elisa酶联免疫吸附实验报告docx.docx
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elisa酶联免疫吸附实验报告
elisa酶联免疫吸附实验报告
一．实验目的
酶联免疫吸附测定（enzyme-linkedimmunosorbentassay简称ELISA）是在免疫酶技术（immunoenzymatictechniques）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原）,再加相应酶标记抗体（抗原）,生成抗原（抗体）－－待测抗体（抗原）－－酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。
借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。
待测抗体（抗原）的定量与有色产生成正比。
二．实验原理
用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。
常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。
由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。
传染病等方面的免疫诊断。
也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。
不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。
本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。
因此ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大，可概括四个方面：
1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。
2、研究抗酶抗体的合成。
3、显现微量的免疫沉淀反应。
4、定量检测体液中抗原或抗体成份。
基本方法一 用于检测未知抗原的双抗体夹心法:
1. 包被：
用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。
在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。
（简称洗涤，下同）。
2. 加样：
加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。
然后洗涤。
（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。
3. 加酶标抗体：
于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml。
37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4. 加底物液显色：
于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5. 终止反应：
于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6. 结果判定：
可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：
反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。
也可测O•D值：
在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔O•D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
基本方法二 用于检测未知抗体的间接法：
用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。
次日洗涤3次。
↓
加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。
（同时做空白、阴性及阳性孔对照）
↓
于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。
↓
其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。
（二）酶与底物
酶结合物是酶与抗体或抗原,半抗原在交联剂作用下联结的产物。
是ELISA成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物。
免疫技术常用的酶及其底物
酶底物显色反应测定波长
辣根过氧化物酶邻苯二胺橘红色492*
四甲替联苯胺黄色460**
氨基水杨酸棕色449
邻联苯甲胺兰色425
2,2＇-连胺基-2（3-乙基-并噻唑啉磺酸-6）铵盐蓝绿色642
碱性磷酸酯酶4-硝基酚磷酸盐（PNP）黄色400
萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐红色500
葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖黄色405,420
葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰深蓝色
β-Ｄ－半乳糖苷酶甲基伞酮基半乳糖苷（4MuG）荧光360,450
硝基酚半乳糖苷（ONPG）黄色420
*终止剂为2mol/LH2SO4
**终止剂为2mol/L柠檬酸，不同的底物有不同的终止剂。
可催化下列反应：
HRP+H2O2→复合物复合物+AH2→过氧化物酶+H2O+AAH2——为无色底物,供氢体；A——为有色产物。
（三）ELISA常用的四种方法
1．直接法测定抗原
将抗原吸附在载体表面；
加酶标抗体，形成抗原—抗体复合物；
加底物。
底物的降解量＝抗原量。
2．间接法测定抗体
将抗原吸附于固相载体表面；
加抗体,形成抗原-抗体复合物；
加酶标抗体；
加底物。
测定底物的降解量＝抗体量。
3．双抗体夹心法测定抗原
将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附于固相表面;
加抗原，形成抗原-抗体复合物;
加抗原免疫第二种动物获得的抗体，形成抗体抗原抗体复合物;
加酶标抗抗体（第二种动物抗体的抗体）;
加底物。
底物的降解量＝抗原量。
4.竞争法测定抗原
将抗体吸附在固相载体表面;
（1）加入酶标抗原；
（2）,（3）加入酶标抗原和待测抗原；
加底物。
对照孔与样品孔底物降解量的差＝未知抗原量。
三．仪器和材料
1.聚苯乙烯微量细胞培养板（平板,40,96孔）。
2.酶联免疫检测仪
3.辣根过氧化物酶羊抗兔IgG,工作稀释度1:
1000。
4.包被液:
：
0.05mol/LpH9.6碳酸缓冲液,4℃，保存, Na2CO30.15克,NaHCO30.293克,蒸馏水稀释至100ml。
5.稀释液：
0.01mol/LpH7.4PBS－－Tween－－20,４℃，保存.NaCl8g,KH2PO40.2g,Na2HPO4.12H2O2.9g,Tween—20，0.5ml.蒸馏水加至1000ml。
6.洗涤液：
同稀释液
7.封闭液：
0.5%鸡卵清蛋白，pH7.4PBS。
8.邻苯二胺溶液（底物）：
临用前配制0.1M柠檬酸（2.1g/100ml）,6.1ml0.2MNa2HPO4.12H2O （7.163g/100ml） 6.4ml,蒸馏水12.5ml,邻苯二胺10mg,溶解后,临用前加30%H2O240微升。
9.终止液：
2mol/LH2SO4。
四.操作步骤
1.包被抗原：
用包被液将抗原作适当稀释,一般为1～10微克/孔，每孔加200微升，37℃温育1小时后，4℃冰箱放置16～18小时。
2.洗涤：
倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。
3.加封闭液200微升，37℃放置一小时。
4.洗涤同2。
5.加被检血清：
用稀释液将被检血清作几种稀释,，每孔200微升。
同时作稀释液对照。
37℃放置2小时。
6.洗涤同2。
7.加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG,每孔200微升,放置37℃1小时。
8.洗涤同2。
9.加底物：
邻苯二胺溶液加200ml，室温暗处10－－15分钟。
10.加终止液：
每孔50微升。
11.观察结果：
用酶联免疫检测仪记录490nm读数。
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