沉降菌测试方法Word文档下载推荐.docx

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水平层流

风速m/s≥0.4——————JC

垂直层流1次/月

≥0.3

换气次数——≥20≥15≥121次/月

静压差Pa不同级别洁净室及洁净室与非洁净室之间≥5

洁净室与室外大气≥101次/月

沉降菌数≤1≤3≤10≤15GB/T16294-19961次/周

附录C（资料性附录）洁净室（区）沉降菌技术要求 

洁净室（区）沉降菌技术要求 

洁净度

级别

澳大利亚TGA

CGMP

（2002年8月16日）

欧盟EU 

附录l 

（2008年2月）

美国FDA

CGMP 

（2004年9月）

药品生产质量管理规范

（1998修订）

φ90mm 

CFU/4ha

沉降菌/皿，0.5h

100

A级

＜1

≤1

-

B级

≤5

≤3（1000级）

10000

C级

≤50

≤3

100000

D级

≤100

≤10

为培养皿暴露时间不超过4h，以平均菌落数表示。

无菌检查法试验步骤

无菌检查在洁净度100级单向流空气区域内进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染。

1、器具灭菌：

培养皿若干个（报纸所好）、试管、剪刀、镊子等装入盒中置电热干燥箱内180℃，2小时。

2、硫乙醇酸盐流体培养基（细菌），根据试验实际用量取若干培养基和蒸馏水，煮沸，摇匀，分装至适宜的容器中，瓶塞封口，灭菌。

硫乙醇酸盐流体培养基置33℃培养48小时，应无菌生长。

改良马丁培养基（真菌），根据试验实际用量取若干培养基和蒸馏水，煮沸，摇匀，分装，灭菌。

改良马丁培养基置24℃培养72小时，应无菌生长。

营养琼脂根据实际用量按一皿装15ml，分装几个皿来计算，灭菌。

0.9%氯化钠分装至7支试管，封口，灭菌。

3、把金黄色葡萄球菌用接种环刮一下，放入0.9%氯化钠试管中摇匀，作10倍系列稀释至10-7，然后从10-5、10-6、10-7试管各抽取1ml，分别放入标号5#、6#、7#培养皿里，倒入营养琼脂摇匀，（营养琼脂不能太烫，以不烫手为准）待营养琼脂冷却后倒置放入33℃培养箱中培养48小时，48小时中取出观察计数，根据菌落数小于100cfu来决定用几号。

4、操作时，应用适当的消毒液对供试品表面或外包装擦拭消毒后，以无菌方法取内容物。

取供试品3只接种于足以浸没供试品的适量培养基中。

一只瓣膜接种于硫乙醇酸盐流体培养基中，轻轻摇动，使瓣膜与培养基混合，1支试管接种金黄色葡萄球菌对照用菌液1ml,作阳性对照，1支作空白对照。

另取2只瓣膜接种于改良马丁培养基中，2支试管作空白对照。

硫乙醇酸盐流体培养基置33℃培养，改良马丁置24℃培养阳性对照管培养48小时后应有菌生长。

5、结果判断：

在培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。

培养14天后，若供试品管匀澄清，判供试品符合规定；

若供试品管中任何一管显浑浊并有菌生长，判供试品不符合规定。

细菌内毒素试验步骤：

1、准备工作：

移液管：

0.1ml1支，1ml10支

试管：

10ml×

4支，试管架2个（大小）

烧杯40ml2个，锥形瓶2个

试验所用器皿需经处理除去可能存在的外源性内毒素，玻璃器皿置电热干燥箱内180℃干烤至少2小时。

细菌内毒素检查水10ml×

4支

细菌内毒素工作标准品1支，每安瓿含内毒素10EU

鲎试剂0.1ml×

8支

同一批号3支瓣膜

浸提介质：

细菌内毒素检查水

浸提介质体积计算公式：

V=

=8.6（ml）

8.6×

3=25.8（ml）

把细菌内毒素检查水4支外表擦净打开，倒入烧杯中，用移液管取25.8ml倒入装3只瓣膜烧杯中，用锡纸封口，放进提前打开升温至37℃恒温培养箱中，培养1.5小时。

供试液贮存应不超过2小时。

注：

V-浸提介质体积，单位为毫升（ml）

L-产品细菌内毒素限值，单位为细菌内毒素单位每毫升（EV/ml）

λ-所用鲎试剂灵敏度标示值，单位为细菌内毒素单位每毫升（EV/ml）

2、细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查水1ml溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟。

用移液管取0.1ml工作标准品和0.9ml检查水在旋涡混匀器上混匀30秒钟。

用移液管从第1管中取0.5ml混合液和0.5ml检查水在旋涡混匀器上混匀30秒钟。

（阳性对照溶液）

用移液管取0.1ml工作标准品和0.9ml供试液在旋涡混匀器上混匀30秒钟。

用移液管从第3管中取0.5ml混合液和0.5ml供试液在旋涡混匀器上混匀30秒钟。

（供试品阳性对照溶液）

3、把8支鲎试剂外表擦净全部打开放进试管架中，每支各加入0.1ml细菌内毒素检查水，在旋涡器上混匀，其中2支作供试品管，2支作阴性对照管，2支作阳性对照管，2支作供试品阳性对照管。

每支供试品管加入0.1ml供试液；

阴性对照管加入0.1ml检查用水；

阴性对照管加入0.1ml阳性对照溶液；

供试品阳性对照管加入0.1ml供试品阳性对照溶液。

封闭管口，轻轻摇匀，垂直放入37±

1℃恒温器中孵育60±

2分钟，然后取出观察结果，试管在孵育期间应避免任何振动。

4、结果判断：

将试管从水浴箱中轻轻取出，缓缓倒转180若管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性（＋），未形成凝胶或形成凝胶不坚实，变形并从管壁滑脱者为阴性（－）。

阴性对照管均为阴性，阳性对照管，供试品阳性对照管均为阳性，试验有效，否则无效。

若阴性对照管为阳性，表明鲎试剂或检查水或实验器具受污染；

若阳性对照管为阴性，表明鲎试剂或标准内毒素已失效，或鲎试剂灵敏度及标准内毒素效价标示不准确或标准内毒素稀释有误。

供试品阳性对照管为阴性，表明反应体系内有抑制反应干扰因素存在。

一、氯化物

1、配制标准溶液：

0.1mol/L硝酸银溶液。

称取1.6987g分析纯硝酸银，定溶至100ml容量瓶中，转入棕色试剂瓶中，避光保存，贴标签。

2、取样，量取50ml样品水平行样（2份）倒入试管中，加5滴硝酸，再加入1ml硝酸银。

均不得发生浑浊。

二、硫酸盐

称取5±

0.5g氯化钡（分析纯），定溶至100ml容量瓶，倒入试剂瓶，贴标签。

（如果浑浊，把蒸馏水烧开，放凉再用）

2、分析：

取样50ml平行样（2份）倒入试管中，加2ml氯化钡溶液，不得发生浑浊。

三、钙盐

称取分析纯草酸铵3.5g，定溶至100ml容量瓶，贴标签。

取样50ml平等样2份，倒入试管中，加2ml草酸铵溶液，均不得发生浑浊。

四、二氧化碳

称取分析纯氢氧化钙0.3g，定溶至100ml容量瓶，用橡皮塞塞紧，用力振摇，放置1小时，用时取清液。

取样25ml平等样（2份）倒入带盖的试管中，加25ml氢氧化钙溶液，放置1小时，振摇，1小时内不得发生浑浊。

五、易氧化物

高锰酸钾溶液：

取3.3克高锰酸钾，加水1050ml，煮沸15分钟，加水到1000ml，密塞后静置2天以上，用微孔玻璃漏斗过滤，摇匀，标定其浓度。

稀硫酸：

取分析纯硫酸（98%）57ml，（注意烧杯里放蒸馏水，沿杯壁缓慢倒入硫酸57ml，定溶至1000ml，放凉再用）

2、标定：

取在105℃干燥至恒重的基准草酸钠约0.2克，精密称定，加新沸过冷水250ml与硫酸10ml搅拌使溶解，自滴定管中迅速加入本液约25ml，待褪色后，加热到65℃，继续滴定至溶液显微红色并保持30秒钟不褪；

当滴定终了时，溶液温度应不低于55℃，每1ml高锰酸钾滴定液（0.02mol/L）相当于6.70mg草酸钠，根据本液消耗量与草酸钠取用量，算出本液浓度，即得。

贮藏：

置玻璃塞棕色玻璃瓶中，密闭保存。

3、分析：

取样100ml平行样（2份）加稀硫酸10ml，煮沸后，加高锰酸钾滴定液（0.02M）0.10ml，再煮沸10分钟，粉红色不得完全消失。

六、氨

1、配制标准溶液

纳氏试剂：

称取60g氢氧化钾，溶于约250ml无氨水，冷却至室温。

另外称取20g碘化钾溶于100ml无氨水，边搅拌边逐步加入二氯化汞结晶粉末（约10克），至出现朱红色沉淀不易溶解时，改为滴加饱和二氯化汞溶液，保持搅拌，到出现少量朱红色沉淀不易溶解时，停止滴加饱和二氯化汞溶液，然后把该溶液缓慢注入上述已冷却的氢氧化钾溶液中，边注入边搅拌，并用无氨水稀释至400ml，然后静置过夜。

最后将该溶液上清液至聚乙烯塑料瓶中，常温避光保存。

氯化铵溶液：

称取分析纯氯化铵0.0315g，定溶至1000ml（0.0032g100ml）容量瓶中，转入试剂瓶中保存，贴标签。

取样50ml，加纳氏试剂2ml，放置15分钟。

如果显色，加氯化铵溶液1.5ml，加无氨水48ml，加纳氏试剂2ml，对照颜色不得更深。

（氨含量0.00003%）

七、重金属

醋酸盐缓冲溶液：

（PH=3.5）称取分析纯醋酸铵25g，加蒸馏水25ml溶解后，加盐酸液[7mol/L（称取0.0255g至100ml定溶至100ml）]38ml，再用盐酸液[2mol/L（称取0.0073g至100ml定溶）]准确调节PN值3.5（电位计指示）用水稀释至100ml，倒入试剂瓶待用。

硫代乙酰胺溶液：

称取硫代乙酰胺4g，加水溶解成100ml，置冰箱中保存。

临用前取混合液[由1mol/L氢氧化钠（氢氧化钠4克＋100ml蒸馏水）15ml，水5.0ml及甘油20ml组成]5.0ml加上述硫代乙酰胺溶液1.0ml置水浴上加热20秒钟，冷却，立即使用。

铅标准贮备液：

称取110℃干燥恒重的硝酸铅0.1598g，置1000ml容量瓶中加硝酸5ml与水50ml溶解后用水稀释至刻度，摇匀，作标准贮备液，铅的浓度为100ug/ml。

临用前，精确量取铅标准贮备液稀释至所需浓度。

取样40ml，加醋酸盐缓冲液2ml，加硫代乙酰胺试液2ml，摇匀，放置2分钟。

取38ml样品水加2ml铅标液加醋酸盐缓冲液2ml加硫代乙酰胺2ml，对比颜色；

40ml样品水的颜色不得比铅标液的对照管深。

（铅的含量0.00005%）

八、不挥发物：

1、取干净蒸发皿200ml2个，分别标号放入105℃干燥箱中。

第一次：

烘烤3小时后，放进干燥皿中冷却40分钟，天平称重，记录。

第二次：

第一次和第二次重量差0.3毫克以内，如超过再恒重一次。

2、用移液管量取100ml样品水，放入恒重的蒸发皿中，水分在水浴锅上蒸干，同时做蒸馏水平行样。

3、第一次：

把蒸发皿放进干燥箱中烘烤3小时，放进干燥皿中冷却40分钟，天平称重，记录。

把蒸发皿放进干燥箱2小时，放进干燥皿中冷却40分钟，天平称重，记录。

4、残渣计算公式：

W=[（W12－W11）－（W02－W01）]×

1000

W-蒸发残渣质量mg

W11-未加入检验液蒸发皿质量g

W12-加入检验液蒸发皿质量g

W01-未加入空白液的蒸发皿质量g

W02-加入空白液的蒸发皿质量g

九、酸碱度

1、配制标准试剂:

0.05mol/L氢氧化钠溶液：

0.05mol/L40=2g=0.2g/100ml

称取0.2g氢氧化钠定溶至100ml。

甲基红指示液：

取甲基红0.1g，加7.4ml氢氧化钠，在超声波完全溶解，再加水稀释至200ml装入试剂瓶。

变色范围：

PH4.2-6.3（红-黄）试错4-6

溴百里香蓝：

称取溴百里香酚蓝0.1g，加3.2ml氢氧化钠使溶解，再加水稀释至200ml装入试剂瓶。

PH6.0-7.6（黄-蓝）

取样10ml，加甲基红指示液2滴，不得显红色，取样10ml，加溴百里香酚蓝指示液5滴，不得显蓝色。

PH测定法：

除另有规定外，水溶液的PH值应以玻璃电极为指示电极，饱和甘汞电极为参比电极的酸度计进行测定。

酸度计应定期进行计量检定，并符合国家有关规定。

测定前，应采用下列标准缓冲液校正仪器，也可用国家标准物质管理部门发放标示PH值准确至0.01PH各种标准缓冲液校正仪器。

1、仪器校正用的标准缓冲液

邻苯二甲酸盐标准缓冲液：

精密称取在115℃±

5℃干燥2-3小时邻苯二甲酸氢钾10.21g，加水使溶解并稀释至1000ml（25℃PH=4.00）。

磷酸盐标准缓冲液：

5℃干燥2-3小时的无水磷酸氢二钠3.55g与磷酸二氢钾3.40g，加水使溶解并稀释至1000ml（25℃PH=6.86）。

硼砂标准缓冲液：

精密称取硼砂3.81g（注意，避免风化）加水使溶解并稀释至1000ml置聚乙烯塑料瓶中，密塞，避免空气中二氧化碳进入（25℃PH=9.18）。

2、注意事项：

测定前，按各品种项下的规定，选择二种PH值约相差3个PH单位标准缓冲液，并使供试液的PH值处于二者之间。

取与供试液PH值较接近的第一种标准缓冲液对仪器进行校正（定位）使仪器示值与表列数值一致。

仪器定位后，再用第二种标准缓冲液核对仪器示值，误差应不大于±

0.02PH单位。

若大于此偏差，则应小心调节斜率，使示值与第二种标准缓冲液的表列数值相符。

重复上述定位与斜率调节操作，至仪器示值与标准缓冲液规定数值相差不大于0.02PH单位，否则，需检查仪器或更换电极后，再行校正至符合要求。

每次更换标准缓冲液或供试液前，应用纯化水充分洗涤电极，然后将水吸尽，也可用所换的标准缓冲液或供试液洗涤。

配制标准缓冲液与溶解供试品的水，应是新沸过并放冷的纯化水，其PH值应为5.5-7.0。

新购置的玻璃电极需在蒸馏水烧杯中浸泡24小时活化后才可使用。

3、操作：

打开电源预热15分钟，探头用蒸馏水洗净，把探头帽里倒上饱和氯化钾溶液。

测定前，分别用邻苯二甲酸盐标准缓冲液4.0校正后，用蒸馏水清洗探头，用滤纸毛边轻轻沾一沾。

用磷酸盐标准缓冲液6.86校正，用硼砂标准缓冲液9.18校正后，使仪器示值与表列数值一致。

把新沸过冷却蒸馏水装入小烧杯中，放在探头下，PH值在5.5-7.0之间合格。

之后用蒸馏水清洗探头，把装满饱和溶液的探头帽盖上，拔掉电源，将电极放回盒中。

环氧乙烷残留量分析-比色分析法

1、原理：

环氧乙烷在酸性条件下水解成乙二醇，乙二醇经高碘酸氧化生成甲醛，甲醛与品红-亚硫酸试液反应产生紫红色化合物，通过比色分析可求得环氧乙烷含量。

2、溶液配制：

0.1mol/L盐酸：

取0.9ml盐酸稀释至100ml

高碘酸溶液（5g/L）：

称取高碘酸0.5g，溶于水，稀释至100ml

硫代硫酸钠溶液（10g/L）：

称取硫代硫酸钠1.0g，溶于水，稀释至100ml

亚硫酸钠溶液（100g/L）：

称取10.0g无水亚硫酸钠溶于水，稀释至100ml

品红-亚硫酸试液：

称取0.1g碱性品红，加入120ml热水溶解，冷却后加入10%亚硫酸钠溶液20ml，盐酸2ml置于暗处。

乙二醇标准贮备液：

取一个外部干燥、清洁50ml容量瓶，加水约30ml，精确称重，精确量取0.5ml乙二醇，迅速加入瓶中，摇匀，精确称重。

两次称重之差即为溶液中所含乙二醇的含量。

加水至刻度，混匀计算其浓度：

C=

×

C-乙二醇标准贮备液浓度，克/升

m-溶液中乙二醇质量，克

乙二醇标准溶液：

精确量取标准贮备液1.0ml，用水稀释至1000ml

3、模拟使用浸提法：

用水作为浸提介质。

浸提温度：

整个或部分与人体接触的器械在37℃浸提。

浸提时间：

不短于1小时。

浸提表面：

器械与药液或血液接触表面。

4、试验步骤：

取5支纳氏比色管，分别精确加入0.1mol/L盐酸2ml，再精确加入0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml乙二醇标准溶液，另取1支纳氏比色管，精确加入0.1mol/L盐酸2ml作空白对照。

于上述各管中分别加入高碘酸溶液（5g/L）0.4ml，摇匀，放置1小时，然后分别滴加硫代硫酸钠溶液至出现黄色恰好消失，再分别加入品红-亚硫酸试液0.2ml，用蒸馏水稀释至10ml，摇匀，35℃-37℃条件下放置1小时，于560nm波长处以空白液作参比，测定吸光度。

绘制吸光度-体积标准曲线。

精确量取供试液2.0ml于纳氏比色管中，以测得吸光度从标准曲线上查得试液相应的体积。

5、结果计算：

环氧乙烷残留量用绝对含量或相对含量表示

环氧乙烷绝对含量：

WEO=1.775VC1M

WEO-单位产品中环氧乙烷绝对含量

M-单位产品质量

C1-乙二醇标准溶液深度

V-标准曲线上找出供试液相应体积

环氧乙烷相对含量：

CEO=1.775VC1×

103

CEO-单位产品中环氧乙烷相对含量

C1-乙二醇溶液浓度

化学实验室安全制度：

1、实验室人员要熟悉实验室及周围环境，清楚水电开关位置，懂得消防器具使用方法，一旦发生事故，应采取相应措施。

2、实验室各类化学试剂要根据其性质分类，定置存放，标记清楚，摆放整齐，用量严格按照规定量。

3、各种试剂、容器要带有书写清楚标签，避免拿错、用错，吸取各溶液时要用橡皮吸球，严禁用嘴吸，易燃、易爆试剂要远离火源，使用腐蚀性药品应小心，避免沾在衣服或皮肤上。

4、实验室排风设备应保持通畅。

5、实验完毕后，应及时洗涤所用器皿，整理好实验用品。

6、实验后认真整理实验记录，处理实验所得数据。

7、离开实验室前，务必进行水电门窗安全检查，锁好门方可离开。

生物检测室安全制度：

1、实验用过培养基、试管、吸管用品须经有效消毒处理后方可丢弃或清洗。

2、操作仪器时不得超负荷、超量使用。

凡有过热、冒烟、异常气味和异常声音等现象应立即切断电源，停止运行，查找原因。

3、实验仪器设备启动后，工作人员要坚守岗位，凡连续工作仪器设备须专人看管。

4、每日上班后检查冰箱、恒温箱工作情况，下班检查水、电、门、窗，确保安全。

5、实验室应备小型灭火器，每人应会使用。

生物室

药典一部高压消毒锅

恒温培养箱2台旋涡混合仪

恒温水浴箱电热鼓风干燥箱

冰箱酒精灯

营养琼脂培养基改良马丁培养箱

硫乙醇酸盐流体培养基0.9%氯化钠

细菌内毒素工作标准品10支/盒每安瓿含内毒素10EV

细菌内毒素检查用水10ml×

10

鲎试剂灵敏度0.25EV/ml0.1ml×

10支

培养皿ф90×

15剪刀试管（大、小）试管塞

烧杯镊子封口膜

锥形瓶药匙铁盒

量筒洗耳球锡纸

试管架（大、小）移液管接种环

化学室：

紫外分光光度计分析天平

电导率仪及试液PH仪及试液

干燥箱水浴锅（4个头）

超声清洗器电炉/石棉网

滤纸沸石玻璃棒

烧杯锥形瓶

量筒容量瓶

广口瓶试管架

纳氏比色管移液管

洗耳球称量瓶

蒸发皿ф200滴定管

滴定管架试管20ml

冲洗瓶剪刀

镊子胶头滴管

PH广泛试纸1-14刷子

电位仪玻璃仪器柜