食品微生物检测方法Word格式.docx
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⑻灭菌吸管:
1ml（具0.01ml刻度）、10ml（具0.1ml刻度）
⑼灭菌锥形瓶:
500ml
⑽灭菌玻璃珠:
直径约5mm
⑾灭菌培养皿直径约90mm
⑿灭菌试管16mm×
160mm
⒀灭菌刀、剪子、镊子等。
1.3检验程序（菌落总数的检验程序见图1）
1.4操作步骤
⑴检样稀释及培养
a.以无菌操作将检样25克（ml）剪碎放于含有225ml灭菌生理盐水或其他稀释液灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：
10的均匀稀释液。
固体检样在加入稀释液后，最好置均质器中以8000r/min～10000r/min的速度处理1min,做成1：
b.用1ml的灭菌吸管吸取1：
10的稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内（注意吸管不要触及管内稀释液），振摇试管，混合均匀，做成1：
100的稀释液。
c.另取1ml灭菌吸管，按上条操作方法，做10倍递增稀释，如此每递增稀释一次，即换用1支1ml吸管。
d.根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，，选择2～3个适宜稀释度，分别在做10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1ml稀释液于灭菌培养皿内，每个稀释度做两个培养皿。
e.吸稀释液移入培养皿后，应及时将凉至46℃营养琼脂培养基（可放置46±
1℃水浴锅保温）注入培养皿约15ml并转动培养皿使混合均匀。
同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液灭菌培养皿内作空白对照。
f.待琼脂凝固后，翻转平板，置36±
1℃温箱内培养48h±
2h.
⑵菌落计数方法
做平板菌落计数时，可用肉眼观查，必要时用放大镜检查，以防遗漏。
在记下各平板的菌数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。
⑶菌落计数的报告
a.平板菌落数的选择
选取菌落数在30-300之间的平板作为菌落总数测定标准。
一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。
平板内如有链状菌落生长时（菌落间无明显界线），若仅有一条链。
可视为一个菌落；
如果有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落计。
b.稀释度的选择
1.应选择平均菌落数在30-300之间的稀释度，乖以稀释倍数报告之（见表1中例1）。
2.若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30-300之间，则视两者之比如何来决定。
若其比值小于或等于2，应报告其平均数，若大于2，则报告其中较小的数字，（见表1中例2及例3）。
3.若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以箕释倍数报告之（见表1中例4）。
4.若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释找最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1中例5）。
5.若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之（见表1中例6）。
6.若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1中例7）。
c.菌落数的报告
菌落数在100以内时，按其实有数报告，大于100时，采用两位有效数字，在两位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算。
为了缩短数字后在的零数，也可用10的指数来表示（见表1）。
表1稀释度选择及菌落数报告方式
例次
稀释液及菌落数
两稀释液之比
菌落总数
（cfu/g）
报告方式（cfu/g（ml））
10-1
10-2
10-3
1
多不可计
164
20
－
16400
16000
2
295
46
１.6
37750
38000
3
271
60
2.2
27100
27000
4
313
313000
310000
5
27
11
270
6
<
1×
10
7
305
12
30500
31000
2大肠菌群的检测
2.1大肠菌群的测定
2.1.1 设备和材料
⑴ 恒温培养箱：
36±
1℃。
⑵ 冰箱：
0～4℃。
⑶ 恒温水浴锅：
44.5±
0.5℃。
⑷ 架盘药物天平:
0～500g,精确至0.5g。
⑸ 显微镜10×
～100×
。
⑹ 均质器或乳钵。
⑺ 平皿：
直径为90mm。
⑻ 试管16mm×
160mm。
⑼ 吸管1ml（具0.01ml刻度）、10ml（具0.1ml刻度）。
⑽ 广口瓶或三角烧瓶：
容量为500mL。
⑾ 玻璃珠：
直径约5mm。
⑿ 载玻片。
⒀ 酒精灯。
⒁ 试管架。
⒂灭菌刀、剪子、镊子
2.1.2培养基和试剂
⑴乳糖胆盐发酵管：
蛋白胨：
20g
猪胆盐（或牛、羊胆盐）：
5g
乳糖：
10g
0.04%溴甲酚紫水溶液：
25ml
蒸馏水：
1000ml
PH：
7.4
将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于水，校正PH，加入指示剂，分装每管10ml，并放入一个小倒管，115℃高压灭菌15min.
注：
双料乳糖胆盐发酵管除蒸馏水外，其他成分加倍。
⑵伊红美蓝琼脂平板
磷酸氢二钾：
2g
琼脂：
17g
2%伊红Y溶液：
20ml
0.65%美蓝溶液：
10ml
1000ml
7.1
将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，校正ph，分装于烧瓶内，121℃高压灭菌15min备用。
临用时加入乳糖并加热溶化琼脂，冷却至50～55℃,加入伊红和闰蓝溶液，摇匀，倾注平板。
⑶乳糖发酵管
10g
1000ml]
Ph：
将蛋白胨及乳糖溶于水中，校正ph，加入指示剂，按检验要求分装30ml、10ml、或3ml,并放入一个小倒管，115℃高压灭菌15min。
注1：
双料乳糖发酵管除蒸馏水外，其他成分加倍。
注2：
30ml和10ml乳糖发酵管专供酱油及酱类检验用,3ml乳糖发酵管供大肠菌群证实试验用。
⑷EC肉汤
胰蛋白胨：
3号胆盐（或混合胆盐）：
1.5g
4g
磷酸二氢钾：
氯化钠：
蒸馏水：
将上述成分混合，溶解后，分装有发酵倒管的试管中，121℃高压灭菌15min，最终ph为6.9±
0.2.
⑸磷酸盐缓冲液
磷酸二氢钾：
34g
1mol/l氢氧化钠溶液：
175ml
蒸馏水：
825ml
PH：
7.2
先将磷酸溶解于500ml蒸馏水中，用1mol/l氢氧化钠溶液校正PH后，再用蒸馏水稀释至1000ml.稀释液取储存液1.25ml，用蒸馏水稀释至1000ml,分装每瓶100ml或每管10ml，121℃；
高压灭菌15min。
0.85%灭菌生理盐水
⑹革兰氏染色液
结晶紫：
1g
95%乙醇：
20ml
1%草酸铵水溶液：
80ml
将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液法混合
革兰氏碘液
碘：
1g
碘化钾：
300ml
将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300ml
沙黄复染液
沙黄：
0.25g
95%乙醇;
10ml
90ml
将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。
染色法：
a将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水先。
b滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。
c滴加95%乙醇脱色，约30S；
或将乙醇滴满整个涂片，立即倾无能为力，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10s.
d水洗，滴加复染液，复染1min。
水洗，待干，镜检。
结果：
革兰氏阳性菌呈紫色。
革兰氏阴性菌呈红色。
注：
亦可用1：
10稀释石炭酸复红染色液作复染液，复染时间公需10s.
2.1.3操作步骤
2.1.3.1检样稀释
a 以无菌操作将检样25mL（或g）放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内予置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1∶10的均匀稀释液。
固体检样最好用均质器，以8000～10000r/min的速度处理1min，做成1∶10的均匀稀释液。
b 用1mL灭菌吸管吸取1∶10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀，做成1∶100的稀释液。
c 另取1mL灭菌吸管，按上条操作依次做10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌吸管。
d 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种3管。
2.1.3.2 乳糖发酵试验
将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，1mL及1mL以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。
每一稀释度接种3管，置36±
1℃温箱内，培养24±
2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。
2.1.3.3分离培养
将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36±
1℃温箱内，培养18～24h，然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。
2.1.3.4 证实试验
在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1～2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36±
1℃温箱内培养24±
2h，观察产气情况。
凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。
2.1.3.5 报告
根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL（g）大肠菌群的MPN值。
见附录A。
2.1.4粪大肠菌群（faecalcoliform）
2.1.4.1 用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物（见7.2条）转种于EC肉汤管内，置44.5±
0.2℃水浴箱内（水浴箱内的水面应高于EC肉汤液面），培养24±
2h，经培养后，如所有EC肉汤管均不产气，则可报告为阴性；
如有产气者，则将所有产气的EC肉汤管分别转种于伊红美蓝琼脂平板上，置36±
1℃培养18～24h，凡平板上有典型菌落者，则证实为粪大肠菌群阳性。
2.1.4.2 结果报告
根据证实为粪大肠菌群的阳性管数，查MPN检索表，报告每100mL（g）粪大肠菌群的MPN值。
2.3霉菌和酵母菌
2.3.1培养基和试剂
⑴灭菌蒸馏水
⑵虎红（孟加拉红）培养基
成分：
蛋白胨5g
葡萄糖10g
磷酸二氢钾1g
硫酸镁（含7H2O）0.5g
琼脂20g
1/3000虎红溶液100mL
（四氯四碘荧光素）
蒸馏水1000mL
氯霉素100mg
制法：
将上述前5种成分加入蒸馏水中溶解后，再加入虎红溶液。
分装后，103.43kPa，20min高压灭菌。
另用少量乙醇溶解氯霉素，过滤除菌后，加入培养基中，若无氯霉素，可用链霉素代替，每1000mL培养基加链霉素30mg。
马铃薯-葡萄糖琼脂培养基，附加抗菌素
⑶ 马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）
成分：
马铃薯（去皮切块） 300g
葡萄糖 20g
琼脂 20g
蒸馏水 1000mL
制法:
将马铃薯去皮切块，加1000mL蒸馏水，煮沸10～20min。
用纱布过滤，补加蒸馏水至1000mL。
加入葡萄糖和琼脂，加热溶化，分装，121℃高压灭菌20min。
2.3.2仪器
⑵恒温培养箱25℃-28℃
⑶恒温振荡器
⑷显微镜:
10×
⑼灭菌具塞锥形瓶:
⑽灭菌广口瓶:
500ML
⒀灭菌刀、金属勺等。
⒁载玻片、盖玻片、
⒂灭菌牛皮纸袋、塑料袋
2.3.3操作步骤
⑴以无菌操作取检样25克（ML），放放含有225ML灭菌水的具玻塞锥形瓶中，振摇30分钟，即为1：
10稀释液。
⑵用灭菌吸管吸取1：
10稀释液10ML，注入灭菌试管中，另1ML灭菌吸管反复吸取款50次，使霉菌孢子充争散开。
⑶用1ml的灭菌吸管吸取1：
10的稀释液注入含有9ml灭菌水的试管内，另取一支取1ML灭菌吸管吹吸五次，此液为1：
⑷按上述操作顺序做工10倍递增稀释液，每稀释一次，换用一支1ML灭菌吸管，根据对样品污染情况的估计，选择三个合适的稀释度，分别在做10倍稀释的同时，吸取1ML稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做二个平皿，然后将晾置45度左右的培养基注入平皿中，并转动使之与样液混匀，待琼脂凝固后，倒置于25～28度的温箱中，三天后开始观察，共培养观察五天。
⑸计算方法：
通常选择菌落数在10～150之间的平皿进行计数，同稀释度的两个平皿的菌落数平均数乘以稀释倍数，即为每克（或毫升）检样中所含霉菌和酵母菌。
稀释度选择及菌落报告方式可参考GB/T4789。
⑹报告：
每克（或亳升）食品所含霉菌和酵母菌数以cfu/g（ml）计。
2.4沙门氏菌检测方法
2.4.1前增菌和增菌
以无菌操作取25g（ml）样品，加在装有225ml缓冲蛋白胨水的500ml广口瓶内。
固体产品先用乳钵加灭菌砂磨碎，于36℃±
1℃培养4h，移植10ml转种于100ml氯化镁孔雀绿增菌液内，于42℃培养18h-24h。
同时，另取10ml转种于100ml亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于36℃±
1℃培养18h-24h。
2.4.2分离
取增菌液1环，划线接种于一个亚硫酸铋琼脂平板和一个DHL琼脂平板（或HE琼脂平板、WS或SS琼脂平板），两种增菌液可同时划线接种在同一个平板上。
于36℃±
1℃分别培养18h-24h，观察各个平板上生长的菌落，如发现疑似沙门杆菌的送权威质检部门测定。
2.5志贺氏菌检测方法
2.5.1增菌
以无菌操作取25g（ml）样品，加在装有225mlGN增菌液的广口瓶内。
1℃培养6h-8h。
培养时间视细菌生长情况而定，当培养液出现轻微混浊时即应中止培养。
2.5.2分离
取增菌液1环，划线接种于HE琼脂平板或SS琼脂平板一个；
另取1环划线接种于麦康凯琼脂平板和伊红美蓝琼脂平板一个，于36℃±
1℃分别培养18h-24h，志贺氏菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。
观察各个平板上生长的菌落，如发现疑似志贺氏菌的送权威质检部门测定。
2.6金黄色葡萄球菌检验
2.6.1增菌及分离培养
检样处理：
以无菌操作取25g（ml）样品，加在装有225ml灭菌生理盐水。
固体产品碾磨或置均质器中制成混悬液。
吸取5ml上述混悬液，接种于7.5%氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤50ml培养基内，于36℃±
1℃培养24h。
转种血平板和Baird-Parker平板，36℃±
1℃培养24h，挑取血平板上金黄色（有时为白色）菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶实验。
金黄色葡萄球菌形态：
本菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽孢，无荚膜，致病性葡萄球菌菌体较小，直径约为0.5um-1um。
如发现疑似金黄色葡萄球菌的送权威质检部门测定。
2.7溶血性链球菌检验
2.7.1增菌及分离培养
检样处理：
吸取5ml上述混悬液，接种于50ml葡萄糖肉浸液肉汤，或直接划线接种于血平板上。
挑起乙型溶血圆形突起的细小菌落，在血平板上分纯，然后观察溶血情况及革兰氏染色，如发现疑似溶血性链球菌的送权威质检部门测定。
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