单倍体技术在玉米育种上的应用研究进展汇编Word文档下载推荐.docx

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在国外已经投入了大量的人力、物力、财力进行了卓有成效的研究工作。

单倍体技术在自交系的选育过程中已经是主要的、常规的方法之一,综述单倍体技术的应用与研究进展,促进单倍体技术在玉米育种中的应用十分必要。

1关于单倍体的几个基本问题

单倍性（haploid）变异【3】是指同一物种中出现体细胞只具有配子染色体数目（n）的变异（刘大钧，1998）携有配子染色体数目的个体称为单倍体。

被子植物中单倍体现象是很广泛的。

Katayama（1935）以细胞遗传学特点为依据，提出了为单倍体分类的方法，即根据原始个体的倍数性水平，把所有单倍体分为两个基本类型：

一倍体是从具有二倍染色体数的个体所产生的单倍体；

多倍单倍体是从具有多倍染色体数的个体所产生的单倍体。

霍赫洛夫等（1970）根据细胞核和细胞质所决定的单倍体的遗传结构为基础，给出如下的单倍体分类：

母性单倍体。

从减数卵细胞或由有机体的母本有性组织【4】

（胚囊）的细胞发育而成的单倍体，具有来自同一个体的细胞质和细胞核。

雄核发育单倍体。

从卵细胞或胚囊的任何其它细胞发育而来，其染色体被外来精子的染色体所代换，这类单倍体具有质核杂种的性质。

花药单倍体。

从雄性的（花粉粒）细胞发育而来，具有同一个体的细胞质和细胞核。

不同类型的单倍体其基因型的特性是不同的，母性单倍体和花药单倍体都具有来自同一个体的染色体和细胞质；

而雄核发育单倍体则不同，它是从父本获得染色体，从母本获得细胞质。

弄清这种差异对于在育种和遗传中有效地利用单倍体技术将会大有帮助。

2　如何获得单倍体

2.1自然发生的单倍体

在自然界，大多数生物是二倍体，而动物几乎都是二倍体。

在植物中，大多数低等植物的生命周期的主要阶段是单倍体，是由配子（孢子）直接产生的，不会出现不育性问题。

高等植物自然发生的单倍体，一般是由于生殖过程异常所引起的孤雌或孤雄生殖而来的。

由于高等植物中的单倍体高度不育，其植株和它的组织器官等都比它们的二倍体和双倍体弱小，

所以，在自然界存在的单倍体很少。

2.2人工诱变单倍体

2.2.1远缘杂交　

亲缘关系较远的花粉一般很难与母本卵细胞发生受精作用,但却具有刺激卵细胞的作用,使其单性发育成为单倍体或双倍体。

在玉米远缘杂交过程中,可能由于双亲体细胞分裂周期的不同步,导致某一亲本染色体的丢失,从而引起单倍体的发生。

朱庆麟等（1979）用失活花粉、衰老而丧失受精能力的花粉、无授粉能力的幼嫩花粉及异种花粉诱发玉米孤雌生殖,诱导率较低,而用向日葵、南瓜和棉花花粉混合给玉米授粉,诱导率比分别授粉高。

远缘花粉诱导孤雌生殖【5】效果不稳定,不同材料的变异很大。

2.2.2孤雌生殖

利用异种花粉授粉，刺激未受精卵发育引起孤雌生殖产生单倍体；

利用X或紫外线来处理玉米成熟花粉粒，并用辐射过的花粉给正常植株授粉，让已无授精能力的花粉去刺激未受精的卵细胞单性发育成单倍体的胚；

利用甲苯胺蓝（TB）

【6】处理花粉也能产生单倍体。

2.2.3孤雄生殖

孤雄生殖就是花药离体培养。

以单核期的花药为材料,利用组织培养技术诱导其分裂形成愈伤组织或胚状体,再转入分化培养基形成再生苗,然后转至生根培养基诱导生根,形成单倍体植株。

这个方法的缺点是：

要经过组织培养的过程，先诱导愈伤组织，再分化形成再生植株，并非每个小孢子都能无性增殖。

此外，二倍体化以后，因适应性问题而出现生长或结实的困难。

花培育种效率不高，除了受基因型影响外，绿苗诱导率低和染色体加倍的困难也是原因之一。

2.2.4核质互作

据报道，在小麦中连续回交进行核置换时，发现单倍体出现的频率极高（53%--93.8%）Mukai（1983）认为，这是由于1BS上抑制单倍体发生的基因随着1BS被1RS代换而丢失，而1RS不能补偿1RS在这方面的功能。

该途径产生单倍体的频率虽然很高，但是在单倍体二倍体化后依然是雄性不育，在育种中难以利用。

2.2.5利用单倍体诱导系杂交获得玉米单倍体

利用远缘杂交、孤雌生殖、孤雄生殖等诱导产成单倍体的方法均有各种不足,无法使单倍体技术广泛的应用于玉米育种。

利用单倍体诱导系作亲本杂交时,能显著提高另一亲本产生单倍体的频率。

1950年美国的NorthrupKing种子公司发现了一个高频诱导单倍体的材料，为早熟、白色、粉质、硬粒型的玉米，送给威斯康辛大学作遗传研究。

EdCoe（1956）发现这份材料有利用的价值，并导入了控制子粒性状和植株性状的两种显性标记基因（R-nj、Pl），有经过两次回交和两次自交，然后定名为Stock6。

它具有两个标记性状：

子粒Navajo斑纹【7】，是由A1A2C1C2R-nj互补基因控制；

成株叶片和叶鞘呈紫色，是由AIA2C2BP1互补基因控制。

Stock6诱导单倍体的原理是选择受精，即Stock6花粉粒中的两个精核，在受精过程中运行的速度不同，往往形成两种不同的单受精形式。

一种是两个精核中的一个优先进入卵细胞与卵核结合，另一个精核由于某种原因死亡，形成紫胚芽尖、非紫粒顶的二倍体籽粒。

另一种是两个精核中的一个，与两个极核选择受精，另一个精核死亡，形成紫粒顶、无色胚芽尖的单倍体籽粒。

在育种中用Stock6作父本，被诱导的育种材料作母本，大约有3%的单倍体。

此外，Kermicle发现的ig基因【8】，chase的A358，Trynov和Zavalishina使用的ZMS,Chalyk使用的MHI及中国农业大学宋同明使用的农大高诱一号等,它们都可以产生3%左右的单倍体。

在这些材料中目前利用最多的是Stock6单倍体技术，用Stock6单倍体宣布与技术选育自交系只需2--3代就可以育出新系。

Stock6与基础材料杂交时，必须用Stock6做父本。

杂交穗数一般是100穗以上!

以保证单倍体的发生率。

不同的材料和环境，单倍体发生率有所不同，一般为1%--5%，自然加倍率为10%左右。

1987年张铭堂博士用此技术获得249个双单倍体纯系，并已育成2玉米个自交系，并配出优良杂交种。

1993年张铭堂博士用Stock6做父本，与杜邦公司的高油玉米杂交种杂交，获得300多个纯系。

张铭堂用Stock6做父本，诱导单交种Oh43×

Mo17，共获得660个杂交果穗，305110粒种子，经籽粒标记选择，最后获得249个双单倍体纯系，经过同工酶分析【9】、形态性状鉴别和产量测试后，2份优良自交系作为高产杂交种的亲本进入市场销售。

我国的学者对Stock6作了有效的改造，刘志增从BHO/Stock6的自交后代中育成了我国第一个孤雌生殖诱导系---高诱1号，其诱导率可高达5.8%，比Stock6高出5倍，已经用于育种实践。

目前许多育种单位也都尝试着应用Stock6进行自交系选育。

3单倍体的鉴定方法

3.1细胞遗传学方法

最准确的方法是用根尖分生组织压片观察体细胞中或减数分裂细胞中的染色体数目，可区分整倍单倍体和非整倍单倍体。

利用光度计法分析细胞核中DNA含量，但不能区分整倍单倍体和非整倍单倍体，又由于该法检测速度慢和需要仪器设备，不适合在田间进行大批量地鉴定。

3.2形态学和解剖学方法

利用植株、种子形态学的明显差异是鉴定单倍体最直观、经济、便捷的方法，在幼苗期可以用目测选出大部分的单倍体。

单倍体在正常生长状态下常常比它的标准类型小得多；

在解剖学上观察叶片表皮气孔、保卫细胞的大小和数目，也可以区分单倍体和二倍体。

3.3射线照射法

植物对辐射的敏感性随着倍数性的变化而变化是生物学的一般规律。

基本方法是用电离射线照射，如6射线）叶片的一部分，先看到褪绿，而后出现辐射坏死。

关键是要探索出不同作物的最适剂量和照射时间，如果掌握的好，该法可成为最简便和实用的鉴定方法之一。

3.4遗传标记法

利用遗传标记是目前最简便有效的单倍体鉴定方法。

在玉米中，著名的Navajo标记基因R--nj，是利用较成功的。

Coe的Stock6和宋同明的高诱1号单倍体诱导系，导入了籽粒和植株显色的遗传标记基因。

由单倍体诱导系诱导出的子粒分三种类型：

胚乳糊粉层呈现紫色或紫红色%胚芽部位也呈现、紫色或紫红色；

胚乳糊粉层呈现紫色或紫红色标记，胚芽部位无色；

胚乳糊粉层和胚芽部位均不显色（无标记）。

张铭堂（1998）报道：

第一、第三类型的子粒占绝大多数，为二倍体子粒；

第二类型子粒所占的比例很小，为单倍体子粒。

根据子粒的颜色标记特征，对单倍体做出初步判断之后，还可在田间根据植株ABP1紫色标记【10】对单倍体做出进一步的判别：

凡幼苗叶鞘全部为紫色者不是单倍体。

在拔节期，单倍体植株大多表现出生长缓慢、植株矮小、叶片短和颜色浅等特点；

此外，玉米植株的育性也是鉴别玉米单倍体的一个重要指标。

玉米的单倍体植株由于只含有一套染色体组，通常都是雄性不育或育性很低。

综上所述，单倍体的鉴定方法很多，但是运用之妙存乎一心。

在育种实践中，结合育种家的经验，灵活运用诸方法，无疑是成功的关键。

4单倍体的二倍体化方法

在使用单倍体诱导系选系程序中，单倍体个体必须加倍成为二倍体才能产生可育后代，单倍体的加倍频率直接关系到单倍体育种的效率。

加倍方法主要有自然加倍和人工加倍两种方法。

4.1自然加倍

Chase研究表明：

在一般情况下单倍体植株表现为雌雄不调，正常花粉粒很少，所以单倍体自然加倍的频率仅占全部单倍体植株的10%左右，Chalyk研究发现单倍体植株在生长发育的过程中，只有0.4%--1.2%的植株可以自然加倍成二倍体。

Zabirova等认为许多材料自然加倍率低于2%。

也有的材料不发生自然加倍。

可见仅依靠单倍体的自然加倍难以满足育种实践的要求，必需对其进行人工加倍!

以提高其育性，通过自交以获得更多的纯合二倍体种子，以便从中选育出优良的自交系。

4.2人工加倍

单倍体的人工加倍，目前主要是利用秋水仙素处理单倍体的根尖或茎尖生长点。

基本上有3种方式：

处理萌发的种子，

处理根尖，

处理茎尖生长点。

其中效果较好的是第二和第三种方式。

处理根尖，在实际操作中会受到一些限制，而处理顶端分生组织较为方便，可采用微量注射【11】和涂抹。

刘志增等在拔节期将0.1ml的不同浓度（0.01%、0.05%、0.10%）的秋水仙素注射到茎尖生长点偏下的组织中，结果在0.01%低浓度下效果最好，随着浓度的提高，受害植株的数量也在增加。

Gagen.P【12】等用不同浓度（0.03%、0.06%、0.10%）的秋水仙素，在两个不同温度（18℃和25℃）下分别对单倍体的种子和幼苗进行不同时间（6h、12h、24h）的处理，结果证明，在18℃左右的温度下，用0.06%的秋水仙素处理12h，单倍体加倍的百分率为18.05%；

张铭堂认为，如果扣除自然加倍的频率，人工化学加倍的效果尚不十分显著。

此外!

我们不能忽略环境条件对单倍体加倍效果的影响。

所以，有效的单倍体加倍方法是单倍体技术能否在作物育种中广泛应用的关键问题之一。

5单倍体在玉米育种中的应用

单倍体技术选育玉米自交系在国外已经广泛使用,目前国外大约60%的马齿型自交系【13】，30%的硬粒型【14】自交系由单倍体技术选育出来。

在我国最早开展此项研究的是中科院遗传所,通过孤雌生殖技术,在不到20天里育成3000多个孤雌生殖纯系,其中综合性状优良或个别性状突出,可直接或者间接用于育种的近350个,此外近几年中国农业大学、华中农业大学、河北农业大学、吉林省农业科学院、山东省农业科学院和辽宁省农业科学院等也都先后从事了这方面的研究,目前也都育成了多个性状较优良的DH系，并且选育出多个优良组合参加国家级和省级区域试验,有的组合已经通过审定并在生产上推广。

6玉米单倍体育种存在的问题及发展前景

玉米双单倍体育种技术是一项革新育种技术。

利用单倍体育种方法，可以大大缩短育种年限、加快育种进程、降低育种成本，在玉米商业育种中的应用前景是十分广阔。

其技术体系开发利用方兴未艾，在美国早已投入商业育种。

目前我国尚处于技术熟化改良阶段。

玉米双单倍体育种当前主要存在的三个问题：

一是单倍体的诱导频率不高，仅为3%难以获得足够数量的单倍体育种材料；

二是单倍体二倍化率低，一般为10%；

三是不能有效打破不良基因的连锁，且基因间的重组率较低。

单倍体技术在玉米育种中的应用前景十分诱人。

如与种质扩增和新材料的创制紧密融合起来，先进行优良基因重组，聚合尽可能多有利基因，然后采用单倍体诱导技术快速获得新型“三高”自交系，将极大提高育种效率和杂种优势水平。

单倍体在遗传学研究上具有重要的研究价值，可应用于遗传图谱的构建【15】、基因定位及克隆。

通过进一步完善玉米单倍体诱导育种技术体系，进一步提高单倍体诱导率【16】和染色体加倍率，建立成熟、配套的技术体系，无疑将实现玉米杂交育种的重大技术革新。

参考文献

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Abstract:

Briefintroductionwaspresentedontheprogressesandapplicationofhaploidymethodincropbreeding.Especiallyinmaize,andsummerizedhowtoobtainahaploidandhowtomakeitdiploidization.Andalsopresentedsomeinducerlinesderivedfromstock6.Thecommentaboutthefutureutilizationofhaploidytechnologyinmaizebreedingwasproposed.

KeyWord:

Maize;

Haploidy;

Breeding