优质油佐剂，混合乳化制成。

用于预防鸡新城疫、传染性支气管炎、H9亚型禽流感和传染性法氏囊病。

1毒种

1.1毒种来源制造本品用的鸡新城疫病毒LaSota株、效检用鸡新城疫强毒北京株（CVCCAV1611株）、鸡传染性支气管炎病毒M41株、传染性法氏囊病病毒BC6-85株（CVCCAV7株）均购于中国兽医药品监察所，由青岛易邦生物工程有限公司鉴定、保管和供应；鸡传染性法氏囊病生产用菌种为表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的埃希氏大肠杆菌基因工程菌，菌株名称为E.coliBL21/pET28a-VP2（简称S-VP2蛋白）、A型禽流感病毒（H9亚型）A/Chicken/shandong/11/05（H9N2）株（简称YBF003株），由青岛易邦生物工程有限公司鉴定、保存和供应。

1.2毒（菌）种标准

1.2.1鸡新城疫病毒LaSota株应符合下列标准

1.2.1.1对鸡脑内致病指数（ICPI）应为0.1～0.4。

1.2.1.2对鸡胚最小致死量的平均死亡时间（MDT/MLD）应为103～119小时。

1.2.1.3对鸡胚的毒力将毒种用灭菌生理盐水作100倍稀释，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚10个，每胚0.1ml，置36～37℃继续孵育，鸡胚应于接种后24～120小时死亡7个，胎儿须有明显充血、出血病痕。

1.2.1.4红细胞凝集价按现行《中国兽药典》进行测定，含毒鸡胚液对鸡红细胞凝集价应不低于1:

512（微量法）。

1.2.1.5病毒含量将含毒鸡胚液用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10-7、10-8、10-93个稀释度，各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5个，每胚0.1ml，置36～37℃继续孵育，48小时内死亡的鸡胚弃去不计，在48～120小时内死亡的鸡胚随时取出，收获鸡胚液，同一稀释度的胚液等量混合，按稀释度分别测定红细胞凝集价，至120小时，取出所有活胚，逐个收取鸡胚液，分别测定红细胞凝集价，凝集价不低于1:

128（微量法）者判为感染，计算EID50，每0.1ml病毒含量应≥108.0EID50。

1.2.1.6安全性用2～7日龄SPF雏鸡20只，分为两组，第1组10只，每只滴鼻接种5倍稀释的含毒胚液0.05ml；第2组10只，不接种作为对照。

两组在同条件下分别饲养管理，观察10日，应无不正常反应。

如有非特异性死亡，免疫组和对照组均应不超过1只。

1.2.1.7免疫原性对30日龄SPF雏鸡滴鼻免疫，最小免疫剂量应≤5000EID50。

1.2.1.8特异性将毒种用灭菌生理盐水作1000倍稀释（约含105.0EID50/0.1ml），与等量抗新城疫病毒特异性血清混合，置室温中和1小时后，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚10个，每胚0.2ml；同时设病毒对照10个，尿囊腔内接种1000倍稀释的病毒液，每胚0.1ml，观察120小时。

在24～120小时内中和组鸡胚应不引起特异性死亡且至少存活8个，鸡胚液作红细胞凝集试验，应为阴性；对照组鸡胚应至少死亡7个，且鸡胚液作红细胞凝集试验应为阳性。

1.2.1.9纯净按现行《中国兽药典》进行检验，应无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。

1.2.1.10基础种子代数E4-1～E4-10代。

1.2.1.11毒种保存在-70℃以下保存，有效期为72个月。

1.2.2鸡新城疫病毒北京株（CVCCAV1611株）应符合下列标准

1.2.2.1对鸡最小致死量用2～8月龄SPF鸡4只，各肌肉注射10-7或10-8稀释度的病毒液1ml，14日内应全部死于新城疫。

1.2.2.2对鸡胚半数致死量将毒种作10倍系列稀释，取10-6、10-7、10-83个稀释度，各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5个，每胚0.1ml，记录接种后24～72小时死亡且胎儿病痕明显的鸡胚，计算ELD50，每0.1ml病毒含量应≥107.0ELD50。

1.2.2.3纯净性按现行《中国兽药典》进行检验，应无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。

1.2.2.4毒种保存在-70℃以下保存，有效期为72个月。

1.2.3传染性支气管炎病毒M41株应符合下列标准

1.2.3.1对鸡胚的毒力将毒种用灭菌生理盐水作10倍稀释，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚10个，每胚0.1ml，鸡胚应于接种后24～144小时内全部或部分死亡。

存活的鸡胚应表现胎儿失水、卷缩、发育小等特异性病痕，其尿囊液对1%鸡红细胞凝集试验应为阴性。

1.2.3.2病毒含量每0.1ml病毒含量应不低于106.0EID50。

1.2.3.3对雏鸡的毒力用1～7日龄SPF鸡10只，每只以10倍稀释的毒种滴鼻1～2滴（0.025～0.050ml），观察10日，至少应有8只出现鸡传染性支气管炎的典型症状。

1.2.3.4特异性将毒种用灭菌生理盐水稀释100倍（含104.0EID50/0.1ml），与等量鸡抗传染性支气管炎特异性血清混合，置室温中和1小时后，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚10个，每胚0.2ml；同时设病毒对照10个，尿囊腔内接种100倍稀释的毒液，每胚0.1ml，观察至144小时。

在24～144小时内中和组鸡胚应无特异性死亡及鸡胚病变，对照组鸡胚死亡和出现特异性病变的胎儿总数应至少8个。

1.2.3.5免疫原性将毒种接种10日龄SPF鸡胚繁殖，取病毒含量≥106.0EID50/0.1ml的鸡胚液，灭活后按1:

3（水相:

油相）的比例制成灭活疫苗。

用14～42日龄SPF鸡25只，20只各点眼、滴鼻接种传染性支气管炎活疫苗（H120株）1羽份（0.05ml），另5只不接种作为对照。

接种后21～28日，分别采血，分离血清，再颈部皮下或肌肉接种灭活疫苗0.3ml/只，第二次接种后21～28日，再分别采血，分离血清，将两次血清分别作HI抗体效价测定。

免疫组二免血清HI抗体效价的几何平均值（GMT）应较首免血清高4倍以上，对照组血清HI抗体效价的几何平均值应不高于1:

8（微量法）。

1.2.3.6纯净按现行《中国兽药典》进行检验，应无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。

1.2.3.7基础种子代数E1～E6代。

1.2.3.8毒种保存在-70℃以下保存，有效期为72个月。

1.2.4禽流感病毒YBF003株应符合下列标准

1.2.4.1对鸡胚的毒力将毒种用灭菌生理盐水作10000倍稀释（约含103.0EID50/0.1ml）,尿囊腔内接种10～11日龄SPF鸡胚10个，每胚0.1ml，置36～37℃继续孵育，在接种后60～120小时内，应至少有8个鸡胚死亡。

胎儿应表现全身出血、明显水肿、肝脏坏死等病变。

1.2.4.2对雏鸡的毒力将毒种用灭菌生理盐水作10倍稀释，经翅静脉接种28～56日龄SPF鸡10只，每只0.2ml，接种后14日内，应不出现死亡或明显异常反应；接种后3～5日，采集每只鸡的泄殖腔拭子，经处理后，分别经尿囊腔接种10～11日龄SPF鸡胚5个，每胚0.2ml，孵育观察5日，无论死胚、活胚均应测定红细胞凝集价，每个拭子样品接种的5个鸡胚中只要有1个鸡胚液的红细胞凝集价不低于1:

16（微量法），即可判为病毒分离阳性；对病毒分离阴性的样品，应盲传一次后再进行判定。

应至少9只鸡病毒分离阳性。

1.2.4.3病毒含量将毒种用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10-6、10-7、10-83个稀释度，各尿囊腔内接种10～11日龄SPF鸡胚5个，每胚0.1ml，置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，24小时以前死亡的鸡胚弃去不计，在24～120小时内死亡的鸡胚随时取出，收获鸡胚液，同一稀释度的胚液等量混合，按稀释度分别测定红细胞凝集价，至120小时，取出所有活胚，逐个收取鸡胚液，分别测定红细胞凝集价，凝集价不低于1:

16（微量法）者判为感染，计算EID50，每0.1ml病毒含量应≥107.0EID50。

1.2.4.4红细胞凝集价（HA）毒种对鸡红细胞凝集价（HA）应不低于1:

256（微量法）。

1.2.4.5毒种特异性

1.2.4.5.1血凝抑制试验毒种与抗H9亚型禽流感病毒特异性血清应为阳性反应，与SPF鸡血清、禽流感（H5、H7亚型）阳性血清、鸡新城疫阳性血清、减蛋综合征阳性血清均应为阴性反应。

1.2.4.5.2鸡胚中和试验将毒种用灭菌生理盐水作1000倍稀释，与等量抗H9亚型禽流感病毒特异性血清混合，室温中和1小时后，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚10个，每胚0.2ml；同时设病毒对照10个，尿囊腔内接种1000倍稀释的病毒液，每胚0.1ml，观察120小时。

在24～120小时内中和组鸡胚应无特异性死亡，且应至少有9个健活，鸡胚液作红细胞凝集试验，应为阴性反应；对照组鸡胚应至少有8个死亡，且鸡胚液作红细胞凝集试验均应为阳性反应。

1.2.4.6免疫原性取红细胞凝集价不低于1:

256（微量法）的鸡胚液，灭活后按1:

3（水相:

油相）的比例制成灭活疫苗，颈部皮下接种21～28日龄SPF鸡10只，每只0.2ml，另取10只不接种作为对照。

21日后采血，分离血清，测定HI抗体效价，同时翅静脉注射10倍稀释的YBF003株病毒液，每只0.2ml，于攻毒后3～5日采集泄殖腔拭子，经处理后，尿囊腔接种10～11日龄SPF鸡胚5个，每胚0.2ml，孵育观察5日，无论死胚、活胚均应测定鸡胚液红细胞凝集价，每个拭子样品接种的5个鸡胚中只要有1个鸡胚液的凝集价不低于1:

16（微量法），即可判为病毒分离阳性。

对病毒分离阴性的样品，应盲传一次后再进行判定。

免疫组血清HI抗体效价的几何平均值应不低于1:

180（微量法），且病毒分离至少9只为阴性；对照组血清HI抗体效价的几何平均值应不高于1:

4（微量法），且病毒分离至少9只为阳性。

1.2.4.7纯净按现行《中国兽药典》进行检验，应无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。

1.2.4.8基础种子代数E5～E15代。

1.2.4.9毒种的保存在-70℃以下保存，有效期为60个月。

1.2.5表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的埃希氏大肠杆菌基因工程菌（S-VP2蛋白）应符合下列标准

1.2.5.1形态和生化特性培养物涂片为革兰氏阴性短杆菌，可成短链状，在不良的培养条件下可呈现长丝状。

埃希氏大肠杆菌分解葡萄糖，产生的二氧化碳和氢气大约相等；在蛋白胨肉汤中产生吲哚；在0.5%葡萄糖肉汤中，于37℃培养4日后，培养基的pH值低于4.5，甲基红试验呈阳性反应；Voges-Proskauer二氏反应（V.P.反应）阴性；枸橼酸盐试验阴性。

1.2.5.2培养特性LB固体培养平板上的形状为圆形、边缘整齐、突起、乳白色有光泽的光滑菌落。

在加有卡那霉素的培养基中能生长。

1.2.5.3鉴别检验

（1）PCR检测（检测VP2是否表达）在LB固体培养平板上挑取单菌落，加100µl灭菌双蒸水，沸水浴5分钟后，用自备PCR引物扩增VP2基因全片段或部分片段。

使用以下引物进行单菌落DNA扩增能得到约1400bp的扩增片段。

引物15′-CCGAATTCATGACAAACCTGCAAGATC-3′

引物25′-GGAAGCTTTCCTTATGGCCCGGATTATG-3′

使用以下引物扩增能得到222bp的DNA片段。

引物15′-ACAGATTGTTCCGTTCATACG-3

引物25′-TCGAACTTGTAGTTCCCATTG-3’

（2）琼脂扩散试验（AGP,检测表达的VP2蛋白是否有活性）将LB固体培养平板上的工程菌单菌落接种于LB液体培养基中，培养至OD600值在0.6～1.0之间时加入0.2mol/Lα乳糖，至终浓度为0.02mol/L，持续培养5～8小时，收集菌体，超声破碎，8000rpm离心去沉淀，上清液与抗鸡传染性法氏囊病毒特异性血清进行AGP试验，应出现特异的沉淀线。

1.2.5.4免疫原性将AGP效价不低于1∶16的表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的基因工程菌液灭菌后按1∶3（水相∶油相）的比例制成灭活疫苗。

取21～28日龄SPF鸡20只，其中10只各接种疫苗0.2ml，另10只不接种作为对照，同条件下隔离饲养。

接种后21～28日，所有免疫鸡和对照鸡经点眼途径接种100倍稀释的鸡传染性法氏囊病强毒BC6-85株毒液，0.1ml/只（实含毒量≥100个BID）。

攻毒后，每日观察鸡只的临床表现，记录发病和死亡鸡数，至72～96小时，扑杀存活鸡，逐只剖解，观察法氏囊等病变。

免疫鸡应至少8只正常，不出现法氏囊病病变；对照鸡应至少8只发病，出现明显的法氏囊病变（如胸肌或腿肌条状出血、法氏囊肿大或萎缩、发黄、内有胶冻样分泌物等一种以上病变）。

1.2.5.5菌种传代取标准保藏菌种管，进行管外表面消毒后打开，加入LB培养液少许，用接种棒在加有卡那霉素的LB培养平板上划线。

倒置后37℃培养24小时，挑取单菌落，转接于加有卡那霉素的LB培养液中，37℃振荡培养16～18小时。

然后用接种棒在加有卡那霉素的平板或斜面上划线，37℃培养20小时。

封口后，2～8℃保存（10日）。

再从平板上挑取单菌落，按上述方法继续传代。

1.2.5.6纯粹用适宜培养基检查，应纯粹。

1.2.5.7菌种代次基础种子代数1～20代，一级种子继代应不超过4代。

1.2.5.8保存培养物冻干保存，-20℃下有效期为24个月。

1.2.6强毒标准鸡传染性法氏囊病毒BC6-85株（CVCCAV7株）应符合下列标准。

1.2.6.1对鸡的感染量将种毒作10倍系列稀释，取10-3、10-4、10-5、10-64个稀释度，分别点眼接种28～42日龄SPF鸡，0.1ml/只。

攻毒后每天观察鸡只的临床表现及死亡情况，记录发病和死亡鸡数，剖检观察死亡鸡法氏囊等病变，至96小时扑杀存活鸡，逐只剖解，观察法氏囊等病变，以法氏囊肿大、萎缩、发炎、有分泌物等任一项临床表现，判为感染。

最小感染量（BID）应≥10-4.0/0.1ml。

1.2.6.2特异性将毒种用灭菌生理盐水稀释至105.0ELD50∕0.1ml，与等量抗鸡传染性法氏囊病特异性血清混合，置室温中和1小时，以绒毛尿囊膜途径接种10～12日龄SPF鸡胚10个，每胚接种0.2ml；同时设病毒对照10个，每胚接种病毒液0.1ml（含105.0ELD50∕0.1ml），同条件观察168小时。

在24～168小时内中和组鸡胚应全部健活，对照组鸡胚至少死亡9个，鸡胚尿囊液对鸡红细胞凝集试验（HA）应均为阴性。

1.2.6.3纯净检验按现行《中国兽药典》进行检验，应无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。

1.2.6.4保存在-20℃以下保存，有效期为24个月。

在-70℃以下保存，有效期为60个月。

2疫苗制造及半成品检验

2.1生产用毒种制备

2.1.1鸡新城疫病毒LaSota株生产用毒种制备

2.1.1.1毒种繁殖将毒种用灭菌生理盐水作适当稀释（如10-4或10-5），尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml。

选接种后72～120小时死亡且病痕明显的鸡胚，分别收获鸡胚液（尿囊液及羊水），装于灭菌容器内。

将检验无菌、对1%鸡红细胞凝集价不低于1:

512（微量法）的鸡胚液混合，定量分装于无菌安瓿中，冷冻保存。

注明收获日期、毒种代次等。

2.1.1.2毒种鉴定按1.2.1.3、1.2.1.4、1.2.1.5、1.2.1.8和1.2.1.9项进行，应符合规定。

2.1.1.3毒种保存在-15℃以下，应不超过6个月。

2.1.1.4毒种继代应不超过3代。

2.1.2鸡传染性支气管炎病毒M41株生产用毒种制备

2.1.2.1毒种繁殖将毒种用灭菌生理盐水作适当稀释（如10-2～10-3），尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml。

选接种后30～48小时内死亡的鸡胚及48小时存活的鸡胚胚液（尿囊液及羊水），装于无菌容器内。

将检验无菌、病毒含量≥106.0EID50/0.1ml、对1%鸡红细胞凝集试验为阴性的胚液混合，定量分装于无菌安瓿中，冷冻保存。

注明收获日期、毒种代次等。

2.1.2.2毒种鉴定按本试行规程1.2.3.1、1.2.3.2、1.2.3.4、1.2.3.6项进行，应符合规定。

2.1.2.3毒种保存在-15℃以下保存，应不超过6个月。

2.1.2.4毒种继代应不超过3代。

2.1.3禽流感病毒YBF003株毒种制备

2.1.3.1毒种繁殖将毒种用灭菌生理盐水作适当稀释（如10-3或10-4）,尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚,每胚0.1ml。

选接种后72～120小时死亡且病痕明显的鸡胚,分别收获鸡胚液（尿囊液及羊水）,装于灭菌容器内。

将检验无菌、对1%鸡红细胞凝集价不低于1:

256（微量法）的鸡胚液混合,定量分装于安瓿中,冷冻保存，注明收获日期、毒种代次等。

2.1.3.2毒种鉴定按1.2.4.1、1.2.4.3、1.2.4.4、1.2.4.5、1.2.4.7项进行,应符合规定。

2.1.3.3毒种保存在-15℃以下，应不超过6个月。

2.1.3.4毒种继代应不超过3代。

2.1.4表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的生产用菌种制备

2.1.4.1一级种子繁殖和鉴定将各株冻干菌种分别接种于加卡那霉素的LB液体培养基中，35～36℃培养24小时，然后划线接种于加卡那霉素的LB固体培养基上培养，选取符合1.2.5.2项标准的典型菌落10个混合于少量LB培养液中，接种于LB琼脂斜面若干支、置35～36℃培养20～24小时，作为一级种子。

在2～8℃保存，不超过14日；在培养基上传代，应不超过4代。

2.1.4.2二级种子繁殖取一级种子接种于加卡那霉素的LB培养液中，35～36℃培养20～24小时。

置2～8℃保存，应不超过3日。

2.2制苗材料选择鸡新城疫、传染性支气管炎、H9亚型禽流感病毒液的制备，选择发育良好的10～11日龄易感鸡胚作为制苗材料。

表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的埃希氏大肠杆菌基因工程菌的培养基为改良LB培养基，见附注。

2.3制苗用病毒液的制备

2.3.1鸡新城疫病毒液的制备

2.3.1.1接种取生产用毒种，用灭菌生理盐水作适当稀释（如10-4或10-5），按《全自动接种机使用说明》要求，接种10～11日龄易感鸡胚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻胚。

2.3.1.2孵育与观察鸡胚接种后，每日照胚1次，将60小时前死亡的鸡胚弃去。

此后，每4～6小时照胚1次，死亡的胚随时取出，至96小时，无论死亡与否，全部取出，气室向上，置于2～8℃冷却12～24小时。

2.3.1.3收获将冷却的鸡胚取出，按《全自动收获机使用说明》要求，收获鸡胚尿囊液（先收活胚后收死胚）。

吸取胚液放于50000ml灭菌容器内，抽样测定红细胞凝集价。

凝集价低于1:

256（微量法）者应弃去。

同时按现行《中国兽药典》进行无菌检验（可不移植），应无菌生长。

收获的胚液灭活前在2～8℃保存，应不超过5日。

2.3.1.4浓缩将收获的胚液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机浓缩，至少浓缩4倍，抽样测定红细胞凝集价，凝集价不低于1:

2048（微量法）时停止浓缩，按现行《中国兽药典》进行无菌检验（可不移植），应无菌生长，并留样备测毒价。

浓缩后的胚液随即进行灭活。

2.3.1.5灭活将鸡新城疫病毒液导入灭活罐内，计量加入10%甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.1%。

加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。

37℃灭活16小时（以罐内温度达到37℃开始计时，开启搅拌机连续搅拌）后取出，放2～8℃保存，应不超过1个月。

2.3.2鸡传染性支气管炎病毒液的制备

2.3.2.1接种取生产用毒种，用灭菌生理盐水作适当稀释（如10-2或10-3），按《全自动接种机使用说明》要求，接种10～11日龄易感鸡胚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻胚。

2.3.2.2孵育和观察鸡胚接种后24小时照胚1次，弃去死胚。

此后每4小时照胚1次，死亡的鸡胚随时取出，直至48小时，无论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于2～8℃中冷却12～24小时。

2.3.2.3收获将冷却的鸡胚取出，按《全自动收获机使用说明》要求，收获鸡胚尿囊液（先收活胚后收死胚）。

吸取胚液放于50000ml灭菌容器内，抽样检测病毒含量，应≥106.0EID50/0.1ml。

同时按现行《中国兽药典》进行无菌检验（可不移植），应无菌生长。

收获的胚液灭活前在2～8℃保存，应不超过5日。

2.3.2.4浓缩将收获的胚液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机浓缩，至少浓缩4倍，同时按现行《中国兽药典》进行无菌检验（可不移植），应无菌生长，并留样备测毒价。

浓缩后的胚液随即进行灭活。

2.3.2.5灭活将传染性支气管炎病毒液导入灭活罐内，计量加入10%甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.1%。

加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。

37℃灭活16小时（以罐内温度达到37℃开始计时，开启搅拌机连续搅拌）后取出，放2～8℃保存，应不超过1个月。

2.3.3H9亚型禽流感病毒液的制备

2.3.3.1接种取生产用毒种，用灭菌生理盐水作适当稀释（如10-3或10-4），按《全自动接种机使用说明》要求，接种10～11日龄易感鸡胚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻胚。

2.3.3.2孵育和观察鸡胚接种后，每日照胚1次，将48小时前死亡的鸡胚弃去。

此后，每4～6小时照胚1次，死亡鸡胚随时取出，直至96小时，无论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于2～8℃冷却12～24小时。

2.3.3.3收获将冷却的鸡胚取出，按《全自动收获机使用说明》要求，收获鸡胚尿囊液（先收活胚后收死胚）。

吸取胚液放于50000ml灭菌容器内，抽样测定红细胞凝集价。

凝集价低于1:

256（微量法）者应弃去。

同时按《中国兽药典》进行无菌检验（可不移植），应无细菌生长。

收获的胚液灭活前在2～8℃保存，应不超过5日。

2.3.3.4浓缩将收获的鸡胚病毒液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机浓缩，至少浓缩4倍，抽样测定红细胞凝集价，凝集价不低于1:

1024（微量法）时停止浓缩。

按现行《中国兽药典》进行无菌检验（可不移植），应无细菌生长，并留样备测毒价。

浓缩后的胚液随即进行灭活。

2.3.3.5灭活将H9亚型禽流感病毒液导入灭活罐内，计量加入10%甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.1%。

加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。

37℃灭活16小时（以罐内温度达到37℃开始计时，开启搅拌机连续搅拌）后取出，放2～8℃保存，应不超过1个月。

2.3.4