度工作计划完善.docx

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度工作计划完善

2013年度工作计划

根据目前治疗用（合成肽）乙型肝炎疫苗工艺中存在的问题，以及避免由于研发项目单一带来的风险，生物研究中心将在2013年开展如下工作：

①解决多肽合成和纯化工艺环节中存在的问题，制备εPA44标准品，并建立相应检测方法；②提高脂质体载药量及相关工艺研究；③抗肿瘤药物的可行性研究与立项；④完善规章制度、建立验证方案、进行学术交流与培训。

具体包括以下方面：

1.多肽合成与纯化须解决的主要技术难点[合成组、纯化组]

⑴提高多肽合成偶联率和逐步进行合成规模放大

①提高多肽合成偶联率[合成组，1季度]

使用200-400mesh的树脂，有助于偶联溶液更好地扩散到树脂的孔隙内，增加偶联完全的机率。

每偶联一个氨基酸都取样进行茚三酮检测，确定偶联是否完全，再决定是否需要双偶联或封闭。

同时比较不同的合成方法，对最终合成结果的影响，找到最优的合成方法。

在上述基础上先合成某些短肽，检测合成的纯度能否符合要求，如合成的短肽纯度较好，工艺也稳定后，即可按0.25mmol规模进行εPA44合成，以便纯化后制备标准品。

②逐步进行合成规模放大[合成组，3-4季度]

0.25mmol规模合成εPA44的纯度达到制备标准品的要求后，再按照0.5mmol、1mmol、1.5mmol、2mmol逐步放大合成规模。

在放大到1mmol规模前，需加工体积为200ml、两端不锈钢烧结片孔径为10微米的合成反应器。

⑵提高反相纯化后εPA44的纯度[纯化组，1-4月]

做到εPA44纯化后纯度在98%以上，收集量足够制备200支标准品，并进行纯化放大实验，需开展如下工作：

①改善采用泵进样方式对高度纯化的不利影响[陈阶、赵高梅]

公司现有ÄKTApilot层析系统采用样品泵进样（多用于制备层析系统，便于生产规模放大），样品进入泵腔后容易造成柱外扩散，尤其是黏度较大的样品对产物的分离纯化影响较大。

故，利用ÄKTApilot层析系统样品泵进样及采用样品环进样这两种模式进行比较实验，比较纯化的结果。

②选择较适合的流动相及流速[吴飞鸽、赵高梅]

观察比较不同的流动相（不同浓度的乙醇溶液，酸化的磷酸乙醇溶液及没有进行酸化的磷酸乙醇溶液）及流速（在仪器及柱压许可前提下和线性流速为5cm/min-20cm/min范围内找到最适合的流速），对高度纯化效果的影响，选择较适合的流动相及流速，使不利影响降到最低程度。

⑶纯化规模放大[陈阶吴飞鸽，5-12月]

用PILOT仪器进行逐步反相纯化放大实验：

①完善500mlporos50柱子在pilot仪器上的纯化工艺，主要对上样方式、进样量、上样流速、流动相种类及温度、洗脱流速等参数进行优化。

②用1000ml不锈钢柱子对上述参数进行探索性纯化工艺研究。

③用5000ml不锈钢柱子对上述参数进行探索性纯化工艺研究。

2.无菌制备εＰＡ４４原液及浓缩液[纯化组，5月]

①用于高度纯化的洗脱液的除菌过滤及储存

②高度纯化制备柱及层析系统的清洗和消毒

③高度纯化的进样、分离产物的收集及储存

④原液超滤浓缩系统的清洗和消毒

⑤εＰＡ４４原液的超滤浓缩

3.制备εＰＡ４４标准品、对照品和参考品[纯化组、制剂组，5-6月]

①εＰＡ４４含量测定标准品的制备

②εＰＡ４４理化对照品的制备

③εＰＡ４４原液含量参考品的制备

4.建立和完善部分质量检测方法[质检组，2-3季度]

⑴原液的检测方法[2-3季度]

①原液εＰＡ４４含量（RP-HPLC法）（需建立）[任昌琼]

②原液εＰＡ４４的纯度测定（RP-HPLC法）（需完善）[任昌琼]

③εＰＡ４４的紫外吸收光谱（需完善）[石欣欣]

④εＰＡ４４原液的内毒素含量（需完善）[刘芳]

⑤原液εＰＡ４４含量（ELISA法）（需建立）[刘芳]

⑥εＰＡ４４等电点的测定（需建立）[石欣欣]

⑦εＰＡ４４的肽图分析（需建立）[肖龙文]

⑧原液二甲基亚砜残留量（GC法）（需完善）[任昌琼]

⑨原液Ｎ-甲基吡咯烷酮残留量（GC法）（需完善）[任昌琼]

⑵半成品的检测方法[3-4季度]

①εＰＡ４４脂质体包封率（RP-HPLC法）（需建立）[任昌琼]

②εＰＡ４４半成品的无菌试验（需完善）[肖龙文]

③εＰＡ４４半成品的内毒素含量（需完善）[刘芳]

⑶成品的检测方法[3-4季度]

①εＰＡ４４成品的外观（需完善）[肖龙文]

②成品εＰＡ４４脂质体的突释效应（需建立）[刘芳]

③εＰＡ４４成品的pH值检测（需完善）[刘芳]

④εＰＡ４４成品的水分测定（卡尔费休水分测定法）（需建立）[任昌琼]

⑤成品εＰＡ４４含量（RP-HPLC法）（需建立）[任昌琼]

⑥εＰＡ４４成品的无菌试验（需完善）[肖龙文]

⑦εＰＡ４４成品的内毒素含量（凝胶法）（需完善）[刘芳]

⑧εＰＡ４４成品的悬浮时间（需建立）[肖龙文]

⑨成品εＰＡ４４脂质体粒径及分布（需建立）[刘芳]

⑩εＰＡ４４成品的丙二醛含量（需建立）[肖龙文]

⑪成品εＰＡ４４含量（ELISA法）（需建立）[刘芳]

5.需委托其它单位的检测方法

原液的检测方法[任昌琼，2-3季度]

①原液：

εＰＡ４４分子量的测定

②εＰＡ４４的N末端氨基酸序列分析

6．脂质体制备新方法的研究准备（1季度）

根据今年下半年调研的国内外文献所报道脂质体的不同制备方法，我们确定了逆向蒸发法、注入法、薄膜分散法，为新项目的立项做好准备。

考虑到可以用单一方法制备，也可以结合不同的方法制备，以保证新项目按期开展，我们确定了需要采购的相关仪器设备及原料：

1购买的仪器设备：

旋转蒸发仪1台[吴飞鸽]、超声波破碎仪1台[赵高梅]、脂质体挤出器1台[陈阶]、高速分散器1台[陈阶]，购买之后进行培训学习、调试及维护。

②根据文献报道，长循环脂质体在体内能阻止吞噬细胞对脂质体的识别和摄取，延长脂质体在血液中的循环时间，从而可以显著提高疗效并减少不良反应的发生。

因此，对于新项目的开发我们可以制备成普通脂质体，也可以考虑制备成长循环脂质体，两方面准备，拟采购以下原料[刘萍]：

大豆磷脂、氢化大豆磷脂、DPPC（二棕榈酰磷脂酰胆碱）DPPG（二棕榈酰磷脂酰甘油）、胆固醇、PEG（聚乙二醇）、二硬酯酰磷脂酰乙醇胺聚乙二醇化磷脂、二硬酯酰磷脂酰甘油（DSPG）、肉豆蔻酰溶血磷脂酰胆碱（MSPC）、透明质酸、维生素E、BHA（丁基羟基茴香醚）、甘露醇、菊粉、海藻糖。

7.提高脂质体对εPA44的包载量[王利锋、袁蒿、刘萍]

目前临床上治疗用（合成肽）乙型肝炎疫苗用药为每次三支，为减轻患者给药时的痛苦，在现有工艺的基础上，研究脂质体在体积不变的情况下，εPA44的含量进一步提高，主要工作包括以下内容：

⑴对目前生产工艺中脂质体包封率的研究[4-5月]

由于目前生产工艺只有脂质体浓缩后收率的实验数据，而εPA44脂质体包封率的实验数据还不完善，我们要研究脂质体的载药量，首先要按照目前的生产工艺制备小批量的εPA44脂质体制剂，分别在εPA44原液浓缩后、εPA44脂质体浓缩后和脂质体冻干后取样，使用RP-HPLC法检测εPA44的含量，依据脂质体中药物总量、脂质体中包封的药物量和药物载体的总量，分别计算出脂质体浓缩后的包封率和脂质体冻干后的包封率，并对其进行研究，为进一步实验提供数据指导。

⑵调整脂质体配方中主要原辅料的成份和比例关系[3-4季度]

根据脂质体浓缩后所测得的包封率和粒径的情况，结合目前的研究资料，我们将从以下几个方面来进行研究：

①类脂的种类及用量对脂质体包封率有重要影响。

目前文献报道，氢化大豆磷脂的抗氧化能力及稳定性强于大豆磷脂，而且冻干后脂质体中药物的泄漏率低；因此我们将对大豆磷脂和氢化大豆磷脂进行对比实验，比较它们对脂质体包封率和粒径的影响情况。

另外考察脂质体制备配方中磷脂和胆固醇的比例对包封率和粒径的影响。

②考察脂质体配方中药物与类脂的比例对包封率和粒径的影响。

③有文献报道，PEG对药物有吸附作用，在配方中添加PEG提高脂质体载药量。

⑶调整脂质体冻干工艺[3-4季度]

①考察不同冻干保护剂的种类和浓度对脂质体冻干前后包封率和平均粒径的影响，如：

蔗糖、甘露醇、海藻糖、甘氨酸、白蛋白等。

②考察冻干工艺对脂质体冻干前后包封率和平均粒径的影响，如：

预冻时间、预冻速度、预冻温度、以及干燥温度和干燥时间等。

7.补充和完善相关规程和记录

①细化并完善乙肝疫苗纯化工作的操作规程和记录[纯化组、质保组，2-3季度]

乙肝疫苗纯化工作的复杂性决定了其仪器操作的标准化和规范化的难度，在纯化工艺稳定后，需重点建立PILOT仪器的相关操作规程和记录。

②建立εＰＡ４４标准品、对照品和参考品制备及检定的相关操作规程和记录[纯化组、制剂组、质检组、质保组、清洗准备组，2-3季度]

随着εＰＡ４４标准品、对照品和参考品制备及检定工作的开展，逐步建立起适用的各项操作规程、记录和标准。

8.成立验证小组，并在现有条件下，确定系统验证的主要框架和验证主计划，组织拟定如下验证方案：

[质保组，3-4季度]

⑴注射用水循环系统现有消毒方法的验证方案，监控项目为pH值、微生物限度、细菌内毒素。

[公共设备组、质检组、质保组]

⑵空调系统灭菌方法的验证方案，监控项目为沉降菌。

[公共设备组、质检组、质保组]

⑶纯蒸汽灭菌柜灭菌方法验证方案，监控项目为微生物限度。

[公共设备组、质检组、质保组]

⑷无菌工作服清洗灭菌消毒方法验证方案，监控项目为微生物限度、细菌内毒素。

[清洗准备组、质检组、质保组]

⑸器具清洗方法验证方案，监控项目为pH、微生物限度、细菌内毒素。

[清洗准备组、质检组、质保组]

9.进行靶向抗肿瘤药物的可行性研究和立项

在发达国家癌症是导致死亡的头号杀手，在发展中国家癌症是死亡率仅次于心血管疾病的二号杀手，已上市的抗肿瘤药因缺乏靶向，副作用往往很大，因此研究靶向抗肿瘤药物将具有很好的市场前景。

肿瘤的生长和迁移依赖于血管的形成，通过抑制血管新生可有效阻断肿瘤的营养供给，阻止肿瘤的生长和迁移。

肿瘤血管内皮细胞遗传稳定，不像肿瘤细胞容易发生变异，因此可作为肿瘤治疗的靶向，主要可选靶标包括血管内皮生长因子（VEGF）、整合素、氨肽酶N等等，均已被证实在肿瘤发生部位能高表达，而在正常组织或器官则表达量极低甚至不表达。

利用这些靶标设计其相应的靶向短肽，与已上市的抗肿瘤药直接键合或者制备成靶向脂质体，可引导药物集中在肿瘤部位，提高药物局部浓度，减少用药剂量，降低副作用。

靶向短肽分子量小，不易在体内产生抗体，经过适当的修饰可增强与靶标分子的结合作用。

根据现有的文献和专利报道，选定结合作用较强的1-2种靶标序列，并作适当的修饰；同时选定1-2种疏水性强、疗效好的抗肿瘤药，进行试探性试验，包括：

⑴合成靶向序列，并与抗肿瘤药化学偶联（或者制备靶向脂质体抗肿瘤药物）

1根据设计的靶向序列以及需要偶联的抗肿瘤药，提交采购计划；[合成组，1季度]

2选择合适的试剂和合成方法进行合成；[合成组，2季度]

3优化合成条件，提高合成产物的纯度和收率；[合成组，2季度]

4纯化合成产物，制备制剂。

[纯化组、制剂组，2-4季度]

⑵靶向肽或靶向抗肿瘤药物理化学性质的测定[任昌琼，2-4季度]

建立紫外吸收光谱测定方法。

建立纯度（RP-HPLC法）测定方法。

建立含量（RP-HPLC法）测定方法。

⑶靶向抗肿瘤药物药效评价[刘芳，3-4季度]

建立抗肿瘤药物对血管抑制作用效果的评价的方法（鸡胚尿囊膜实验）；

建立抗肿瘤药物对肿瘤细胞生长抑制作用效果的评价方法（MTT法检测）；

建立抗肿瘤药物体外细胞侵袭实验方法（人工基底膜实验）；

建立抗肿瘤药物体外细胞迁移实验方法。

根据上述药效评价结果，完成可行性研究报告，按照项目立项流程申请立项审批。

10.长循环脂质体抗肿瘤仿制药的可行性研究和立项

抗肿瘤仿制药仅涉及改变剂型，研发周期短，实现效益快。

通过查找已经上市的抗肿瘤药，挑选给药途径不够理想、可制备成脂质体的品种，降低药物的剂量，减少副作用。

根据现有的文献和专利报道，选定1-2种疏水性抗肿瘤药，制备成长循环脂质体，进行试探性试验，包括：

⑴开展长循环脂质体的体内稳定性检测实验，主要分以下两个方面开展：

①体外稳定性检测[吴飞鸽、任昌琼，2-3季度]

将长循环脂质体、载药长循环脂质体、长循环脂质体药物混合物、游离药物为考察对象在体外做稳定性检测实验，规定时间内检测在不同溶液中的稳定性，主要用高效液相法检测药物含量，粒径大小及分布、zeta电位、磷脂氧化值、包封量等参数的变化。

②体内稳定性检测[任昌琼，3-4季度]

将长循环脂质体、载药长循环脂质体、长循环脂质体药物混合物、游离药物为考察对象以一定浓度分别注射于不同动物体内，规定时间内取动物血液用高效液相法检测药物含量，和粒径大小及分布、zeta电位、磷脂氧化值、包封量等参数的变化，从而判断载药长循环脂质体的体内稳定性。

⑵脂质体体外性质评价[任昌琼，2-4季度]

1脂质体的粒径和外部形态

2脂质体的包封率和载药量的测定

3脂质体的无菌试验

4脂质体的水分测定

5脂质体的悬浮时间测定

6脂质体的内毒素测定

7脂质体的丙二醛请含量测定

⑶脂质体抗肿瘤药物药效评价[任昌琼，2-4季度]

①建立脂质体抗肿瘤药物对肿瘤细胞生长抑制作用效果的评价方法（MTT法检测）；

②建立脂质体抗肿瘤药物体外细胞侵袭实验方法（人工基底膜实验）；

③建立脂质体抗肿瘤药物体外细胞迁移实验方法。

根据上述药效评价结果，完成可行性研究报告，按照项目立项流程申请立项审批。

11.人员招聘（社会招聘，网上筛选，合适即通知面试或网上面试）

纯化组组员2人，质检组组员2人，制剂组组员1人。

12.制定和完善规章制度[生物中心，1季度]

⑴逐步完善立项制度

⑵关于各类人员专业培训的实施与考核方法

⑶消防及安全管理制度

13.仪器、设备维护保养[仪器负责人，按说明书进行]

1多肽合成仪的维护、保养

2层析系统explorer100和pilot的维护、保养

3液相色谱仪的维护、保养

4冻干机minifast和lyofast维护、保养

5纳米粒度仪NANOPHOX和微米激光粒度仪HELOS-CUVETTE维护、保养

6电子分析天平的维护、保养

7倒置显微镜的维护、保养

8脂质体制备系统的维护、保养

9超滤系统的维护、保养

10灌装压塞轧盖机的维护、保养

11公用系统的维护、保养

14.学术交流与培训

⑴学术交流与技术讲座

1脂质体制备技术难点[1季度]

2靶向抗肿瘤药物的进展和前景[2季度]

3反相纯化工艺放大需要的关键技术难点[3季度]

⑵按照工作需要开展相关的培训

1GE年度纯化技术交流会[3季度]

22次以上质量体系建立、系统验证及厂房改造实例分析相关方面培训[2-3季度]

3缓控释制剂工艺和质量的技术研究[4季度]

4无菌制剂的技术交流会[2季度]

5细胞培养相关技术[3季度]

6新药药代动力学研究[4季度]

15.调研与购买部分仪器和设备[1季度]

⑴紫外分光光度计1台[刘芳]

⑵灭菌器1个[刘芳]

⑶制冰机1台[肖龙文]

⑷超净台1台[肖龙文]

⑸孵化箱1个[肖龙文]

⑹液氮罐2个[任昌琼]

⑺冰箱1台[任昌琼]

⑻照相机1台[吴飞鸽]

⑼台式离心机1台[任昌琼]

⑽温度测量仪1台[王利锋]

⑾旋转蒸发仪1台[吴飞鸽]

⑿超声波破碎仪1台[赵高梅]

⒀脂质体挤出器1台[陈阶]

⒁高速分散器1台[陈阶]

⒂电脑2台[吴飞鸽]

16.进一步完善质量管理体系[2-3季度]

结合本中心的2012年质量管理系统的运作情况，对现有体系中存在的漏洞进行分析，逐步对其进行完善，并适当拓宽体系的管理范围，以满足中心后续工作的需求。

17.2014年工作计划和预算[生物中心，6-7月]

各组根据上半年的工作进展以及对下半年工作进度的预估，做好2014年的工作计划，经生物中心汇总研究后，整理完整，并提交预算。

18.半年总结和年度总结[生物中心，6月与12月]

各组根据上半年（6月）和全年（12月）的工作进度以及存在的问题进行总结分析，汇总到生物中心整理成稿，提交至公司。

生物研究中心

2012年9月21日