MIC的测定微量二倍稀释法Word文件下载.doc
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二、试验器材、化学试剂及菌种
96孔板、试管、5uL-50uL微量移液器、100uL-1000uL微量移液器、以及配套的枪头、10mL离心管、麦氏比浊管、超净工作台、高压灭菌锅、鼓风干燥箱、生化培养箱、MH肉汤培养基、PBS缓冲液、无菌水。
菌种:
溶血性链球菌、溶血性葡萄球菌、李斯特菌、结核分枝杆菌、白喉棒状杆菌、吸附性绿脓杆菌、大肠杆菌
三、试验准备
1、培养基的配置
MH培养基42g,蒸馏水1000ml。
灭菌后待用,若一次用不完可放入4℃冰箱中放置。
使用前拿出放置室温即可。
2、工器具的灭菌
将配置好的MH培养基、PBS缓冲液、无菌水、配套枪头、离心管放入高压灭菌锅中灭菌,121℃杀菌25min。
试管一起放入鼓风干燥箱中灭菌,170℃杀菌2h。
96孔板在超洁净工作台上紫外杀菌30min以上。
2、抑菌剂的配置
抗菌药物的溶解与稀释,一般情况下,水溶性抗菌药物采用灭菌蒸馏水溶解,而对于不溶或者难溶于水的抗菌药物要根据其特性,采用甲醇,缓冲液,NaOH溶液,DMSO溶液等,尽量将抗菌药物溶解后用蒸馏水或者缓冲液稀释后,作为抗菌药原液。
3.、菌悬液的配置
从冰箱取出需要测试的菌种活化0.5h后,加入5mL的PBS缓冲液将斜面上,在手掌上轻轻振打80次,使菌株完全冲下,倒入试管中轻轻摇匀。
吸取1mL的菌液加入到4mL的PBS缓冲液中,再吸取1mL稀释的菌悬液依次进行5倍梯度稀释,选择108CFU/mL左右的菌悬液或106CFU/mL左右的孢子悬浮液(对比0.5麦氏比浊管),将选好的菌悬液十倍系列稀释后选第二支试管(即浓度约为106CFU/mL左右的菌悬液或104CFU/mL左右的孢子悬浮液),再吸取0.5ml加入到4.5mlMH培养基中,用枪头吹匀待用。
四、试验步骤
1.在96孔板每个孔加入MH肉汤培养基100μl。
2.在A/B/C三排的第一孔加配好的药液100μl,然后对药物进行二倍稀释。
即,第一孔中加入药液后用移液枪充分吹打(至少三次以上)使药物与肉汤充分混匀,然后吸取100μl加入第二孔再充分吹打使之与肉汤充分混匀,照此重复直至最后一孔,第12列吸出100ul扔掉。
3.再在每一孔中加入稀释好的菌液100μl,重复做三次(A/B/C三排样品)。
4.在同一块板上的G排上做一排阴性对照(仅加空白肉汤不加菌液)和在H排上做一排阳性对照(加菌液不加药液)。
5.将96孔板放入37℃恒温培养箱16~20小时后,观察结果。
五、结果观察记录:
1、若有菌生长孔板底部会有白色沉淀。
2、MIC值的判定:
96孔板上横排中未有沉淀的最后一孔所对应的浓度便为该药的MIC值。
3、观察所做的阴性对照和阳性对照结果。
4、记录结果并将每种药物的MIC值。
六、注意事项:
无菌操作
1、除移液枪和96孔板外其他所有用具都需经过高压灭菌处理。
2、超净台使用前后都需打开紫外灯进行消毒;
不能拿酒精面球球擦挡板。
3、操作前洗手,用酒精棉球擦手。
4、每次枪头过瓶口,瓶口都要经火焰烧过;
移液枪和枪头不能在究竟灯上烤。
5、操作过程中加液尽可能不将96孔板盖完全打开。