免疫组化超详细步骤文档格式.docx

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经病理医生确认的肺癌组织切片、KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体、DAB显色试剂盒、抗原修复液、PBS、苏木素染料、1%盐酸酒精溶液、0.05%氨水、二甲苯、等

四实验设备：

切片机、4℃冰箱、显微镜、烤片机

五主要试剂配置:

缓冲液

应用液ANaH2PO438.4g配成1000毫升溶液

应用液BNa2HPO4·

12H2O114.8g配成1000毫升溶液

配制1000毫升PBS需要14毫升应用A液，36毫升应用B液，加8.5gNaCl。

枸橼酸钠抗原修复液

应用液A枸橼酸10.55g配成1000毫升溶液

应用液B柠檬酸三钠（三水合柠檬酸三钠）29.01g配成1000毫升溶液

配制500毫升抗原修复液需要9毫升应用A液，41毫升应用B液。

苏木素染液配方：

苏木素2g,无水乙醇250毫升，硫酸铝17.6g蒸馏水750毫升，碘酸钠0.2g，冰醋酸20毫升。

先将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝溶于蒸馏水水中。

两液溶解后将其混合，加入碘酸钠，最后加入冰醋酸。

抗体说明书建议的抗体稀释度

N-Ras1:

50-1:

500

H-Ras1:

K-Ras1:

20-1:

200

六实验步骤：

1组织常规石蜡切片厚度3-5um，防脱片捞片后晾干，放入72℃烤箱烤片2小时。

2切片脱蜡水化程序

⑴二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各12分钟；

⑵无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各3分钟；

（洗二甲苯）

⑶95%乙醇3分钟；

⑷85%乙醇3分钟；

3自来水漂洗3分钟，洗涤一定要充分。

4组织修复采用高温高压法：

压力锅中加入pH6.0，0.01M抗原修复液约1000ml，切片插入塑料架上，放入压力锅，盖上锅盖（此时不扣上压力阀）1600W预热至沸腾，扣上压力阀1300W，待高压锅阀门喷气开始计时，修复时间为2分钟。

5停止加热并用流水冲洗高压锅以降温，室温冷却。

6将抗原修复后切片置自来水中，浸泡2分钟。

将样本置于内源性过氧化物酶阻断剂3%H2O2，室温放置4分钟。

（需要盖盖子）自来水洗2分钟，PBS缓冲液洗涤2分钟。

7取出切片，擦干组织周围液体后滴加10%BSA封闭液，37℃孵育40分钟。

滴加一抗（浓度配比,PBS稀释1:

20、1:

50、1:

100、1:

200）60ul，注意保持组织湿润状态但表面不能有液体，用试管使抗体全部覆盖组织面且不能有气泡，以使抗体能全部与组织接触。

8滴加一抗后放入专用孵育盒内，4℃冰箱过夜。

9切片放入PBS缓冲液中清洗3分钟×

3次，充分洗涤，防止因洗涤不净引起的非特异性染色。

（前两次的PBS倒掉）

10擦干组织周围液体后滴加70微升辣根酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物（根据实际情况要求覆盖样本），37℃温箱内孵育40分钟。

PBS缓冲液洗涤3分钟×

3次.

11显色，滴加现配适量DAB显色剂（在1ml试剂2（DAB底物液）中，加入1滴（约50ul）试剂1（DAB浓缩液），混合液，即配成DAB工作液），配置DAB显色剂的容器在冰冻切片机旁边的冰箱里，其它试剂在入门口冰箱。

室温显色,5-20分钟。

自来水终止显色。

第一遍的自来水需集中处理，自来水洗涤3分钟。

12复染，苏木素染液中染色40秒，水洗1分钟。

131%盐酸酒精溶液分化3秒，流水漂洗。

14蓝化10秒，流水漂洗。

15脱水，切片依次置于85%乙醇，95%乙醇各1分钟，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ中各2分钟。

16透明，切片依次置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各2分钟

17中性树胶封片。