柑橘果实有机酸代谢及调控研究.docx

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柑橘果实有机酸代谢及调控研究

安徽农业大学

硕士学位论文

禾甘橘果实有机酸代谢及调控研究

姓名：

赵淼

申请学位级别：

硕士

专业：

遗传学

指导教师：

林毅;谢鸣

20080601

摘要

相桔是我国最主要的果树之一，也是南方地区的第一大水果在国际上占有重要位置。

但是当前我国相桔生产存在一个突出问题就是果实含酸量过高、糖酸比偏低，使相橘风味下降甚至变差。

因此，研究相■橘类果实有机酸代谢的规律、成分及调控具有重要意义》本实验通过对不同早、晚熟品种的相橘有机酸代谢及相关酶在发育过程中的变化，及试剂调控的作用进行研究，旨在于明确相■橘果实发育动态，摆明相橘有机酸及其主要成分的代谢规律；明确代谢相关酶的作用及提出初步调控思路；主要研究结果如下：

1.通过比较分析不同的流动相及其pH值，利用反相高效液相色谱结果得出适宜的工作条件为：

20mniol/LKH2P04+3%甲醇，pH值为2.55。

利用四种不同方法提収样品，比较结果显示：

醇提法提出的酒石酸及草酸含量最高，水提法提出的梓樣酸及苹果酸含量最高，其对应的回收率也是同祥的结果。

2.果实含水量在整个果实发育阶段均增加。

果实的纵横径均呈"S"变化。

果实中细胞质pH值先下降后上升，与总有机酸含量成负相关。

3.在各类型批橘果实中糖积累的过程中，各类型果实均已己糖积累为主。

不同早、晚熟品种村橘果实中各糖成分及总糖的含量在整个果实发育的生理期增加。

其中早熟品种葡萄糖含量在7月底至8月底增加缓慢，晚熟品种在8月中旬到9月底增加缓1曼，可能是由于一部分葡萄糖被降解用来合成酸。

4.早熟品种含酸量达到最高是在花后100天，晚熟品种在花后120天达到最高。

不论早、晚熟品种总酸含量变化趋势都是在幼果期略有下降，然后急剧增加，最后缓慢下降。

不同类型的相■橘果实中主要含有樣酸、苹果酸、據《酸和草酸，其中梓樣酸为主要酸，发育过程中变化曲线与总酸一致。

其他酸在发育过程中都成下降趋势。

5.MDH,PEPC,CS活性随着果实发育都呈现低-高-低的变化趋势，其中MDH在果实发育早期将苹果酸转化为供梓棱酸合成的草醜乙酸，而在果实成熟期将苹果酸转化为草酸乙酸。

梓樣酸含量增加期间，其含量与PEPC、CS成显著正相关，梓樣酸降解期间与酶活性无明显相关性。

6.有机溶剂及熟酷均能通过降低PEPC活性而在梓棱酸增加阶段降低其含量，但后期虽然PEPC活性也降低但降酸效果不明显。

7.GA能显著降低果实总有机酸及梓樣酸的含量，并能增加苹果酸的含量，这是由于GA能降低PEPC活性，增加MDH活性而导致的。

ABA能增加果实有机总酸及梓樣酸的含量，同时也能增加果实中苹果酸的含量，这是由于ABA能增加MDH,PEPC的活性所形成的结果。

在梓樣酸降解期间PEPC,MDH,CS仍然在合成有机

酸，只是由于合成量远小于降解量，导致梓樣酸及总酸含量的下降。

关键词：

拼桔，有机酸，代谢，调控,PEPC,CS,MDH

Abstract

Citrusisoneofthemostimportantfruittreesinourcountry,andalsoplaysanimportantroleininternationalcountries.However,thereisastandoutproblemthatthecontentsoforganicacidistoohigh,theratioofsugar/acidislowerwhichmakecitrusfruitstastebad.So,itisveryimportanttomakesuretherulestometabolismoforganicacid,thecontentsandtheregulationmethods.Thispaperdoessomeresearchofaboveproblemsusingdifferentgenotypesofcitrusfruits,theaimistomakesurethedynamicgrowthofcitrusfruits,therulesofmetabolismoforganicacids,andgivesomeprimarymethodsofregulation.Theresultsasfollowed:

1.Thecontentoforganicacidincitrusfruitisoneofimportantguidelineswhichdecidethequalityoffruits..SoItisimportanttoestablishingaeffectiveandprecisemethodtodeterminatethecontentoforganicacidsincitrusfruit.ThispaperanalyzeddifferentmobilephasesanditspHwithRP-HPLCtofind:

Themobilephase20mmol/LKH2PO4+3%methanolhasthebetterresults.Atthesametimeweanalyzedfourdifferentextractionmethodsfordeterminationorganicacidsincitrusfruit:

Thecontentsoftartaricacidandoxalicacidextractedby80%ethanolarehighest;thecontentsofcitricacidandmalicacidextractedbywaterarehighest.

2.Thecontentsofwaterinfruitsarealwaysincreasingduringthewholedevelopments.Thechangesofverticalandhorizontaldiameterlikestheletter‘S，.ThepHvalueincreasesfirst,thendecline,andisnegativecorrelationwithtotalorganicacids.

3.Allgenotypecitrusinthispaperaccumulatehexose.Thecom{）onentsofsugarandtotalsugarsincreaseduringthewholedevelopmentsoffruits.ThecontentsofglucoseinearlycitrusfruitincreaseslowlyfromtheendofJulytotheendofaugust.ThecontentsofglucoseinserotinouscitrusfruitincreaseslowlyfromthemiddleofaugusttotheendofSeptember,becausesomeofthemareusedtosynthesizedacid.

4.Thecontentsoforganicacidandtherelativeenzymeactivitiesoforganicacidwerestudiedandtheircorrelationwasanalyzedduringthefruitdevelopmentofcitrus.Theresultsshowedthattherewerecitricacid,malicacid,susinicacid.Oxalicacidinfreshcitrusfruit.Changesinconcentrationofcitricacidaresimilarwithconcentrationofallorganicacid,whiletheotheracidsdeclinedgradually.

5.TheenzymeactivitiesofMDH,PEPC,CSwereallfromlowtohigh,thendownagain.Theconcentrationofmalicaciddeclinedwasbecauseitwascatalyzedtooxaloaceticacidforsynthesizingcitricacidduringtheearlystageofdevelopment.CorrelationanalysesshowedthattherewasasignificantpositivecorrelationbetweenconcentrationofcitricacidandPEPC,CSduringanabolismofcitricacid,whiletherewasnosignificantcorrelationduringdegradationofcitricacid

6,Organicsolventandethychlozatecanreducethecontentsofacidsbyreducingthe

activitiesofPEPCduringtheearlystage,howeverthelaterstageisnoteffective.

7.GAcanreducethetotalcontentsoforganicacidsandcitricacid,increasethecontentsofmalicacid,

becauseitcanreducetheactivitiesofPEPCandincreasetheactivitiesofMDH,ABAcanincreasethecontentsoforganicacidsandcitricacid,andincreasethecontentsofmalicacid,becauseitcanincreasetheactivitiesofMDHandPEPC.TheactivitiesofPEPC,MDH,CSstillincreaseduringthedegradationstageofcitricacid,butthecontentsofmetabolismislessthanthecontentsofdegradation,sothecontentsoftotalacidsandcitricaciddecline.

Keywords：

Citrus,Organicacid,Metabolism,Regulation,PEPC,MDH,CS

独创性声明

本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。

尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机拘的学位或证书而使用过的材料。

与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。

时间:

研究生签名:

关于论文使用授权的说明

本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：

学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。

同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。

时间：

（保密的学位论文在解密后应遵守此协议）

研究生签名:

导师签名：

I文献综述

批橘果实中有机酸的含量和成分是决定果实品质的主要因素之一。

目前，随着人们生活水平的提高，对相•橘果实品质的要求也日益提高，因此对果实有机酸代谢的研究，无论是对果树育种、!

C运加工及增加其市场竞争力，提高经济效益都有重要意义。

有关有机酸综述文章己有报导,但是报导中没有就批抬类果实有机酸做一个详细的概述，特别是对于有机較的降解、有关酶在酸代谢过程中具体起着什么样的作用、跨膜运输中株樣酸离子与质子是如何达到动态平衡的阐述不够清楚。

本节综述了近年来有关果实有机酸代谢研究进展，并对以上问题加以详细的补充说明。

1.1相福果实中有机酸的种类

果实中有机酸的组分有很多种，但大多数果实中以一种或两种有机酸为主，其他的有机酸以微量形式存在。

相■桔果实中有机酸也是如此。

Yamaki【il分析了47个不同品种的相■橘果实中有机酸的组分，发现相橘果实中含有梓樣酸、苹果酸、乙酸、草酸、乳酸、戊二酸、富马酸、异樣酸、號柏酸、丙酬酸、甲酸、O-S戊二酸等；并且发现梓棱酸在高酸果实中占主要成分，其他都是微量酸，而在低酸或无酸种类中以苹果酸为主其次才是I?

樣酸。

YuXL[2]等也发现抽子果实中的有机酸主要是斤樣酸占2.97-4.75%,其次还含有苹果酸占0.21-1.00%、丙二酸、草酸、富马酸、號柏酸等。

AlbertiniMV等【3]测定了高酸及无酸不同品种的梓樣，酸禮，相■橘等果实发现，无论什么品种在发育前50天都是以査尼酸为主，而后梓樣酸在酸性品种中占主要成分，而苹果酸在无酸品种中•主要成分。

由此可见，不同品种之间有机酸的含量还是有很大差异的。

如果能降低果实中I?

樣酸的含量则可以达到降酸的目的。

1.2相橘果实中有机酸代谢机制

大多数果实，有机酸在果实发育过程中的一般规律为：

在果实生长发育过程中有机酸逐渐积累，在进入成熟过程中有机酸含量下降。

罗安才等研究认为相橘果实果肉中有机酸含量在果实发育前期增长速度较快，果实体积略为成熟体积一半时达到最大值，以后逐渐下降。

Cerco's?

4等【51发现相桔果实（Clementina）可滴定酸在花后50天内略下降，之后的80天左右酸度急剧增加，而后100天左右又急剧下降，其中主要是校橡酸下降，苹果酸变化不大；在花后89天梓樣酸含量达到最大10.3mgmri。

果实中有机酸的来源有两种假说，一种认为有机酸在叶中通过光合作用进行C02的暗固定合成后运输至果实。

另一种认为果实自身可通过C02暗固定来合成有机酸。

目前，国内外果实中有机酸代谢己有较多的研究，有关果实有机酸代谢机理研究主要围绕梓樣酸的合成、运输、积累而进行。

Sadka【6l等提出了一个酸代谢模式:

PEP竣化酶（PEPC）竣化隣酸炼醇式丙酬酸（PEP）产生草酷乙酸（OAA）,I?

樣酸合成酶（CS）催化OAA与由PEP转化而来的乙酸辅酶A（AcCoA）结合产生If樣酸。

然后进

入细胞质中，再通过H+泉的主动运输进程运入液泡积累；但当其在汁胞内积累到过高水平时，梓樣酸又可运出液泡到细胞质中，在Fe离子作用下，细胞质乌^酸酶催化下转化异朽^樣酸，然后在异朽=樣酸脱賓酶（NADP-IDH）催化下转变成a-丽戊二酸。

有关梓機酸和苹果酸与其他酸之间的相互转化还不太清楚。

果实成熟后期有机酸的含量的下降有很多原因，果实体积的增加水分大量进入、有机酸的分解大于合成[6】，作为基质参与呼吸和糖异生作用[7]等。

€6『（；0'81^1等[5]通过对相橘Ulementim）果实发育和成熟阶段的7000个基因的表达变化研究并用RP-PCR方法得出核樣酸的另一条利用途径：

梓樣酸先被代谢成异梓樣酸然后是2-氧谷氨酸、谷氨酸;谷氨酸一方面被用来生成谷氨酸盐，一方面通过谷氨酸+H+~^GABA+CO2进入GABA途径（GABA—半酸號拍酸號拍酸）。

其代谢途径如下图所示：

梓橡酸

乌头酸酶

I

异ff橡酸

ATP-朽=樣酸隨

草醉乙酸+乙醜辅酶

L-谷第酸半K

GABA

GABA寡基转移酶

谷宾酷胺合成酶

谷氣酸氛

N-乙酸-鸟第酸

玻a酸半酸

號柏酸脱氛酶

oMl

★

喧挫

脑氧酸

Vbi

L-I-Ptt略琳-5竣酸

號IS酸

圈I相桔果实发育过程中朽=橡酸的利用装K过程，粗箭头之间表示代谢物指示S因感应，X表示抑制：

细箭头表示基因表达没有明a变化；虚箭失表示基因没有在基因芯片中表达

Fig.IProposedmechanismofcitrateutilizationduringdevelopmentandripeningoffruitfleshfromClementinamandarins.

从此图中可以看出梓樣酸的利用与氨基酸的代谢,特别是谷氨酸的代谢有很密切

的联系。

因此，研究有机酸的代谢尤其是有机酸的降解过程，我们还得综合考虑氨基酸的代谢。

1.3稍橘果实有机酸代谢相关酶及其与有机酸含量的关系

果实有机酸的代谢过程十分复杂，涉及到许多不同的酶，主要有磷酸炼醇式丙翻酸梭化酶（PEPC）、憐酸婦醇式丙雨酸竣激SI（PEPCK）、核樣酸合成酶（CS）、顺乌头酸酶（ACO）、异梓樣酸脱氧酶（IDH）、苹果酸脱氧醜（MDH）、苹果酸酶（ME）、苹果酸合成酶（MS）、和异梓樣酸裂解酶（ICL）等。

PEPC是一类能催化PEP竣化生成OAA和无机磷的胞质酶，易受苹果酸、丙銅酸[8]、號柏酸、天冬氨酸、ATP等抑制，其活性也易受pH[9]和可逆磷酸化等影响【1",能被葡萄糖-6-磷酸激活[11]。

罗安才【4]等研究认为相橘果实果肉中PEPC活性越高，PEPC/NAD-IDH的比值越大果实中有机酸的含量就越大，可见PEPC与有机酸的合成有密切联系。

PEP梭化酶（PEPC）竣化磷酸爆醇式丙S酸（PEP）产生草敢乙酸（OAA）,梓樣酸合成酶（CS）催化OAA与由PEP转化而来的乙酷辅酶A（AcCoA）结合产生挖樣酸。

线粒体中乌头酸酶活性的降低导致梓樣酸浓度增加，然后进入细胞质中，再通过H+菜的主动运输进程运入液泡积累：

但当其在汁胞内积累到过高水平时，枚樣酸又可运出液泡到细胞质中，在Fe离子作用下，细胞质乌头酸酶催化下转化异校樣酸，然后在异校樣酸脱意酶（NADP-IDH）催化下转变成a-S戊二酸。

在正常情况下，斤樣酸、苹果酸均作为TCA循环的中间产物，不会有大量积累，因此，梓樣酸的积累可能是TCA循环在梓樣酸的下游受阻，并在上游由合成斤樣酸底物的回补反应（即产生枚樣酸的中间产物，如草酷乙酸）导致从合成途径分析，梓樣酸的积累与PEPC、乌头酸酶、CS、IDH等有关。

在筋禮中发现PEPC、CS活性与骄授If樣酸含量呈显著正相关[13]。

但也有研究表明梓樣酸含量变化与CS活性无显著相关性t»4】。

果实生长后期至成熟期间，有机酸含量呈下降趋势，主要原因包括酸代谢中酶系统的变化致使有机酸被氧化，梓樣酸的分解大于合成，另外是随着果实的增大，含水量的增加而产生稀释作用，同时部分有机酸转变成了碳水化合物。

在植物细胞中，PEPCK只存在于细胞溶质中'，并催化反应OAA+ATP^^PEP+C02+ADP[i5】。

虽然在大部分水果中PEPCK的发生还不太清楚，但关于这方面的研究已经在葡萄【16]和西红棉[17坤取得了结果，研究表明，在果实成熟的一开始果肉中的PEPCK含量就大量增加。

因此可以认为PEPCK可能在梓樣酸或苹果酸的代谢中起作用。

F^anco等【l8]研究发现，在越橘和红葡萄中，当存在苹果酸异化物时PEPCK的含量很高，在树蕃（raspberry）鲜果中当有苹果酸和校樣酸异化物时PEPCK的含量最高。

因此，他认为在果实成熟过程中PEPCK对校樣酸和苹果酸的异化起着重要的作用。

同时还发现当这些果实中没有梓樣酸或苹果的异化物时也存在PEPCK,并由此推断PEPCK可能还有其他功能。

PEPC和PEPCK同时存在于果实细胞质中它们之间的关系

有待进一步研究，尤其是相枯果实中PEPCK还未见报道。

CS是一类存在于果实细胞线粒体中能催化OAA与Ac-CoA结合生成梓橡酸的酶。

文涛n9]等发现抑制骄禮果实梓樣酸合成酶活性后能极显著地降低果实有机酸含量,但对PEPC活性影响不大，因此认为梓樣酸合成酶是影响行樣酸合成的关键酶。

CaneP]等研究高酸与低酸相橘果实有机酸代谢变化时认为CS活性和表达的变化与相•橘果实株樣酸水平变化无关。

罗安才[4]等通过对各类型相■橘果实有机酸检测发现CS活性在发育前期迅速上升，后期略有下降，但与其梓樣酸变化差异并无明显联系。

Sadka[2i】等以酸疗橡和甜梓樣为材料研究认为，它们的有机酸积累差异与线粒体的CS活力无关。

CS活性与有机酸积累关系有待进一步探讨。

顺乌头酸酶又称乌头酸水合酶，催化顺乌尖酸生成校樣酸或异棱酸的立体专一性的可逆反应[22】。

并能参与异构化、催化反应、RNA结合，它是一个四结构域蛋白，在第三结构域内的铁-硫族是Il促立体有选择反应的催化中心[26】。

目前己发现植物含有线粒体ACO和胞质ACO两种同工酶[24’25]。

前人研究认为果实中梓棱酸积累是由于ACO的活性受到抑制从而阻碍了校棱酸转化为顺乌头酸[8’241。

罗安才等研究了各类型相橘果实线粒体乌头酸酶活性变化一致，随果实发育降低，表明果实发育后期有机酸降解与线粒体乌头酸酶活性的降低无关，而较低的细胞质乌头酸酸活性有利于酸的积累。

Sadka等【24]在研究甜来樣和酸来樣果实发育过程中认为早期线粒体ACO活性的降低对果实发育前期有机酸的积累起一定的作用，成熟期胞质ACG活性的增加降低成熟期果实有机酸的浓度。

普遍认为IDH有NAD-IDH和NADP-IDH两种存在形式，也有学者【27]认为植物体内至少存在4种形式的IDHaNAD-IDH只存在于细胞线粒体参与TCA循环，而NADP-IDH可存在于胞质、叶绿体、过氧化物酶体和线粒体中【24]。

NAD-IDH主要存在于线粒体中，是三段酸循环的第二控制点，催化异梓樣酸与CC-S戊二酸的互变。

NADP-IDH能氧化脱竣2R,3S异梓樣酸产生2-戊二酸，C02,和NADPH【28】。

Sadka【29】发现在梓樣果实的小果期主要是线粒体NADP-IDH,随着果实的增大线粒体NADP-IDH活性下降而细胞质NADP-IDH活性增加且与NADP-IDH基因表达一致，因此认为此酸参与有机酸的降解。

NAD-MDH存在于乙酸酸体、线粒体、过氧化物体、叶绿体、细胞质，能催化草酷乙酸盐与苹果酸盐进行相互转化，苹果酸脱氣酶可以NAD或NADP为辅因子[3°’26]。

罗安才等【26]在研究各类樹橘品种时发现斤楼MDH活性一直较低，但其他相桔MDH活性变化与果实校樣酸含量差异没有发现有明显的关系。

植物中有多种形式的ME,在细胞溶质和质体中存在NADP-ME,在线粒体中存在NAD-ME【3i]。

斤