基因工程实验教案Word文档格式.docx

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实验七目的片段回收和BL21感受态制备

实验八转化和重组子筛选

实验九重组子鉴定（酶切和PCR）

实验十诱导表达和样品的制备

实验十一SDS-PAGE

开放实验，克隆和表达一个已知的原核基因

实验一基因工程试验准备

实验内容提纲：

主要讲解：

整个基因工程试验目的和流程、实验准备（培养基制作、菌种活化、药品配制）

一、实验室安全常识（禁食，安全防护，废弃物处理），药品性质（危害，毒性，正确使用方法），存放条件及紧急突发事故的处理（烧伤，化学腐蚀，中毒，火灾）；

1、禁食；

2、废弃物处理：

（1）废弃的培养基，需用消毒液浸泡30min以上；

（2）致病菌培养基需高压灭菌后废弃。

3、化学药品火灾处理：

就近用水稀释药剂，防火，若出现明火，脱离火场，报警并报告老师。

二、实验仪器的安全操作及简单维护；

（电路检查，重点：

电炉、烘箱、离心机的使用、观看教学片。

）

三、基因工程实验整体安排

目的是克隆和表达一个原核基因

四、溶液配制方法、基因组提取溶液、质粒提取溶液配制、琼脂糖电泳液配制

五、培养基的配制[每组固体培养基4瓶（150ml）、液体培养基30支5ml、5瓶50ml]

六、菌种的活化、标记、清洁工作

七、各种需要的培养皿、枪头、EP管灭菌等

八、注意克隆载体、表达载体、不同基因型大肠杆菌

原核基因克隆简要流程：

1.染色体DNA提取

2.PCR扩增目的基因

3.回收目的基因、连接、转化（克隆载体）

4.重组子筛选和质粒鉴定

5.酶切回收目的基因、连接、转化、鉴定（表达载体）

6.诱导表达

7.SDS-PAGE检测

8.目的基因表达产物回收

原核基因克隆详细流程：

1.染色体DNA提取、电泳检测

2.PCR扩增目的基因、电泳检测、大量扩增、目的片段回收、电泳检测

3.目的片段和T载体连接过夜、DH5α感受态制备（用于克隆T载体）

表达载体制备（PET）

4.转化、过夜培养、重组子筛选（蓝白斑、抗生素）

质粒提取、电泳检测

5.质粒提取、电泳检测、鉴定（酶切、PCR）、电泳检测

大量酶切回收目的片段、电泳检测

6.大量酶切回收目的片段、电泳检测

11.SDS-PAGE、染色

10.培养诱导表达（IPTG）、菌体回收、点样品制备

9.质粒提取、电泳检测、鉴定（酶切、PCR）、电泳检测

8.转化、过夜培养、重组子筛选（抗生素）

7.目的基因和表达载体连接过夜、BL21感受态制备（用于克隆表达载体）

12.表达产物回收

一、实验目的

掌握细菌染色体DNA的常规制备方法，要求学会根据不同实验需求选择不同实验方法。

二、实验原理

（见书p19，以此法为准）

基因组DNA抽提的基本原理

基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交（包括RFLP）及PCR分离基因等。

利用基因组DNA较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。

加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中，可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，从而达到提取的目的。

在提取过程中，染色体会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓，以保证得到较长的DNA。

一般来说，构建基因组文库，初始DNA长度必须在100kb以上，否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。

而进行RFLP和PCR分析，DNA长度可短至50kb，在该长度以上，可保证酶切后产生RFLP片段（20kb以下），并可保证包含PCR所扩增的片段（一般2kb以下）。

不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同，不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。

在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法，以获得可用的DNA大分子。

尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用，因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时，应考虑除去多糖和酚类物质。

目前针对不同类型的细胞均开发除了相应的抽提试剂盒。

常规实验中从细菌基因组上PCR扩增目的基因时，一般所用的DNA量较少，可以采用较简单的沸水浴裂解法制备少量的DNA。

在短时间的热脉冲下，细胞膜表面会出现一些孔洞，此时就会有少量的染色体DNA从中渗透出来，然后离心去除菌体碎片，上清中所含的基因组DNA即可用于PCR模板。

而对于大量的基因组DNA制备（如SouthernBlotting，需大量基因组），可采用试剂盒抽提。

三、实验仪器、材料与主要试剂

1、仪器

恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅、1.5mL离心管、枪

2、试剂

（1）溶液I碱溶法抽提质粒DNA

（2）溶液II碱溶法抽提质粒DNA

（3）溶液III（pH5.53MKAc）

（4）苯酚饱和溶液

（5）氯仿

（6）异丙醇

（7）SDS（10％）

（8）NaOH（2M）

（9）NaCl（5M）

（10）RNaseA（10mg/ml）

固体粉末溶于无菌水后煮沸10分钟，后冷却并分装于小管中-20℃保存

四、实验步骤

1、沸水浴制备染色体DNA

（1）在Eppendorf管中加入100μl的ddH2O，挑入米粒大小的菌团，充分悬浮并混匀。

（2）上述菌体悬浮液沸水煮20秒。

（3）迅速放置于常温下15000rpm离心10分钟。

（4）用牙签挑去菌体碎片（白色沉淀），上清待用。

2、大肠杆菌中染色体DNA的抽提

（1）大肠杆菌一级瓶培养过夜，以10%的接种量接二级瓶培养4～5小时后，培养物以50ml/管离心收获（8000rpm，5min，4℃）。

（2）菌体沉淀中加入10mlBufferA，旋涡振荡混匀，37℃保温30分钟。

（3）取出后加入10%SDS至最终浓度为1%，轻轻混匀，37℃保温30分钟澄清即可。

（4）取出后加入20mg/ml的ProK至最终浓度为5μg/ml，60℃保温1小时。

（染色体DNA结合蛋白的消化）

（5）取出后加入预冷的5MNaCl至最终浓度为1M，混匀后冰浴30分钟（溶液要混合成为均相，并且冰浴要充分，时间可适当延长）。

（6）取出后4℃，15000rpm离心30分钟。

（离心前样品管要进行平衡，以免离心机受损）

（7）在上清液中加入6ml苯酚和6ml氯仿混合液，混匀，室温下12,000rpm离心30分钟。

（8）在上清液中加入10ml氯仿，混匀，室温下12000rpm离心30分钟。

（9）取上清液，加一倍量异丙醇沉淀DNA，冰浴放置30分钟，15000rpm离心30分钟。

（10）75%冰乙醇洗涤5分钟。

（11）晾干后，用300μl无菌双蒸水溶解染色体DNA，在37℃水浴中放置30分钟。

（12）用2～2.5体积的无水乙醇沉淀（加入pH5.5的KAc0.1体积）。

（13）沉淀洗涤，抽干后用ddH2O溶解，分装并保存于-20℃。

五、实验结果

琼脂糖凝胶电泳

六、思考题

大肠杆菌DNA提取和质粒DNA提取有何区别

实验三目的基因扩增（PCR）和DNA片段回收

介绍凝胶电泳中DNA片段回收的各种方法及优缺点，要求学会根据不同回收对象选择不同的回收方法。

1、目的基因PCR（大体系）、电泳检测、如果有就回收

2、DNA片段回收、用试剂盒

DNA片段的分离与回收是基因工程操作中一项重要的技术，如可收集特定酶切片段用于基因克隆或是制备探针，回收PCR产物用于再次鉴定等。

理想的DNA片段回收方法应满足以下几个要求：

（1）回收片段应有非常高的纯度

如从普通凝胶中分离出来的片段不可带有即使是微量的凝胶――凝胶会抑制大部分的酶活力，对于后续DNA片段用于再酶切分析或连接均是不利的。

（2）回收过程必须是严格的无DNA酶污染的操作过程

衡量的Dnase均可能使回收的目的DNA片段降解，当降解作用仅发生在粘性末端时，在凝胶电泳中是无法看到回收的DNA片段有任何差异，但会导致DNA连接实验的失败，最终影响后续的克隆实验。

（3）能回收不同大小的DNA片段

对于采用的回收方法必须能对不同大小的DNA片段均能回收，当回收大片段时不发生机械性损伤与断裂作用，造成大片段断裂。

（4）回收效率要高

回收方法要能对微量DNA也能进行操作，也即回收效率相对要较高，则对于实验中获得的非常微量的DNA样品也可进行分析。

（5）操作简单、快速

在回收过程中一般不需特殊的实验设备，也不需要昂贵的试剂，并且操作时间较短，象现在常用的试剂盒回收在电泳完成后整个回收过程只需30min左右，并且样品的回收率可达50％。

各类常用回收方法

由于分离方法众多，且各种不同的方法可能同时依据多项原理，所以只能粗略地将各种方法分成五大类：

电泳法、收集孔法、机械破碎法、溶（熔）胶法与酶处理法：

1、电泳法

根据凝胶割否分透析袋法与流动电洗脱法（割胶），滤纸-透析膜法与DEAE膜法（不割胶）。

（1）透析袋法

该方法可回收大于5kb的片段，缺点是操作麻烦并易造成DNA酶的污染。

（2）流动电洗脱法

该方法回收片段大小为4～50kb，且回收效率高达94～100％，极端条件下可回收大至550kb的片段。

缺点是操作繁琐，而且为了取得较高的回收率，需特定的流动电洗脱槽。

（3）滤纸-透析膜法

回收率平均达70％左右，不需割胶，操作相对简单，但实验中需将滤纸上的DNA洗脱，也较繁琐，也不易控制。

（4）滤纸-透析膜法

此方法用于回收小片段，一般小于5kb的片段回收效率较高，可达70％以上；

对于大片段（>

15kb）则难以从DEAE膜上洗脱下。

2、收集孔法

（1）蔗糖法

回收小片段效率较高，564bp的PCR产物带回收效率高达97.6%，并且回收中能将较宽的条带浓缩于收集孔中，但回收中制作收集孔较麻烦，并且收集孔中要加入蔗糖，故获得的DNA样品不能直接用于后续实验。

（2）羟基磷灰石法

该方法回收效率也较高，不利之处与上述方法相同，获得的DNA需再纯化，操作也较繁琐。

3、机械破碎法

指用机械力将凝胶压碎后再行回收DNA片段，有冻挤法，冻融法、压碎浸泡法、（单层）滤膜过滤法及双层（亲和）膜过滤法。

（1）冻挤法

将胶条割下置于塞有玻璃棉的吸嘴或是管底刺有小孔的eppendorf管中，冰冻30min后全速离心5min，收集清液，再经酚抽提、乙醇沉淀等纯化浓缩处理（也可直接沉淀）。

其基本原理理是利用离心力将凝胶中原有的液体挤出，同时也带出胶中的DNA。

从胶浓度为1%琼脂糖中回收650bp、1.1kb、2.0kb、4.5kb的片段时，回收率分别为90％、74％、56％、30％。

这是因为大分子DNA更难于被胶中的缓冲液带出，所以此法只适用于回收较小的DNA片段。

（2）冻融法

割下的胶条放在eppendorf管中，将之捣碎并放于-80℃冰冻5min，取出后迅速放置于37℃保温10min，如此反复3次能使DNA从胶中游离出来，离心获得上清中即含有目的DNA，可通过沉淀浓缩获得高浓度。

对一般的DNA片段回收效率在60～80%。

操作简单，并不需特殊设备。

（3）压碎浸泡法

又称醋酸铵法，操作较费时，回收效率较低，一般改良的方法是在冻挤法操作中，加入一定的水并浸泡10min，增加DNA的回收率。

4、溶胶法

根据物理或化学溶胶可分为低融点法（物理熔胶）与NaI、KI、NaClO4溶胶法（化学溶胶）。

（1）低融点胶法

采用特殊的低融点凝胶，该胶在65℃即溶化，实验中是先灌制正常的凝胶，然后用低融点胶取代其中的部分（即可节约低融点凝胶用量，也能保证电泳中整块凝胶的完整性。

）电泳完成后割下的凝胶可于65℃下保温溶解，后直接用于酶切，连接，DNA标记的实验。

操作方便简单，但需特殊的低融点凝胶，成本较高，且回收得到的样品浓度较低。

（2）化学融胶法

琼脂糖能溶解于一些盐溶液中（NaI、KI、NaClO4），然后可用特殊的纯化柱将DNA样品溶液纯化，现在广泛使用的凝胶电泳中DNA片段回收试剂盒基本采用了此中回收原理，能在短时间内获得目的DNA片段，成本也较低。

5、酶处理法

对于大片段DNA的回收，象酵母人工染色体的克隆实验中，克隆片段可大到2000kb，一般采用此方法。

利用琼脂糖酶降解琼脂糖，能较温和的裂解琼脂糖，最终成功回收DNA片段。

（一）仪器

手术刀、Elutip-d柱、台式离心机、乙醇、紫外透射仪、水平电泳仪

（二）材料

待分离的DNA

（三）试剂

回收试剂盒

专用的限制性内切核酸酶及酶切缓冲液

低熔点琼脂糖凝胶（SeaPlaqu，FMCBioproducts）

溴化乙锭溶液（1000贮存液0.5mg/mL，工作液0.5μg/mL，避光保存）

TE缓冲液（10mmoL/LTris-HClpH8.0，lmmol/LEDTA）

Tris-HCl饱和酚

Elutip高盐溶液（1mol/LNaCl，20mmol/LTris-HClpH7.5，1mmol/LEDTA，过滤除菌，室温保存）

Elutip低盐溶液（0.2mol/LNaCl，20mmol/LTris-HClpH7.5，1mmol/LEDTA，过滤除菌，室温保存）

试剂盒法：

（Kit回收法，以上海申能博彩生物科技有限公司生产的试剂盒为例）

1、从电泳板上切割含目的DNA片段的凝胶块（割胶尽可能的小，提供后续回收效率。

2、凝胶称重后并将其放入1.5ml管中，将其适当切小，加速溶解。

每100mg凝胶加入400μlsolutionSN。

（若称重省略，一般加入400μlSN）

3、凝胶溶解：

55-60℃，保温5-10分钟，每2分钟混匀一下，使凝胶溶解，胶完全融化后每400μlsolutionSN中加入solutionB100μl，混匀。

4、将3S柱装入2ml洗管，将上述混合液转移至3S柱，室温放置2min。

室温10000rpm离心1分钟，稳定45秒。

5、取下3S柱，倒掉收集管中的废液，将3S柱放入同一收集管中，加入600μlWashSolution，室温10000rpm离心1分钟。

6、重复步骤5一次。

7、取下3S柱，倒掉收集管中废液，将3S柱放入同一收集管中，室温10000rpm离心2分钟。

8、将3S柱放入新的离心管中，在3S柱子膜中央加30μlddH2O，不加盖室温放置2分钟。

9、盖上离心管，室温10000rpm离心1分钟，离心管中的液体即为回收的DNA片段。

低熔点琼脂糖凝胶法：

1．以相应的限制性内切核酸酶完全消化DNA样品，纯化后与加样缓冲液混合，在1％低熔点琼脂糖凝胶中电泳（加入的DNA的量在低熔点琼脂糖凝胶中少于标准琼脂糖凝胶）。

　　2．经溴化乙锭染色并切下靶条带，于65℃熔解胶条，加入足够量的TE缓冲液，使琼脂糖含量降至0.4％以下。

（如果DNA样本将用于连接、转化或限制性核酸内切酶消化，可直接将β-琼脂糖/DNA熔化液用于反应。

3．加入等体积的Tris-HCl饱和酚，剧烈混合5～10min。

室温条件下离心10min。

4．吸取水相入新管，用等体积的TE缓冲液与有机相一起再次抽提，离心条件同步骤3。

5．吸取第二次抽提水相。

如果仍出现较大的界面沉淀物，可进行第三次抽提。

6．合并水相，乙醇沉淀。

经由Elutip-d柱进一步纯化DNA或溶于适当的缓冲液中直接使用。

六、DNA回收中的注意事项

除了选择合适的方法外，实验中还要注意以下几点：

1、防止抽提过程中污染DNA酶

与回收片段接触的试剂与器皿等都应进行灭菌（酶）处理，即使是不能用干热或湿热法灭菌的器皿也要用乙醇浸泡以灭杀活菌与DNA酶，不然可能发生回收片段部分降解的现象，有时甚至一无所获。

即使是轻微的降解反应——当发生在粘性末端时也会导致严重的连接困难。

2、紫外照射选择长波段

回收过程往往需在紫外等监测下进行，与一般观察电泳结果不同的是这时应用长波紫外灯。

因为短波紫外线（254nm）会引起DNA的断裂或是形成TT二聚体，前者会使以后的连接与转化等实验失败，后者可能造成基因突变，给克隆工作带来麻烦。

即使是使用了长波紫外照射，回收DNA时也要尽量短时照射，避免连续长时间照射。

3、实验操作要轻柔

特别在处理较大片段时应防止机械剪切作用DNA对的破坏，如吸取液体、转动离心管等操作均应缓慢、轻柔。

综上所述，只有在合适的回收方法基础上注意具体操作步骤是才能有效回收所需片段，为以后的酶切、连接、标记等工作打下良好基础。

实验四PCR扩增DNA的基本反应

1、熟悉PCR反应的基本原理

2、掌握方法PCR反应的操作方法

1．以DNA为模板的反应，根据多年来的实践经验，已经有了一个标准的PCR反应条件。

反应体系一般选用50μL或100μL体积，其中含有：

50mmol/LKCl

10mmol/LTris-HCl（pH8.3，室温）

1.5mmol/LMgCl2

100μg/mL明胶或牛血清白蛋白（BSA）

2个引物，各0.25～1.0μmol/L

4种底物（dATP、dCTP、dGTP、dTTP），各200μmol/L

模板DNA0.1μg

TaqDNA聚合酶2.5U

其中模板DNA的用量必须根据相对分子质量的大小加以调整，一般需要含102～106拷贝的DNA，封上矿物油防止高温反应时液体的挥发，即可进行PCR反应。

反应条件一般为94℃变性30s～60s，55℃退火30～60s，70～72℃延伸30～60s，共进行30次左右的循环。

末轮循环在72℃延伸7min。

末轮循环后不再变性，将反应物置-20℃保存。

2．以mRNA为模板的反应

以mRNA为模板进行PCR反应以扩增DNA时，首先通过逆转录反应，以mRNA为模板合成cDNA。

逆转录反应中一般包括下列成分：

mRNA、Oligo（dT）12—18（DNA合成引物）、Tris-HCl（pH7.6）、KCl、MgC12、4种dNTP混合液、DTT、RNA酶抑制剂。

在加入上述试剂和材料后，加水将体积调整到48μL。

然后加2μLMoloney鼠白血病病毒（MMLV）逆转录酶（pharmacia，200000U/mL；

对于其他厂商产品，使用与此相当的单位数）。

将混合物在37OC反应1h。

即可获得cDNA，作为PCR扩增的模板。

随后进行以DNA为模板的PCR反应。

用于PCR扩增反应的上游寡核苷酸引物（亦称3′引物或向前合成引物）10～50pmol可代替Oligo（dT）作引物。

上游引物与初始mRNA互补，下游引物（亦称5′引物或向后合成引物）与cDNA第一链互补。

3．PCR产物的积累规律

在PCR的反应过程中，DNA扩增过程遵循酶的催化动力学原理。

在反应初期，目的DNA片段增加呈指数形式。

随着目的DNA产物的逐渐积累，在引物-模板与DNA聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和，此时扩增DNA片段的增加减慢进入相对稳定状态，即出现“停滞效应”，这种效应称“平台期”。

到达平台期所需PCR循环次数取决于样品中模板的拷贝数、PCR扩增效率及DNA聚合酶的种类和活性，以及非特异性产物的竞争等因素。

一般在到达“停滞”阶段之前，用Klenow酶只能进行20次左右的循环，而用TaqDNA聚合酶则可进行25次以上PCR循环。

这是因为TaqDNA聚合酶的高特异性，减少来自非特异性延伸产物对聚合酶的竞争，从而使在“停滞”期到达之前有更多的目的基因片段积累。

大多数情况下，平台期在PCR反应中是不可避免的。

但一般在此之前，合成的目的基因片段的数量足可以满足实验的需要。

如果产物不够，可继续扩增，将产物DNA样品稀释1000--10000倍后，作为模板进行新的PCR。

PCR实验中应注意的事项：

1．防止污染

PCR技术的敏感性极高，如实验中出现交叉污染，很容易出现假阳性结果。

采取如下措施有利于防止污染：

（1）小量分装所有试剂。

（2）尽可能使用一次性吸头及试管。

（3）分开操作区域。

在专用超净工作台进行样品制备，专设工作台进行PCR操作，反应后的产物在另一工作台进行结果分析。

（4）样品制备应按无菌操作的原则进行，避免样品间的互相污染。

（5）设置专用微量可调加样器用于PCR，这套加样器绝不能用于PCR的反应产物分析。

2．实验中的对照

每一次试验都需要设置严格的对照。

阳性对照：

阳性模板。

阴性对照：

阴性模板。

试剂对照：

除模板外的所有组分。

3．扩增反应总是阴性结果（无产物）时应采取的措施

（1）取10/μL扩增混合液作模板再进行PCR扩增，

（2）增加TaqDNA聚合酶的浓度。

（3）增加靶DNA量。

（4）若模板为粗制品，提纯样品。

（5）增加扩增循环次数。

（6）适当降低退火温度。

4．出现非特异性产物时应采取的措施

（1）提高退火温度。

（2）降低TaqDNA聚合酶的浓度。

（3）缩短退火及延伸时间。

（4）降低引物浓度。

（5）减少扩增循环次数。

三、实验材料与主要试剂

（一）材料试剂

不同来源的模板、引物、Taq酶、缓冲液、MgCL2、dNTP、ddH2O、Mark

1、取一个0.5mL的离心管，加入以下成分（总体积100μL）：

ddH2O66μL

模板DNA5μL

上游引物（10μmol/L）5μL

下游引物（10μmol/L）5μL

10x缓冲液10μL

MgCL26μL

dNTP3μL