高考热点基因工程和新冠病毒研究涉及的生物技术.docx

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高考热点基因工程和新冠病毒研究涉及的生物技术

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基因工程和新冠病毒研究涉及的生物技术

知己知彼百战不殆，想要彻底战胜新冠病毒必须要对它们有足够的了解。

近期不少研究认为，病毒表面的S蛋白（刺突蛋白）能够和人体细胞表面的ACE-2受体结合，从而诱骗人体细胞把它们吞进去。

之后，病毒内的遗传物质RNA被释放，这些RNA会用我们的核糖体合成蛋白质水解酶和RNA依赖的RNA聚合酶（RdRP）等。

在这些酶的帮助下，我们的细胞被奴役，大量复制病毒的RNA和蛋白质，并在细胞内完成组装。

之后这些病毒被释放，侵染我们身体内的其他正常细胞。

试想，如果我们能选择性地阻断这个过程，比如使用药物让病毒的RdRP无效（下图红叉处）。

这是SARS的感染通路，新冠病毒也差不多

这样，病毒就无法走完正常感染的路。

事实上，瑞德西韦（Remdesivir）就是专门针对RdRq这个靶点的药物。

瑞德西韦-WHO评价

它可以被RdRq识别，并作为底物参与病毒RNA链的合成。

一颗老鼠屎搅了一锅汤，掺入瑞德西韦之后，其他核苷酸连不上RNA链，病毒RNA自我复制被迫终止，自然也难以继续组装并感染其他细胞。

这个机理的关键就是瑞德西韦要能被RdRq识别，并连入正在合成的RNA链，本着材料学中“结构决定性质”的思想，可以说，正是因为RdRq蛋白和瑞德西韦结构匹配，才被认为是具有潜力的特效药进入临床实验。

解析病毒蛋白结构的三种方法

因此，如果在开发特效药时能提前获知靶点的蛋白结构，很有可能为药物的设计和筛选提供巨大的帮助。

也可以在病毒入侵前就拦截，同样需要获知各种结构以及探索相互作用

这个过程中，需要大量病毒自身以及我们细胞内的蛋白以供研究，比如解析结构，探索相互作用等，那么这些蛋白如何获取呢？

两条路

一是天然蛋白，二是重组蛋白。

对于天然蛋白，字面意思，想办法直接从病毒中分离并提纯我们所需的蛋白。

首先，这种病原体不是随便找个实验室就有操作资格，搞不好就是生化危机。

另外，在具体实验中，由于分离纯化工艺繁琐、产率低和成本高等缺陷，除了个别场合，这个方法基本已脱离实验室研究。

实验室中常用的是重组蛋白，比如上面的合成人胰岛素、最近解析新冠病毒S蛋白的几项研究中使用的都是这类。

重组蛋白的产生是应用了重组DNA或重组RNA的技术从而获得的蛋白质，说白了就是转基因技术的产物。

这种蛋白的生产主要分为以下几步：

很关键的一张图，建议保存或者收藏

步骤

∙目标基因的获取

蛋白质是靠生化反应合成的，而指导到底合成哪种蛋白的是DNA和RNA。

考虑到“转”基因一般转的都是DNA，在明确需要哪种蛋白后，我们首先应该获得这种蛋白对应的DNA序列，此处称其为目标基因。

如果不记得DNA、RNA和蛋白质的关系建议先查一下

有两种思路：

一是分离，二是合成。

分离是指直接从新冠病毒中分离RNA序列，然后逆转录成DNA。

这个过程也是因为比较麻烦，获取产物纯度可能不理想，所以应用场合很受限。

比如我们发现一种新病毒，不知道具体DNA或RNA序列，只能先纯化然后测序。

大部分情况，基本都是考虑从头合成目标基因。

思路就是在数据库（比如GenBank）查询并确定序列后，联系生物公司请他们帮忙合成，简单粗暴。

比如我们要合成S蛋白（新冠病毒的武器之一），那么就先在数据库查S蛋白的DNA序列，然后设计一段引物（primer）序列，并添加在目标基因上。

在引物序列以及引物的辅助下，DNA聚合酶才能协助复制目标基因，之后体外扩增，这样方便了合成后的基因大量制备。

所以说，最终从生物公司买到的DNA序列是目标基因＋引物序列（后文称两者之和为目的基因）。

走到这，就算完成转基因中的“基因”二字，接下来“转”！

∙载体和宿主的制备

既然目标是大量制造某种蛋白，而且已经选好目的基因了，那么就得找个生物转进去，然后“奴役”它为我们生产。

直接用哺乳动物或者其他大型动物略显残忍，所以实际工作中一般选用酵母菌、昆虫或者细菌这些生物当作基因的宿主，有时候也会用人体内分离出的细胞，这些生物就是宿主。

这个选择也要本着方便快捷经济的原则。

有了宿主之后，就得想办法把基因转进去。

比较容易想的是显微注射，但是这个方法不适合批量操作。

仅仅把目的基因和细胞混合估计也不行，因为细胞膜有一层比较稳定的磷脂双分子层，一串DNA不容易潜入。

那咋办？

生活经验告诉我们，如果小孩儿不爱吃X，但是爱吃糖，为了让他吃X，可以把它用甜的东西把X包起来，到时候他就乐乐呵呵张嘴任人宰割了。

对应于生物实验，可以用带正电荷的物质，比如钙离子或者聚酰亚胺（PEI）把基因包起来，因为细胞膜带负电荷，异性相吸，这些物质会和胞膜结合，然后被细胞内吞进去。

国际上最早报导新冠病毒S蛋白空间结构的McLellan课题组，他们使用的就是PEI转染人类的293F细胞。

除了骗小孩，还可以直接把他们的嘴暴力撑开，然后借着重力把饭往里倒。

对应生物实验，可以给细胞通电，或者瞬时加热（钙离子辅助）让他们进入感受态（competence），细胞膜此时会被迫开一些洞把目的基因放进去。

总之，经过这一步，转基因三个字基本完成了，我们获得了含有目的基因的宿主。

人多力量大，想让宿主大量表达目的基因，就得想办法让它们繁衍（类比某些政客一边鼓吹996，一边鼓励找对象），最好他们的后代也能给我产蛋白。

左下图是质粒具体复制过程

但是裸DNA在细胞内难以自我复制，宿主细胞一顿复制结果目的基因数量几乎不变，所以一般会把目的基因用酶连接到质粒（plasmid）上，质粒可以当成一段环形的DNA，它们可以在细胞内完成自我复制。

另外，在质粒上还可以插入一些特定的标签（tag），这些标签能帮助我们筛选哪些细胞是含有质粒的（能产蛋白）。

这就像HR一般不会明着问面试者接不接受996，而是侧面看看他有没有“远大的志向”。

比如下面这种质粒，如果大肠杆菌里没有这种质粒，那么就无法抵抗外来的氨苄青霉素，自然会被淘汰掉，生物学家这么做是为了方便后续生产。

对于公司，不接受996，无法给企业带来“福报”，留着干嘛。

从这张图还可以看出，实际应用的质粒是很复杂的

总之，现代生物工程中会采用各种办法把负载有目的基因的质粒导入宿主。

∙诱导表达

转基因三个字完成了，接下来就是让宿主乖乖把目的基因表达出来，生产足够多的蛋白。

这个过程经常也会被人为控制，比如故意让细胞在增殖到一定数量后再开启合成蛋白。

原因是，基因的表达和蛋白的合成往往需要耗费大量能量，而细胞产生下一代也需要。

所以，可以让这堆细胞先繁殖繁殖，等攒得差不多了，一次性产够多蛋白。

结合到operator上的阻遏物

具体的操作是在质粒上加一段操纵基因（operator）和阻遏物基因（repressor）。

平时，阻遏物基因会产生阻遏物结合操纵基因（上图中operator和repressor在RNA聚合酶前结合堵路），让转录时的RNA聚合酶被喊停，RNA转录不出来，蛋白也没法合成。

加入特殊的试剂后，这些试剂会结合阻遏物，防止阻遏物结合操纵子，从而实现DNA的转录和蛋白的合成。

∙纯化和检测

等这些宿主细胞把蛋白产够了，它们的日子基本就到头了。

如果宿主运气好，生产的蛋白是分泌到细胞外的，那么就直接在培养基中提纯，之后把它们保存起来，找机会继续“压榨”。

如果不幸，宿主细胞产的蛋白不分泌到培养基，而是留在细胞里，我们只能心痛地（实际根本没有）用细胞破碎仪让它们粉身碎骨，让细胞质内的蛋白出来，然后再提纯。

要么把蛋白乖乖上交，要么把蛋白乖乖上缴，还能给你跑了？