基于浓缩计数的菌落总数超快测量新法与装置研究文档格式.docx
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≤
20
大肠菌群/（MPN/100mL）
3
霉菌和酵母/（CFU/mL）
不得检出
致病菌（沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌）
要对如此微小数量的物质进行测量，即便是精细的现代测试方法和设备均无法实现直接测量。
通过培养方式提高细菌比例，加以反向推演测算方式，间接获取被测液体的细菌含量是目前水质测量的原则和基本方法。
这导致现有测量方法和技术存在检测速度慢、操作复杂、无法在线实时检测、检测费用昂贵等问题。
目前，正常检测时间需耗时24~48小时，低于24小时的方法属于快速检测法，但均难以满足人民生活、工业生产和政府公共卫生管理的需要。
低于1小时的超快速细菌总数检测方法，对其研究以及相关测量装置的研制变得十分迫切。
思考：
目前细菌总数的快速测量普遍运用阻抗法。
该方法的实质在于：
对不同的细菌进行一定时间的培养，当CFU值达到阻抗法检测下限及之后，检测值出现明显变化。
计算检测起始时刻到发生明显变化所需时长，根据不同菌落生长规律计算式，可反向推出细菌总数初始值。
但是，多种类细菌存在时，各菌种所占比例的不同将影响阻抗法的精度。
图1不同倍增时间对样品检测时间的影响[6]
表2常见细菌的倍增时间／代时[6]
仔细分析，阻抗法存有两大缺陷：
1.需要培养。
这将导致一些列问题，如培养液选择、操作复杂、测试费用昂贵、无法在线直测等诸多问题；
2.测量时间长，需以百分钟计算。
上述缺陷触发了作者对新检测方法的研究。
详情如下：
本文首先总结了当代菌落总数测量原理与方法，针对饮用水的特点：
1、体量大，2、水分子直径为0.4纳米，细菌口径超过500纳米，远大于水分子直径，3、阻抗测量时需要将待测液体在培养液中培养较长时间，使细菌浓度达到一定CFU值方可检出等等，在市场调研基础上，提出了基于“浓缩计数”而非培养计数的新方法，即基于微滤网聚束细菌，免除培养时间的超快速菌落总数电测方法。
在新方法指导下，设计了一款在线式测量装置、一款手动式廉价快速测量装置；
2、当代菌落总数测量原理与方法[6]
目前已报道的微生物检测方法有很多，但国际上普遍认可的标准方法是传统的培养计数法，其它新技术正逐渐发展与完善中。
上文介绍的阻抗法即属“培养计数法”的分支。
1996年Hobson等将微生物检测技术分为生物电化学和非生物电化学两大类。
前者包括阻抗，电导法、电势测定法、燃料电池技术、循环/方波伏安法、电流分析法等检测由微生物引起的电极间电荷转移信号的一类方法。
后者包括干重、活菌计数和浊度等传统方法，还包括一些特殊技术，如：
微量热法、荧光．抗体技术、辐射测量法、生物发光法、压电薄膜法等等，以及检测核酸、蛋白质、脂类衍生物、碳/磷酸盐、新陈代谢酶等细胞成分的方法。
2000年Ivnitski等又将细菌检测技术分为：
培养计数法、显微镜观察计数法等一般方法；
用压电晶体、阻抗仪、氧化还原反应、光学技术、量热法、超声波技术等检测物理量的方法；
检测ATP（生物发光）、DNA、蛋白质、脂类衍生物（生物化学方法）、放射性同位素（辐射度量学）等细胞成分的方法。
2003年Aloci|ja和Radke分析了美国国内致病菌检测技术的市场前景。
2004年Deisingh和Thompson将检测传染性细菌的生物传感器，划分成：
电化学方法、高频生物传感器（如压电晶体、表面超声技术SAW、石英晶体微天平QCM、表面等离子体共振SPR等）、光学生物传感器、电子鼻等四类。
2005年Noble和Weisberg对适用于海滨浴场水质分析的细菌快速检测方法进行了归纳，这些方法的特点是能在1小时内完成检测。
根据各部分的目的，整个过程一般包括：
捕捉目标菌和定量检测两步，此外为提高检测限，往往还先有一个预培养增菌过程。
目标菌的捕捉可有三类方法：
①单细胞识别，如用免疫测定技术、特殊分子探针；
②核酸方法，如聚合酶链式反应PCR、定量PCR、NASBA：
③酶/底物方法。
最后的检测过程可利用光学、电化学或压电等原理实现。
除上述基本方法外，文献重点分析了一些利用多种技术结合的具有实用前景的方法，如：
双波长荧光测定法、免疫测定法、基于PCR技术的方法。
2007年Lazcka等分析总结了致病菌检测技术应用的现状与趋势，根据认知普遍性的高低，主要划分为PCR技术、培养与菌落计数法、ELISA技术、生物传感器、电泳技术等几大类。
其中生物传感器按信号转换原理又有光学、电化学、压电等不同类型。
3、基于微滤网的超快速菌落总数测量方法
相关资料研究表明，目前最有效率的检测方法为阻抗法。
阻抗测量法应用于微生物检测时，需要一段较长的培养增菌过程，以使培养基和电极间发生显著的性质变化。
原因在于：
用阻抗法检测下限为103CFU，依据国标合格的饮用水细菌含量小于20CFU/mL。
这样，需要通过检测得出细菌生长曲线和阻抗变化曲线的关系，以此来判断样本初始数据，确认水质安全。
增菌需要非常长的时间。
最新研究表明[7]，若将阻抗测量与微电极技术、介电泳技术结合，将细菌聚集起来，缩小测量范围，则可以使仪器的响应得到数十倍的提高，从而省去费时的增菌过程，实现超快速检测。
但微电极技术、免疫学方法或介电泳技术都过于繁琐，不适合。
如何聚集细菌便成为了研究的突破口。
换一个角度，将细菌聚集起来，也就是将细菌与水分离。
若将细菌与水分离，达到阻抗检测设备的测试下限，是再好不过的。
过滤为最基本的固液分离法。
经过调查知道，水分子的直径为0.4nm，一般细菌的直径约在0.5~5μm之间，最小的有0.2μm，远大于水分子。
也就是说超细孔过滤网可以轻而易举地将大部分细菌与水分离，由此可实现细菌浓度较高的测试液，不再需要增菌过程，方便极快速的直接检测。
例如，有100mL的测试液，通过过滤，得到1ml浓缩滤液，若测得其细菌总数为2000CFU/mL，则可方便地计算出测试液的细菌总数为20CFU/mL。
据市场调查，高级的直饮水机已将HEPA超细微滤网投入使用，以隔离细菌，如图2所示。
而滤网的成本远低于现有阻抗法中培养器皿及相关温控装置的费用，同时解决了当前阻抗法在线测试、测量时长、复杂操作、测试成本高等问题。
图2AJESJL-UF-05超滤直饮水机及其制水流成示意图
总之，基于微滤网测试技术：
在待测液体体量较大条件下，在1到数毫升的液体中聚束住待测液中的所有细菌，达到现代精密电桥能够测量的细菌总数临界值，根据达到临界值所需的液体体积，反算出单位体积中液体的含菌数，即每毫升CFU值。
以体量换时间，在被测液体体量交大的前提下，文章提出的思路有其合理性。
4、基于微滤网的菌落总数测量装置设计及关键件验证
4.1基于微滤网的直饮水系统在线菌落总数测量装置设计
微滤网技术是现代直饮水系统中常用，得到证实了的细菌隔离技术，将其引入本方法中，可实现在线超快速直接检测。
装置如图3虚线框所示，由入水管、出水管、拍污管、排污管阀、微滤网、测试电极对、流量阀等八部分组成。
其中：
1.管内水压需保持0.1~0.4MPa之间；
2.微滤网每目口径<
0.2微米;
3.管、阀均采用卫生防菌材料制成，最好采用透明石英材料制成；
4.
注意弯管以及电极引出端的密封，以防水喷出
图3基于微滤网的直饮水系统在线菌落总数测量装置
4.2基于微滤网的液体菌落总数非在线廉价测量装置
用于普通液体检测时，可用人工代替引水泵，利用近年来新开发成功的的可水洗HEPA滤网，可大量节约测试费用；
当待测液体体量较大时，可提高单位体积重的菌落总数，以此提高测试设备（如电桥）的临界值，降低对设备的要求，从而降低系统造价。
设计的非在线装置如图4所示，由带刻度的石英腔筒、如水管、止水夹、压力活塞、HEPA微滤网、测量电极对等6部分组成。
1、石英腔筒和压力活塞参照玻璃针筒为原型设计实现；
2、制造时，止水夹、HEPA微滤网均要具备承受0.1~0.4MPa压力差的能力。
图4基于微滤网的液体菌落总数非在线廉价测量装置
通过上述设计，结合阻抗测量装置，一款超快速、成本低廉、使用灵活方便的菌落总数测量新方法及相关装置得以诞生。
4.3验证1：
阻抗测量设备可行性验证
实验前，准备了两台不同水准的LCRMeter（图6）。
一台为TH2826LCRMeter（20Hz～5MHz），另一台为INSTEKLCR-819。
验证系统如图5所示。
验证中，首先用高水准的TH2826的测试探头夹住用胶布固定在盛水器皿中的电极（利用金属回形针制成，图7）进行试验，测得空气、不同体量水质在不同频率f下的Cp（pF）和Q值。
期待测量值有明显变化。
图5实验仪器总览
图6实验用的两台LCRMeter
图7盛水器皿及测试电极
表3实验数据
序号
1
2
4
5
6
7
材料
空气
水（200mL）
水（400mL）
水（600mL）
Cp（pF）
0.015
0.009
0.4
23
49.5
8.88
6.81
Q
1.15
1.5
0.005
0.115
0.254
0.29
0.57
F（kHz）
4000
3000
100
1000
8
9
10
水（600mL）+饼干屑（0.6g）
25.7
9.26
8.335
0.058
0.194
0.515
实验数据分析：
测试数据如表3所示。
对数据进行分析，可知：
1、水体的多少对电极间电容有明显影响。
2、电容C随频率f的变化而变化，频率f越大，电容越小。
3、水体中的溶解物对电容有明显的影响。
分析结论：
上述测试系统能用于实验系统的阻抗.测量。
4.4验证2：
过滤设备的可行性研究
在本研究中，过滤网是创新，也就是研究的基础、关键。
图8伊莱克斯HEPA12级可水洗滤网
为验证其可行性，购买了伊莱克斯HEPA12级可水洗滤网（图8），可对0.1微米及0.3微米微粒有效过滤。
本研究关键在其可过滤的基础上，检验原样、滤后残液、滤液电阻值是否有明显变化，来判断新方案是否有可行性。
两台测试设备的探头做了如图9、图10的处理，以便固定极间距离和两电极的相对位置，保持极间媒质不变时，极间电容值的恒定。
图9TH2826LCRMeter（20Hz～5MHz）和捆绑固定的电极
图10INSTEKLCR-819和捆绑固定的电极
实测中发现，简单使用过滤网，直接将测试液倾倒在滤网上，液体无法通过滤网。
通过破坏性试验，如图11所示，发现0.2微米的滤网液体无法轻易通过。
在增加液体高度并辅之以人工加压情况下，液体可通过滤网。
图11被破坏的HEPA12级可水洗滤网
分析、结论：
必须通过人力加压或机械加压，方可实现微滤网对液体的浓缩。
这证实了本文设计方案中，不论是在线式方案还是人工操作的测试方案，加入机械增压泵或人工压阀的必要性。
5、后续工作方案
后续工作分5部分陆续展开，分别是：
在线式测量装置的研制，
离线式测量装置研制，
标准化数据的获取，
比较定标，
专利申请。
其中，第3、4两步需要多次反复，直至达标。
5.1基于微滤网的直饮水系统在线菌落总数测量装置研制
选择直饮水机；
购买实验用品：
排污阀、微滤网、石英玻璃管，必要时，购买流量阀；
安装焊接。
注意：
玻璃弯管弧度、粗细，
测试电极的材料、形状
5.2基于微滤网的液体菌落总数非在线廉价测量装置研制
排污阀、微滤网、玻璃针筒、石英玻璃管；
考虑：
过滤后水的处理
5.3送检（标准化数据获取）
使用自己研制的装置对特定的水进行实验，并做好实验记录；
同等水样送到国家认可的检测单位进行检测。
5.4比较定标
比较两者实验数据，判断装置检测准确性；
若实验结果误差大于±
5％，还需进一步改进。
并重返上一步反复实验改进。
5.5发明专利申请
“基于浓缩计数思想的菌落总数超快速测量方法与装置”撰写与申请。
6、总结
目前，阻抗法有两大缺陷：
培养时就会有培养液选择、费工、操作复杂、测试费用昂贵、无法在线直测等诸多问题；
这两点触发了作者对新检测方法的研究。
细菌总数的快速测量普遍运用阻抗法。
对不同的细菌进行一定时间的培养，当CFU值达到阻抗法检测下限及之后，检测值出现明显变化，计算检测起始时刻到发生明显变化所需时长，根据不同菌落生长规律计算式，可反推细菌总数初始值。
但是，多种类细菌存在时，各菌种所占比例的不同将导致这种方法的实现精度值得商榷。
本文提出了基于“浓缩计数”而非培养计数的新方法，即基于微滤网聚束细菌，免除培养时间的超快速菌落总数电测方法。
基于微滤网测试技术：
本文在新原理指导下，完成了两款新检测装置设计方案。
一、基于微滤网的直饮水系统在线菌落总数测量装置。
二、基于微滤网的液体菌落总数非在线廉价测量装置。
用于普通液体检测时，可用人工代替引水泵，利用这些年开发的可水洗HEPA滤网，大量节约费用；
当测量液体体量适当加大，可提高菌落总数，提高电桥可测的临界值，降低对电桥的要求，进一步降低系统造价。
新原理的提出，测试装置的初步设计完成，初级实验的验证，都为今后超快速测量方法和装置的实现奠定了基础，指出了良好的发展方向。
参考文献
1、深产12种饮用水不合格细菌超标高达600倍，中国质量新闻网，2007年8月2日。
2、“超级细菌”入侵印度饮用水，浙江日报，2011年5月7日。
3、肯德基冰块细菌超标40倍卫生状况令人堪忧，光明网，2013年6月21日。
4、临沂半数农村饮用水水样细菌超标，中国水网，2013年7月12日。
5、瓶（桶）装饮用纯净水卫生标准GB17324-2003，中国标准化管理委员会，2003年。
6、胡珂文，细菌总数快速检测方法与装置研究，浙江大学硕士学位论文，2008年。
7、BlancaH.Lapizco-Encinas,Insulator-baseddielectrophoresisfortheselectiveconcentrationandseparationoflivebacteriainwater,Electrophoresis,Vol.25,2004,p.p.1695-1704.
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