植物药中检测黄曲霉毒素IACHPLC方法研究Word文档格式.docx
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scienceofChinesetraditionalmedicine
Specialty:
pharmacognosy
ThemodernizationoftraditionalChinese
Researchfield:
medicineandresourcedevelopmentresearch
Postgraduate:
RuanYinghuiSupervisor:
ProfessorLinGuanmei
April,2013
SubmittedDate:
独创性声明
本人声明,所呈交的学位（毕业）论文,是本人在指导教师的指导下独
立完成的研究成果,并且是自己撰写的。
尽我所知,除了文中作了标注和致
谢中已作了答谢的地方外,论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。
与我一同对本研究做出贡献的同志,都在论文中作了明确的说明并表示了谢
意,如被查有侵犯他人知识产权的行为,由本人承担应有的责任。
学位（毕业）论文作者亲笔签名:
日期:
论文使用授权的说明
本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位（毕业）论文的规定,即学
校有权送交论文的复印件,允许论文被查阅和借阅;
学校可以公布论文的全部或
部分内容,可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。
保密,在年后解密可适用本授权书。
□不保密,本论文属于不保密。
□
指导教师亲笔签名:
目录
摘要I
AbstractIII
第一章引言1
1黄曲霉毒素概述1
1.1理化性质.1
1.2毒性及危害3
1.3限量标准.5
1.4检测方法.7
1.5脱毒方法10
1.6预防措施12
2中药材中黄曲霉毒素检测研究进展13
3展望.16
第二章植物药中检测黄曲霉毒素IAC-HPLC方法研究.18
1材料与方法18
1.1试验材料与试剂18
1.2试验仪器和设备19
1.3试液的配制.19
1.4试验的内容与方法20
1.5试验结果计算23
2结果与分析24
2.1黄曲霉毒素B、B、G、G标准品实际浓度测定24
1212
2.2提取液浓度的选择25
2.3提取方式的选择26
2.4IAC淋洗液的选择27
2.5衍生方式选择28
2.6流动相的选择34
i2.7方法学考察.35
2.8样品检测38
3本章讨论44
4本章小结45
第三章不同品牌IAC性能测试及选择46
1材料与方法46
1.1试验材料与试剂46
1.2试验设备与仪器46
1.3试液的配制.47
1.4试验内容与方法47
1.5试验结果计算50
2结果与分析50
2.1柱容量50
2.2柱回收率50
2.3甲醇和乙腈的耐受性.52
2.4洗脱液浓度与体积的确定54
2.5pH值变化对免疫亲和柱吸附效果的影响55
2.6上样流速的确定56
2.7洗脱时间的确定57
2.8活化再生时间的确定.57
2.9柱重复使用性和稳定性58
3本章讨论59
第四章中药炮制对黄曲霉毒素的影响.60
1材料与方法60
1.1试验材料与试剂60
1.2试验设备与仪器60
1.3试验内容与方法61
2结果与分析62
2.1培养天数选择62
ii2.2净制.63
2.3炒制.63
2.4麸制.64
2.5蜜制.64
2.6酒制.65
2.7盐制.66
3本章讨论66
第五章结论与展望68
1结论.68
2创新之处69
3展望.70
参考文献.71
致谢77
iii福建农林大学硕士学位论文植物药中检测黄曲霉毒素IAC-HPLC方法的研究
摘要
黄曲霉毒素Aflatoxins,简称AFT是目前已知作用最强的基因毒性物质和致
癌物质,在高温、高湿环境下,极易产生且不易去除。
我国药材种植、加工、运
输、存储过程中,稍有不慎,极易染毒。
本研究建立了适合于普遍植物药材进行
黄曲霉毒素检测的IAC-HPLC法,并运用该法对福州各大药店的11种药材（甘草、
当归、泽泻、山药、绞股蓝、鱼腥草、麦冬、枸杞子、三七花、红花、山楂）进
行黄曲霉毒素污染调查,为完善的限量标准及检测方法提供科学参考。
研究内容
如下:
1.对中药材中黄曲霉毒素检测步骤的前处理、净化、衍生方式、色谱条件进
行探索、优化,成功建立植物药材中检测黄曲霉毒素的高效液相法。
该法以信噪
比S/N3∶1（N噪声,S被测物信号/单位体积）作为最低检出限。
黄曲霉毒素
AFB、AFB、AFG和AFG的最低检测限分别为0.1、0.02、0.05和0.05μg/kg。
以目前最严格的欧盟限量标准AFB<
2μg/kg,此方法能满足现在国际上越来越严
1
格的黄曲霉毒素限量的检测要求。
以甘草为基质,加标水平在0.5~8ng/mL范围
内,线性方程为:
Y37959X+669.33（r0.9999）;
Y81720X+2225.8（r0.9999）;
B1B2
Y35430X+1821.6（r0.9999）;
Y18884X+654.04（r0.9999）;
G1G2
除AFG外加标回收率在62%~88%,其余加标回收率在74%~108%,日内和
2
日间RSD为1.02~11.7%,1.53%~6.21%,结果证明该方法准确、可靠,适用
于中药材中黄曲霉毒素的检测。
2.在黄曲霉毒素检测步骤中,净化是重要一环,本实验对净化用免疫亲和柱
进行效能比较及最佳使用条件进行研究。
本实验选用Vicam、Clover、Romer、
华安麦科公司的这四种目前最常使用的黄曲霉毒素总量柱进行研究,结果表明:
Vicam、Clover、Romer、华安麦科的黄曲霉毒素总量柱,最大承受AFB的柱容
量分别为:
355ng、287ng、602ng、475ng。
Romer的加标回收率好于其他,平
均达107%。
免疫亲和柱的上样的甲醇和乙腈耐受度分别在20%和10%以下;
Cover和华安麦科公司产的IAC柱pH值在7.0是为吸附最优,Vicam和Romer
公司产IAC柱pH值分别在7.2和7.4为吸附最优。
各种品牌免疫亲和柱的重复利
用中,活化时间均要求大于18小时。
各品牌IAC柱均可重复使用1~3次且吸附
I福建农林大学硕士学位论文植物药中检测黄曲霉毒素IAC-HPLC方法的研究
率均在90%以上,3次重复使用后回收率不同程度减低,其中在吸附率可使用范
围内,华安麦科公司的IAC重复使用次数可达到7次。
3.研究不同炮制方法对中药材中黄曲霉毒素含量的影响。
实验结果表明:
净
制前后对比,黄曲霉毒素减少率达75%;
加热炮制（炒制）对药材中黄曲霉毒素
几乎没有影响;
蜜制药材容易滋生黄曲霉毒素;
酒制、盐制对药材,黄曲霉毒素
均有不同的减少,但是无法彻底去除。
关键词:
植物药材;
黄曲霉毒素;
高效液相色谱II福建农林大学硕士学位论文植物药中检测黄曲霉毒素IAC-HPLC方法的研究
Abstract
Aflatoxinsiscurrentlythestrongestknowngenetictoxicsubstancesand
carcinogenicsubstances,underhightemperatureandhighhumidityenvironment,easy
toproduceandnoteasytoremove.TraditionalChineseHerbalMedicineinplanting,
processing,transportationandstorageprocess,carelesslyabit,iseasilyinfected.This
researchthroughtheuseofIAC-HPLCdetectionmethodstudyofAflatoxins
contaminationinTraditionalChineseHerbalMedicine,UsedintheGlycyrrhiza
uralensis,LyciumbarbarumL,RadixAngelIACeSinensis,Dioscoreaoppositaandso
on,toestablishandimprovethestandardofsetlimittoprovideascientificreference
anddetectionmethods,Themaincontentisasfollows:
1AflatoxinsintraditionalChinesemedicinalmaterialsbeforetreatment,
purifIACtion,andchromatographicconditions,thecolumnderivatizationwayto
optimizeexploration,andsuccessfullycreatefordetectionofIAC-HPLC.Thelimit
ofdetectionLOD,RSN3was0.1,0.1,0.05and0.05μg/kgforAflatoxinsB,B,G
121
andGThemoststringentEvaluationstandardlimitsforpermissiblelevelsofAFB
21
2μg/kg,AnexcellentlinearralationshipbetweenpeakareaanfAFTconcentrationwas
0.5~8ng/mL,thelinearequationasfollows:
ExcepttheAFGplustherecoverywas62%~62%,therestofthestandardaddition
reconveryrateof74%~108%,RSDoftestoftheinstrumentprecisionandthe
stabilityexperimentwas1.02~11.7%,1.53%~6.21%.Theralationstardarddiviation
ofthemethodwasfrom0.9to15.9%.Theresultsdemonstrastedthatthemethodas
suitableforthedetectionforAFinTraditionalChineseHerbalMedicine2Researchonfourkindsofimmuneaffinitycolumnefficiencyandtheuse
R
conditions,theresultsshowthattheVicamVicamisAflaTeat-P,CloverClover
TM
TechnologyGroupInc,RomerRomerisAflastarR,Hua'
anitHuaanMagnech
Bio-TechCo.,LtdisAflatoxinsTest.AflatoxinsofthetotalcolumnIAC,imum
columncapacityofAFB1asfollows:
355ng,287ng,602ng,475ngRecoveriesof
III福建农林大学硕士学位论文植物药中检测黄曲霉毒素IAC-HPLC方法的研究
AFsplikedtoRomerthatrecoveryratebetterthantheothertoanaverageof107%Immuneaffinitycolumnonasampleofmethanolandacetonitrileundertheresistance
in20%and10%respectively;
CoverandHuaAnitcompanytoproducethepillarsof
theIACinthepHvalueof7.0isfortheoptimaladsorption,RomerandVicamthe
pillarsofthecompanyproductionofIACinthepHvalueof7.2and7.4,respectivelyRepeateduseofpillars,activationtimeafter18hour.Eachcolumninthereuse
adsorptionratioonetimestothreetimesareover90%,recoveryrateafterthreetimes
reducedtovaryingdegrees,intheadsorptionratecanbeusedwithinthescopeofHua
AnitcompanyHuaanMagnechBio-TechCo.,ofIACreusetoreachseventimes3ResearchontheeffectofdifferentprocessingmethodsofTraditionalChinese
HerbalMedicineinAflatoxins.Theexperimentalresultsshowthatanetsystembefore
andaftercontrast,Aflatoxinsdecrementby75%;
HeatingupfryingAflatoxinsin
medicinehavelittleimpact;
Stir-fryingwithhoneyismademedicinalmaterialseasy
breedinggroundforAflatoxins;
Winesystemandsaltofmedicinalherbstosomeextent
reducesonAflatoxins,butyoucan'
tthroughlyremove
Keywords:
TraditionalChineseHerbalMedicine;
Aflatoxins;
HPLC
IV福建农林大学硕士学位论文植物药中检测黄曲霉毒素IAC-HPLC方法的研究
第一章引言
1黄曲霉毒素概述
黄曲霉毒素Aflatoxins,简称AFT是20世纪60年代初发现的一种真菌毒
[1]
素,AFT是到目前为止所发现的毒性最强的真菌毒素。
主要分布于土壤、动植
物、各种坚果,特别在高温高湿的环境的热带和亚热带地区,食品中黄曲霉毒素
的检出率较高。
据调查,在我国产黄曲霉毒素的菌株主要是黄曲霉。
1980年测定
了从17个省粮食中分离的黄曲霉1660,广西地区的产毒黄曲霉最多,检出率为
58%。
总分布情况为:
华中、华南、华北产毒菌株最多,产黄曲霉毒素量也最大,
东北和西北地区较少。
[2]
黄曲霉毒素目前已被世界卫生组织的癌症研究机构划定为Ⅰ类致癌物,在自
然界所有物质中毒性名列第一。
它一旦进入人体常常造成不可逆的伤害,所以事
前防控是关键。
因此,对在日常摄入的食品及药品进行黄曲霉毒素检测至关重要,
如何建立迅速、准确、高效的检测技术值得人们广泛和深入的研究。
目前已经分离出的种黄曲霉毒素主要有:
B、B、G、G、M、M、P、H、
12121211
G、B和毒醇等,其中B、B、G、G四种毒素大部分在植物类食品中,毒
M2a1212
性又以B为最。
黄曲霉毒素M则是黄曲霉毒素B在体内经过羟化而衍生的代谢
111
[3]
物,主要存在于动物的可食用部分,如乳、肝、蛋类等,其中以乳类中最为常见。
1.1理化性质
黄曲霉毒素是一种杂环分子,具有二呋喃环（为毒性结构）和氧杂萘邻酮又
叫香豆素,为致癌物质的基本结构,B是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物,含有一
[4]
个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮香豆素,黄曲霉毒素B、B、G、G的化学结构
如图1.1。
B（CHO）B（CHO）
117126217146
1福建农林大学硕士学位论文植物药中检测黄曲霉毒素IAC-HPLC方法的研究G（CHO）G（CHO）
117127217147图1.1黄曲霉毒素B、B、G、G的化学结构
Fig.1.1StructureofAflatoxins黄曲霉毒素具有无臭、无味、无色,对热、酸和光稳定性高等特性,分子量
为312~346,熔点在200~300℃。
能被氯仿、丙酮、甲醇、乙醇等有机溶剂溶解,
但不溶于己烷、水、石油醚与乙醚。
具有很强的荧光反应,在紫外线照射下,黄
曲霉毒素B,B呈蓝色荧光,黄曲霉毒素G,G呈绿色荧光,全部为右旋-光
12l2
学活性体。
它在362nm或350nm处AF紫外吸收的摩尔吸收系数:
AFB
[5]
AFBAFG≌AFMAFG。
黄曲霉毒素B、B、G、G的理化性质见表1.1。
121212122福建农林大学硕士学位论文植物药中检测黄曲霉毒素IAC-HPLC方法的研究
表1.1黄曲霉毒素的理化性质
Table1.1PhysicochemIAClpropertiesofafatoxinsAF的种类相对分子质量熔点比旋光度波长/nm摩尔吸收系数
B312268-269℃-558（C0.1%,氯仿）22322100
12651240036021800
B2314286-289℃-492（C0.1%,氯仿）222186002651210036224000
G1328244-246℃-556（C0.1%,氯仿）216274002429600265960026217700
G2330237-240℃-47（C0.084%,氯仿）214253002441050026590026219300
1.2毒性及危害
1988年,黄曲霉毒素已被WHO癌症研究机构划定为Ⅰ类致癌物,是一种毒
性极强的剧毒物质。
它是自然界中已经发现的理化性质最稳定的一类霉菌毒素
[6]
常见的几种黄曲霉毒素毒性从小到大排列为:
G、B、G、M和B,毒性及
22111
[7]
致瘤性最强的黄曲霉毒素B,其毒性是氰化钾的10倍,是砒霜的68倍,其致
癌力是奶油黄的900倍,比二甲基亚硝胺诱发肝癌的能力大75倍,比3,4-苯并
芘大4000倍。
正是由于黄曲霉毒素的双性（即强毒性,强致癌性）,其在动物
或人类健康临床表现上显示有很强的急性毒性,也有明显的慢性毒性。
黄曲霉毒
素的急性毒性见表1-2;
慢性毒性主要表现在动物的生长障碍和肝脏出现亚急性或
[8][9]
慢性损伤。
其中,出现生长障碍的原因是AFT能降低某些消化酶类活性使部
3福建农林大学硕士学位论文植物药中检测黄曲霉毒素IAC-HPLC方法的研究
分营养成分不能吸收,长期低剂量受到AFT污染将影响动物的生长发育。
它主要
诱使动物发生肝癌,也能诱发胃癌、肾癌、直肠癌及乳腺、卵巢、小肠等部位的
[10]
癌症。
另据研究表明,黄曲霉毒素的细胞毒素作用可干扰信息RNA和DNA的
合成,进而干扰细胞蛋白质的合成,导致动物全身性损害。
肝脏出现亚急性或慢
[11]
性损伤是由于AFB经消化道吸收后,积蓄在肝脏内,阻断RNA合成,从而减
低肝脏的合成功能进而侵害人及动物肝脏组织,引发肝实质坏死、胆管上皮增生、
[12]
肝脂肪浸润及肝出血等病变,严重时,可导致肝癌甚至死亡。
AFT对血液也有
毒性作用,导致贫血;
长期接触黄曲霉毒素还会影响胚胎发育时的凝血;
AFT
还会使小鼠骨髓细胞中PCE微核率显著增加,微核的形成与染色体损伤有关,甚
至导致基因突变,从而诱发肿瘤。
[1,8]
表1.2黄曲霉毒素的急性毒性即半数致死量
Table1.2Acutetoxicityofafatoxinstodi
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