对心肌肌钙蛋白自身抗体的抗原表位特异性和IgG子类分布.docx

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对心肌肌钙蛋白自身抗体的抗原表位特异性和IgG子类分布

对心肌肌钙蛋白自身抗体的抗原表位特异性和IgG子类分布

摘要

背景:

心肌肌钙蛋白（cTnAAbs）的自身抗体可以干扰心肌肌钙蛋白I（cTnI）的测量，这是对心肌梗死的免疫测定。

因此，我们确定了cTnI结合位点和循环cTnAAbs的IgG子类。

方法:

通过对健康志愿者的10个ctnaab-阴性和10个ctnaab阳性血清的复合物的检测，研究了夹层免疫测定的表位特异性。

为了研究IgG的子类，我们分析了胸痛患者的入院和3个月的随访情况，参照assay测量总IgG（14cTnAAb阴性和14cTnAAb阳性3个月），以及4个子类特异性的assay测量，只测量IgG子类1-4。

结果:

cTnI-阳性样本中肌钙蛋白复合物的平均回收率从37%到211%不等，为cTnI中段的最低（aa-30-110）。

然而，最低的采样恢复率，4%-92%，显示没有一个研究的表位完全逃脱了ctnaab相关的干扰。

cTnAAb阳性组的8例胸痛患者在采样点之间呈阳性，根据所有5个cTnAAb分析，在随访中，特异性信号普遍较高。

在ctnaab阳性组中，有68%的样本检测到IgG4的患病率最高。

结论:

IgG亚类研究证实，cTnAAb的形成可能是急性心脏事件的触发/增强。

关于cTnAAbs的表位特异性的新信息，应该用于重新评价关于在cTnI分析中使用中期表位表的现有建议。

为了避免高度不均匀的cTnAAbs的负面干扰，应该考虑使用3个或更多的非常规选择的表位。

三元肌钙蛋白复合物，由我、T和C组成，是肌原纤维收缩器械在横纹肌细胞中的一部分。

由于这些细胞内蛋白I和T存在于骨骼肌和心肌的不同亚型，在血液中测量心脏特异性等型（心肌肌钙蛋白）是证明最近或持续性心肌损伤的最敏感手段。

这使心肌肌钙蛋白成为诊断急性冠脉综合征（ACS）3

（1）的推荐生物标志物。

然而，心肌肌钙特异性自身抗体（cTnAAbs）可以通过心肌肌钙蛋白I（cTnI）检测这些临床上重要的生物标志物来干预临床实践（2-4）中所使用的ifcc推荐的中间片段方法。

cTnAAbs已被发现高比例（5%-20%）或无心脏疾病（5-10），而导致自身抗体形成的心脏肌钙特异性自身免疫反应可由心肌损伤后的心肌蛋白释放引起，例如在炎症、缺血或心脏毒性治疗后。

然而，他们的外观和维护的机制却鲜为人知。

cTnAAbs除了能够干扰心脏肌钙蛋白检测，还具有临床意义。

最近的研究使用小鼠模型，有相关的循环ctni特异性cTnAAbs与心脏肌肉炎症和出现的症状表示心脏疾病。

这些研究表明，cTnI特异性单克隆抗体（MAbs）的管理诱导野生型小鼠自体免疫扩张型心肌病（11），对cTnI自身免疫反应的刺激，而不是cTnT，导致心肌炎症和心脏功能障碍的增加（12,13）。

此外，在实验性柯萨奇病毒b3型心肌炎急性期的心脏损伤和cTnI释放相对温和，导致cTnAAb形成（14）。

在人类身上也研究了循环cTnAAbs的可能的临床后果。

最近的一项研究（10）表明，cTnAAbs的存在可能会导致ACS患者的cTnI的更高、更长的释放。

另一项关于ACS患者（15）的研究表明，ctni特异性cTnAAbs可能对左心室功能的恢复有负面影响。

然而，一些团体报告说，ctnaab阳性患者的结果并不低，甚至比ctnaab阴性的患者有缺血性心肌病、扩张型心肌病、心力衰竭和/或ACS（6,16-19）的结果要好。

cTnAAbs在心脏疾病的病因学上的作用，以及在明显健康的个体中出现的原因尚不清楚。

实际上，心脏肌钙特异性自身免疫似乎只出现在某些个体中，而绝大多数的心性病人并没有发展它（18,19）。

此外，cTnAAbs作为诊断和/或预后生物标志物的可能用途尚不清楚，因为缺乏足够的长期随访研究。

由于缺乏关于人体cTnAAbs分子特性的详细数据，我们本研究的目的是更准确地探索cTnI结合位点的位置和cTnAAbs的IgG子类分布。

材料和方法

试剂

除了8I7（国际保健点，），所有的MAbs都是由HyTest（www.hytest.fi）提供的。

表1给出了MAbs的总结和抗原。

这些信息是从制造商的包中获取的。

我们从KaivogenOy（）和人类心脏肌钙蛋白（ITC）上购买了一种从HyTest来的心脏肌钙蛋白。

ITC稀释成Tris-buffered盐水与叠氮化（TSA）（50更易/LTris-HCl,pH值7.75,150更易与L氯化钠,0.5g/LNaN3）包含75g/LBSA（微孔/集,）,和股票是储存在−20°C到使用。

如果制造商指定了绑定站点或表位。

aa,氨基酸。

骨胳肌钙蛋白I的交叉反应>50%。

用生物素和镧系螯合物标记抗体

抗体是用生物素标记或内在荧光铕（欧盟）螯合如前所述（5）,捕获抗体生物素化的生物素10-30倍摩尔过剩的异硫氰酸酯（礼物Jaana罗森博格,生物技术学系图尔库大学芬兰）,和检测抗体被贴上一个25-35-foldEu-chelate摩尔过剩,{2,2′,2′′,2′′′-{[2-（4-isothiocyanatophenyl）ethylimino]bis

（二）bis{4-{[4-（α-galactopyranoxy）苯基]乙炔基}pyridine-6,2-diyl}bis（methylenenitrilo）}tetrakis（acetato）}铕（ⅲ）（20）（辐射计/Innotrac诊断Oy,www.innotrac.fi）。

生物素化的或欧盟（III）标记马伯稳定了BSA（1g/L）和储存在4°C。

免疫测定法测定ITC复合物的分析恢复

通过比较ctnaab阳性样品的分析回收率和ctnaab-阴性样品的回收率，确定cTnAAbs在cTnI分子上的结合位点。

我们通过使用各种ctni特异性的MAbs进行捕获，并使用相同的troponinc-specificMAb作为示踪剂，测量了每个未加刺的和itc的血清样品中的荧光信号。

首先,300ng生物素化的捕获是固定化SA-coated微量滴定井25μLKaivogen缓冲溶液与大约1小时孵化环境室温。

同时,ITC是加入血清整除的最终浓度30μg/LcTnI和孵化1h在4°C。

洗后,20μL血清整除（ITC-spiked和未加料的每个血清样本）和100ngEu-labeled7b9马伯20μL第二绝缘层（ILII,辐射计/Innotrac诊断Oy）被添加到威尔斯一式三份。

1h井被孵化的36°C,900rpm板振动器（iem孵化器/瓶,热电子/Labsystems,）。

洗井被干,我们测量了时间分辨荧光直接从表面与维克多×4Multilable计数器（优秀/Wallac,）。

最后，我们通过将每个样本的itc特异性信号与ctnaab-阴性样品的平均信号进行比较，计算出不同捕获表位的特定回收率。

免疫测定法检测人体cTnAABs

与ILII血清样本稀释5倍,从每个prediluted荧光信号测量样品有无ITC（30μg/LcTnI）。

绑定后可能cTnAAbsITC复杂（1h,4°C）,30μL样本和200年μLKaivogen缓冲溶液补充10mg/L本机和5mg/L变性老鼠免疫球蛋白（子午线国际生命科学/生物设计,）被添加到一式三份SA井preimmobilized100ng的每个生物素化的捕获抗体（MF44c2,7b9）。

1h井被孵化的36°C,900rpm,然后清洗。

随后,Eu-labeled检测抗体（50-150ng）添加到井200年μLKaivogen缓冲溶液与小鼠免疫球蛋白补充。

我们使用MAb3D3作为一个示踪剂，在总IgG检测中检测所有IgG子类和MAbs2C11,3C7,5G12,5C74个子类特异性检测，分别检测IgG子类1-4。

另一个1h井被孵化的36°C,最后荧光测定。

具体信号≥100项被视为积极的如果学生学习任务给一个P值<0.05时,信号来自相同的样本有和没有添加ITC比较。

样品

该研究方案得到了当地伦理委员会的批准。

所有参与者均获得知情同意书，并按照1975年赫尔辛基宣言的规定进行了研究，并于2006年修订。

在2010年至2011年期间，我们在图尔库大学生物技术学院（UniversityofTurku）收集了明显健康的志愿者（n=20）的血清样本，进行了表位特异性研究。

其中10例为cTnAAb阴性和10cTnAAb阳性，根据此前发表的cTnAAbassay（10,21）。

简单地说，血清样本的cTnAAbs首先被绑定到ITC，而形成的ITC-ctnaab复合物随后被用150ngbiotinylatedMAbs4C2和MF4进行预固定化。

最后，我们发现捕获的cTnAAbs有40ng标签3D3MAb。

一个样本被定义为阴性或阳性，如上所述。

我们分析了入院3个月患者的总IgG和IgG子类，以及来自81名非st-抬高ACS患者的28例胸痛患者的血清样本。

从1998年到2000年，在芬兰的9家不同的中央医院采集了样本，用于对ACS患者克拉霉素治疗的安慰剂对照研究，如前所述（22）。

样本储存在−已解冻70°C和前几次cTnAAb测量。

我们使用总IgG分析将患者分为2个研究组:

第一个组包括14个ctnaab阴性患者，第二组14个ctnaab阳性患者3个月随访。

统计分析

我们分析了IgG-specific信号采样点之间的差异与PASW统计18软件（SPSS,www-01.-0.05为有统计学意义。

结果

为了对cTnI分子的cTnAAb结合位点进行评估，我们用19种不同的cTnI特异性捕获抗体对ITC恢复进行了测量，并使用相同的troponinc特异性抗体作为示踪剂。

尽管在ctnaab阳性样本中，所有19个表位样本中ITC的平均恢复率为89%，但单个cTnI抗原表位的平均恢复值为37%至211%（图1A）。

最低的平均回收率是在c终点站的中段和n端部的表位上获得的。

此外，我们发现在ctnaab阳性样本的个体回收率中有相当大的变化:

单个表位的最小和最大回收率分别从4%到92%和78%到309%不等。

图1B中3个ctnaab-阳性学科的位点特异性回收率的比较表明，个体间的干扰差异是不同的。

图1所示。

ITC对不同的cTnI站点的分析恢复。

（A）10个ctnaab阳性样品的分析回收率。

须表示最小和最大的信号;盒子代表第25百分位、中位数和第75百分位;和广场代表的意思。

（B）在3个ctnaab阳性样本中，ITC的特异性回收率的一个例子。

为了研究cTnAAbs的IgG子类，我们分析了cTnAAbs的总IgG和4个子类特异性的assays。

在两个采样点上，cTnAAb阴性组的全部14例胸痛患者均为cTnAAb阴性。

在14例ctnaab阳性组患者中，6例为阳性，8例为随访阳性。

这些igg阳性样本的具体信号为105到69502计数（中值2111计数）。

如表2所示，ctnaab-阴性组的样本均未为IgG1或IgG2阳性，但4例入院和5个随访样本对IgG3和/或IgG4（特异性信号125-794计数，中值242）弱阳性。

虽然在ctnaab阳性组中观察到所有IgG亚类1-4（特异性信号101-115579，中位数620），IgG4的患病率最高，在8例入院和11次随访中检测到。

此外,入学3和10后续cTnAAb-positive组阳性样本同时为2-4子类（表3）。

根据所有5免疫球蛋白测定研究,具体的信号在随访相比高出一般入学水平,表明cTnAAb高滴度和/或改进的亲和力（图2）。

采样点之间的差异具有统计学意义（P<0.05）,与所有化验除了IgG3-specific试验（P=0.249）。

图2所示。

cTnAAb信号（Adm）和3个月随访（3m）血清来自14个cTnAAb-阴性（A）和14个cTnAAb阳性（B）胸痛患者。

ctnaab阴性样本得到了一个特定的50数的信号。

须表示最小和最大的信号;盒子代表第25百分位、中位数和第75百分位;和广场代表的意思。

讨论

目前，cTnAAbs起爆的原因和机制尚不清楚，其临床和诊断意义尚不明确。

虽然cTnAAbs已经成为cTnI分析的重要分析机构，但其分子特性的详细数据却很少。

因此，本研究的目的在于描述这些自身抗体的表位特异性和IgG亚类分布。

我们的表位特异性研究证实了先前发表的观察（23），cTnI分子的稳定的中间片段经常是cTnAAbs的目标，但也证明了cTnAAb的干扰超出了中间片段，特别是对c端。

虽然一些表位可能不太倾向于ctnaab相关的干扰，但我们的ITC恢复数据为10个ctnaab阳性的样本显示，没有一个被研究的表位完全逃脱了。

此外，由于不同个体之间的最大干扰区域不同，在未来的cTnI分析中应该考虑使用3个或更仔细选择的结合位点。

除了能够阻止抗体的结合，观察到的恢复明显>100%意味着cTnAAbs也可以稳定一些表位或增强抗体对其结合位点的亲和力。

然而,这项研究的结果证实我们最近发表的结论基于抗体配置不同于小说cTnI化验派生的IFCC-recommendedmidfragment方法改善cTnAAb-positivecTnI检测样品,也证明我们的初步假设cTnI-specific干扰甚至比最初报道更多的异构（4）。

在取样点之间，ctnaab阳性组的8例胸痛患者呈阳性。

此外，所有5个cTnAAbassays的特定信号通常在指数事件后3个月。

这些数据证实心肌肌钙蛋白在原发性缺血性损伤时心肌细胞渗漏可能引起自身免疫反应导致cTnAAb形成（6,10）。

另外，泄漏可以作为先前免疫的助推器，既可以增加血液中的cTnAAb滴度，又能提高自身抗体的亲和力。

在ctnaab阳性组中，所有IgG子类被检测到，46%的个体血清对多个子类呈阳性。

由于ctnaab阳性样本的频率与特定的子类特异性assay有关，与assay敏感性有关，因此不可能直接比较这些频率。

然而，值得注意的是，IgG4是在本研究中最常见的cTnAAb（在cTnAAb阳性组中68%的样本中发现）。

IgG4通常是4个IgG子类中最不常见的。

因为重复的抗原刺激被认为会促进igg4型抗体的形成，igg4型cTnAAbs的出现表明在急性事件发生之前，心脏病人的长期心肌肌钙渗漏可能已经发生。

同样有趣的是，IgG4通常被认为是一种良性和非致病性抗体，在某些过敏反应中甚至有积极作用（24）。

这两种观点都可能与观察结果有关，这是由于半抗体交换反应（fab-armexchange）的结果，大多数igg4型抗体都是两种不同抗原结合位点的双特异性抗体，使得分子对给定抗原（25）的功能是一价的。

因此，igg4型cTnAAbs的高流行也解释了为什么我们尝试开发桥型免疫系统，即使用与捕获相同的抗原，而cTnAAb检测的示踪剂也没有成功（结果没有显示）。

igg4型抗体的另一个特点是，他们可能对各种动物IgG有很高的亲和力，比如老鼠IgG，通过它们的恒定区域而不是抗原结合位点（26,27）。

如果心脏肌钙蛋白特异性IgG4s与动物igg结合，作为免疫测定试剂，那么除了阻断特定的心肌肌钙蛋白表位外，它们还可能干扰心肌肌钙蛋白免疫测定。

本研究仅局限于研究igg型抗体;虽然IgM型抗体在主要免疫反应中占主导地位，但IgM反应没有被研究。

总IgG和子类特异性检测结果之间的差异说明了自身抗体分析的挑战。

首先，不同的示踪抗体的亲和力会导致不同的检测灵敏度，这是由于缺乏明确的标准而无法确定的。

其次，正如我们的表位特异性研究所证明的，cTnAAbs构成了异质人群，其中精确的表位特异性和与心肌肌钙蛋白结合的亲和力可能有很大的差异。

此外，使用不同的分析格式使得不同报告之间的直接比较不可能。

虽然许多已发表的cTnAAb分析使用了直接涂敷的cTnI或cTnT表面，但我们的分析方法的一个优点是，我们可以通过测量特定样本的背景来校正其他抗体的非特异性结合的结果，这些背景似乎在个体之间（21）之间有很大的波动。

另一方面，因为我们在cTnAAb中使用ITC作为靶分子，我们不能区分cTnI和ctnt特异性的自体抗体阳性。

综上所述，由于cTnAAb在明显健康的个体中很常见，而cTnAAb的形成可能在急性心脏事件中被触发或增强，因此在未来的cTnI分析设计中应承认其分析干预效果。

cTnI分子的中段通常是商业cTnI检测的唯一检测地点，但也是cTnAAbs最经常瞄准的部位。

此外，我们的详细的表位筛选清楚地表明，整个cTnI分子会受到ctnaab相关性干扰的影响，在受影响的位点和干扰程度上有显著的个体差异。

因此，应该考虑使用3个或更仔细选择的表位来规避高度不均匀的cTnAAbs的负面干扰。