碳氮代谢测定Word格式.doc

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移液管（2ml、1ml）。

【试剂】提取缓冲液：

0.05mol/LTris-HCl，pH8.0，内含2mmol/LMg2+，2mmol/LDTT，0.4mol/L蔗糖。

称取Tris（三羟甲基氨基甲烷）1.5295g，0.1245gMgSO4·

7H2O，0.1543gDTT（二硫苏糖醇）和34.25g蔗糖，去离子水溶解后，用0.05mol/LHCl调至pH8.0，最后定容至250ml；

反应混合液A（0.1mol/LTris-HCl缓冲，pH7.4）：

内含80mmol/LMg2+，20mmol/L谷氨酸钠盐，20mmol/L半胱氨酸和2mmol/LEGTA，称取3.0590gTris，4.9795gMgSO4·

7H2O,0.8628g谷氨酸钠盐，0.6057g半胱氨酸，0.1920gEGTA，去离子水溶解后，用0.1mol/LHCl调至pH7.4，定容至250ml；

反应混合液B（含盐酸羟胺，pH7.4）：

反应混合液A的成分再加入80mmol/L盐酸羟胺，pH7.4；

显色剂（0.2mol/LTCA,0.37mol/LFeCl3和0.6mol/LHCl混合液）：

3.3176gTCA（三氯乙酸），10.1021gFeCl3·

6H2O，去离子水溶解后，加5ml浓盐酸，定容至100ml；

40mmol/LATP溶液：

0.1210gATP溶于5ml去离子水中（临用前配制）。

【方法】1.粗酶液提取称取植物材料1g于研钵中，加3ml提取缓冲液，置冰浴上研磨匀浆，转移于离心管中，4℃下15,000g离心20min，上清液即为粗酶液。

2.反应1.6ml反应混合液B，加入0.7ml粗酶液和0.7mlATP溶液，混匀，于37℃下保温半小时，加入显色剂1ml，摇匀并放置片刻后，于5,000g下离心10min，取上清液测定540nm处的吸光值，以加入1.6ml反应混合液A的为对照。

3.粗酶液中可溶性蛋白质测定取粗酶液0.5ml，用水定容至100ml，取2ml用考马斯亮蓝G-250测定可溶性蛋白质（见实验28）。

4.原始数据记载5.结果计算：

GS活力（A·

h－1）＝式中A—540nm处的吸光值；

P—粗酶液中可溶性蛋白含量（mg/ml）；

V—反应体系中加入的粗酶液体积（ml）；

T—反应时间（h）。

蔗糖合成酶的测定方法

一、仪器设备

冷冻离心机、恒温水浴、分光光度计

二、试剂

HEPES-NaOH（50mmol/L，pH7.5）缓冲液，包括50mmol/LMgCI2；

2mmol/LEDTA；

0.2%（W/V）BSA；

2%PVP；

0.1%间苯二酚：

称取0.1g溶解并定溶于100ml95%乙醇中。

30%盐酸、2mol/LNaOH、100mmol/LUDPG、100mmol/L6-磷酸果糖、100mmol/L果糖

三、操作方法

1、粗酶液制备

称取0.5g样品（植物叶片去掉主叶脉），洗净剪碎，置于预冷的研钵中，加3mlHepes-NaOH缓冲液，冰浴研磨，10000×

g离心10min。

2、酶活性测定

依次加入50μL粗酶液，

50μLHepes-NaOH缓冲液pH7.5，

20μL50mmol/LMgCI2，

20μL100mmol/LUDPG，

20μL100mmol/L6-磷酸果糖（20μL100mmol/L果糖），

30℃中反应30min后，加入200μL2mol/LNaOH终止反应，沸水煮10min，流水冷却，加入1.5ml30%盐酸和0.5ml0.1%间苯二酚，摇匀后置于80℃水浴保温10min，冷却后置于480nm处，以提前杀死酶活性为空白比色测定蔗糖含量。

同时取50μL粗酶液，加入200μL2mol/LNaOH，以下同上操作，测定蔗糖含量。

3、蔗糖标线制作：

取0、40、80、120、160、200μg/ml的蔗糖溶液50μL，操作同上，然后以蔗糖浓度为纵坐标，以吸光值为横坐标，得方程。

4、计算

样品中酶活性（μg·

g﹣1·

h﹣1）=

式中C—反应液催化产生的蔗糖总量（μg）；

V1—提取酶液时加入的缓冲液体积（ml）；

V2—酶反应时加入的粗酶液体积（ml）

淀粉酶活性的测定

1方法

1.1试剂配制淀粉酶提取缓冲液：

0.1mol/L-1柠檬酸溶液（pH5.6）;

1%的淀粉溶液：

用0.1mol/L-1的柠檬酸缓冲液（pH5.6）配制；

标准麦芽糖溶液（1mg/mL-1）;

3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）:

称取6.5g3,5-二硝基水杨酸溶于少量水中，移入1000mL容量瓶中，加入325mL2mol·

L-1NaOH溶液，再加入45g丙三醇，摇匀，冷却后定容到1000mL。

淀粉和麦芽糖为Sigma产品，其余试剂为国产分析纯试剂。

1.2测定方法

1.2.1酶液的提取

将每一个重复的3个果实去皮后切碎混匀，称取其果肉1g，置于预冷的研钵中，加2mL预冷的0.1mol/L-1柠檬酸溶液（pH5.6）和少量石英砂研磨，将匀浆移入7mL的离心管中，再分别用1mL的0.1mol/L-1柠檬酸缓冲（pH5.6）冲洗2次,于4℃下以15000×

g离心15min，上清液转移入另一个5mL离心管中，作为酶提取液备用。

1.2.2酶活性的测定

取洁净的试管18支，作标记，每一个样品设1个对照。

总反应体积为0.5mL，测定管含0.2mL的酶提取液和0.3mL的1%淀粉溶液；

对照管含0.2mL的酶提取液和0.3mL的0.1mol/L-1柠檬酸溶液（pH5.6,不含底物淀粉）将试管放入恒温40℃的水浴锅中，保温30min后取出，立即加入1.5mL的DNS试剂终止反应再将试管置于沸水浴中10min，取出后冰浴冷却。

取反应液稀释10倍，测定波长520nm处的吸光值，同上做麦芽糖标准曲线，从标准曲线上查出麦芽糖的含量，计算淀粉酶的总活性。

周蓓云.α-和β-淀粉酶活性的测定.见：

中国科学院上海植物生理研究所，上海市植物生理学会编.现代植物生理学实验指南.北京：

科学出版社，1999.123~124

转化酶的测定

转化酶又称蔗糖酶，是一种水解酶，植物体的库组织中，一般含有较高活性的转化酶，它能将植物体内的主要同化产物——蔗糖不可逆的水解为葡萄糖和果糖，为细胞的可溶性糖贮库提供可利用六碳糖，以用于细胞壁、贮藏多糖及果聚糖的生物合成，并通过与呼吸作用偶联的氧化磷酸化产生能量，所以，转化酶与植物组织的生长有密切关系，是衡量同化产物的转化和利用、植物细胞代谢及生长强度的指标。

试剂：

1、10%蔗糖溶液

2、葡萄糖标准液（500μg/ml）

3、0.05mol/l的磷酸缓冲液

4、（DNS）3，5二硝基水杨酸：

将6.3g二硝基水杨酸和262ml2mol/lNaOH溶液，加到500ml含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中备用。

方法：

1、酶的提取：

1g样品剪碎后，用预冷的蒸馏水在冰浴中研磨成匀浆，定容至100ml，在冰箱中浸提3小时，4000转离心15分钟，上清液即为酶的粗提液。

2、酶活性的测定：

吸酶液2ml，放入试管中，再加入pH6.0的缓冲液5ml及10%蔗糖溶液1ml，在37度水浴中保温30分钟，取出后立即按3，5二硝基水杨酸法测定还原糖的含量。

以煮沸酶液10分钟钝化酶的试管作对照。

3、还原糖标准曲线的制作及还原糖含量的测定

①标准曲线：

取6支20ml刻度试管，编号，按下表配置不同浓度的葡萄糖标准液：

管号

1

2

3

4

5

6

葡萄糖原液量（ml）

0.4

0.8

1.2

1.6

2.0

加蒸馏水量（ml）

葡萄糖浓度（μg/ml）

100

200

300

400

500

在上述各管中分别加入1.5ml3，5二硝基水杨酸试剂，在沸水浴中加热5分钟，取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，加蒸馏水定容至20ml，混匀，以1号管为空白，测540nm波长下的OD值。

以OD值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。

②酶反应液中还原糖的含量的测定：

吸取2ml反应液，加入1.5ml3，5二硝基水杨酸试剂，沸水浴中煮沸5分钟，冷却定容至20ml，测定540nm波长下的OD值，查标准曲线得酶反应液中还原糖的浓度。

4、结果计算：

A=（N-N’）*V/（T*W*1000）

A：

转化酶的活性（mg/gfw/h）N：

酶反应液中还原糖的浓度（μg/ml）

N’：

钝化酶反应液中还原糖的浓度（μg/ml）V：

酶反应液的总体积

T：

反应时间W：

材料鲜重

试剂：

谷氨酰胺合成酶：

Tris（三羟甲基氨基甲烷）、MgSO4.7H2O、DTT（二硫苏糖醇）、蔗糖、谷氨酸钠盐、半胱氨酸、EGTA、盐酸羟胺、TCA（三氯乙酸）、FeCl3.6H2O、ATP、

Rubisco酶：

磷酸钾、EDTA（乙二胺四乙酸）、硫基乙醇、KCl、MgCl2、ATP、DDT（二硫苏糖醇）、NADH（还原型辅酶1）KHCO3、RUBP、

三磷酸甘油酸激酶、三磷酸甘油醛脱氢酶、