蛙类斯氏离体心脏灌流Word文档格式.doc
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2.器具:
常用手术器械,解剖盘,蛙板(木质),毁髓针,玻璃分针,手术剪,手术镊,铁钉,蛙心套管,套管夹,双凹夹,滑轮,蛙心夹,支架,双针形露丝刺激电极,滴管,小烧杯,棉线,张力传感器,生理信号采集系统。
3.试剂:
任氏液,5%NaCl溶液,1%KCl溶液,2%CaCl2溶液。
【实验步骤】
1.暴露动物心脏
取一只蟾蜍,双毁髓后背位置于蛙板上,一手持手术镊提起胸骨后方的皮肤,另一只手持手术剪剪开一个小口,然后将剪刀由开口处伸向皮下,向左、右两侧下颌角方向剪开皮肤。
将皮肤掀向头端,再用手术镊提起胸骨后方的腹肌,在腹肌上剪一口,将金冠剪紧贴体壁向前伸入(勿伤及心脏和血管),并沿皮肤切口方向剪开体壁,剪断左右乌喙骨和锁骨,使创口呈一倒三角形。
一手持眼科镊,提起心包膜,另一手用眼科剪剪开心包膜,暴露心脏。
2.斯氏蛙心插管
仔细识别心脏周围的大血管。
在左主动脉下方穿一线,并打一活结备用。
左手提起主动脉上的结扎线,右手用眼科剪在结扎线下方、沿向心方向将动脉壁上剪一斜口。
选择大小适宜的蛙心套管,然后将成盛有少量(套管内2~3cm高度)任氏液(内含葡萄糖)的斯氏蛙心套管,由开口处插入动脉圆锥。
当套管尖端到达动脉圆锥基部时,应将套管稍稍后退,使尖端向动脉圆锥的背部后下方及心尖方向推进,经主动脉瓣插入心室腔内(于心室收缩时插入,但不可插得过深,以免心室壁堵住套管口)。
此时可见血液冲入套管,并使液面随心脏搏动而上下移动,表明操作成功(否则需退回并重新插入)。
用滴管吸取套管中的血液,更换新鲜任氏液。
稳定住套管后,轻轻提起备用线,将左、右主动脉连同插入的套管用双线紧紧扎紧(不得漏夜),再将结线固定在套管的小玻璃钩上,然后剪断结扎线上方的血管。
轻轻提起套管和心脏,看清静脉窦的位置,于静脉窦下方剪断有牵连的组织,仅保留静脉窦与心脏的联系,使心脏离体。
(切勿损伤静脉窦)。
用任氏液反复冲洗心室内余血,使套管内灌流液不再有残留血液。
保持套管内液面高度一致(1.5~2cm),即可进行实验。
图1斯氏蛙心插管法
3.连接实验装置
将插好离体心脏的套管固定在支架上,用蛙心夹夹住少许心尖部的肌肉(不可夹得过多,以免因夹破心室而漏液)。
在将蛙心夹上的系线绕过一个滑轮与张力传感器相连。
注意:
勿使灌流液滴到传感器上。
打开生理信号采集系统,接通张力传感器输入通道。
调节系线的拉力,使心脏的收缩活动在显示屏上出现。
调节显示器上心脏收缩曲线的幅度适中。
调整扫描速度,使心搏曲线的幅度与宽度适中。
图2实验装置示意图
4.实验观察
(1)记录正常心搏曲线。
(2)向套管内滴加2-3滴5%NaCl溶液,做好加药记号,观察心搏曲线的频率及振幅变化当曲线出现明显变化时,应立即吸去套管中的灌流液,并做好冲洗标记,迅速用新鲜任氏液清洗,待心搏恢复正常。
(3)同法向套管内加入1-3滴2%CaCl2溶液,观察并记录心搏曲线的变化。
当出现明显变化时,立即更换任氏液,待心搏恢复正常(如果恢复迟缓,可多次冲洗)。
(4)向套管中加入1-2滴1%KCl溶液,记录心搏曲线的变化。
【实验结果及分析】
背景知识:
心肌细胞动作电位和主要离子活动(以心室肌细胞为例)。
心室肌细胞的动作电位由除极化过程和复极化过程所组成,共分为五个时期:
图3心室肌细胞动作电位和主要离子活动
1.除极化过程(0期):
当心肌细胞接受一个阈上刺激时,膜内电位由静息状态时的-90mV去极化并反极化到+20mV~+30mV,构成动作电位的上升相,称为0期。
历时仅1~2ms。
其正电位部分称为超射。
形成机制:
当心室肌细胞受到刺激产生兴奋时,首先引起Na+离子通道(快Na+通道)的部分开放和少量Na+离子内流,膜局部去极化。
当去极化到阈电位水平(-65mV)时,大大增加膜上Na+离子通道开放的数量,出现再生性Na+离子内流,使膜进一步去极化,最终使膜内外电位发生反转,趋近于Na+离子的平衡电位。
2.复极化过程:
当心室肌细胞去极化达到顶峰后,开始复极化过程。
根据膜电位变化曲线的形状及其形成的离子机制不同,可将其可分为4个时期:
(1)快速复极化初期(1期):
膜电位由+30mV迅速下降至0mV左右,历时约10ms。
与0期去极化组成了锋电位。
Na+离子通道失活,Na+离子内流停止。
同时K+离子通道被激活后形成K+离子瞬时外流,引起膜电位初期的快速复极化。
(2)平台期(2期):
表现为膜电位变化较小,电位接近于0mV水平,持续100~150ms。
此期为心室肌细胞区别于神经或骨骼细胞动作电位的主要特征。
在早期平台期,Ca2+离子的内流和K+离子的外流所负载的跨膜电荷量几乎等,膜电位稳定于1期复极化所达到的零电位水平。
随后,慢钙通道逐渐失活,而K+离子外流逐渐增加,出膜的正电荷量逐渐增加,结果膜内电位逐渐下降,形成晚期平台期。
(3)快速复极化末期(3期):
继平台期之后,细胞膜复极化速度加快,膜内电位由0mV逐渐下降到-90mV的静息电位水平。
历时100~150ms。
外向K+离子流逐渐增强,超过内流的Ca2+离子。
(4)静息期(4期):
膜复极化完毕,膜电位恢复并稳定在-90mV的静息电位水平。
由于此期膜内、外各种正离子浓度的相对比例尚未恢复,细胞膜的离子转运机制加强,通过Na+-K+泵的活动和Na+-Ca2+交换作用,将内流的Na+离子和Ca2+离子排出膜外,将外流的K+离子转运入膜内,使细胞内外离子分布恢复到静息状态水平,从而保持心肌细胞正常的兴奋性。
实验结果:
1.正常心搏曲线
图4蟾蜍离体心脏正常心搏曲线
2.5%NaCl溶液对蟾蜍离体心脏活动的影响
滴加5%NaCl溶液,蟾蜍离体心脏收缩力显著减弱,洗去NaCl溶液,蟾蜍心脏收缩力逐渐恢复正常。
图55%NaCl溶液对蟾蜍离体心脏活动的影响
结果分析:
心肌细胞的收缩对细胞外Ca2+的浓度有很高的依赖性。
在任氏液中滴加NaCl溶液,Na+与Ca2+内流的竞争性抑制导致Ca2+内流减少,心肌的收缩活动也随之减弱。
3.2%CaCl2溶液对蟾蜍离体心脏活动的影响
滴加2%CaCl2溶液,蟾蜍离体心脏收缩力显著增强,洗去CaCl2溶液,蟾蜍心脏收缩力逐渐恢复正常。
图62%CaCl2溶液对蟾蜍离体心脏活动的影响
向任氏液中滴加CaCl2溶液,细胞外Ca2+浓度上升,内流增加,肌质网Ca2+的储存量和释放量增加,心肌收缩力增强。
当肌浆中的Ca2+浓度不断升高,Ca2+与肌钙蛋白结合数量不断增加,甚至达到只结合不解离的程度,心肌将会处于持续收缩状态,称为“钙僵”。
4.1%KCl溶液对蟾蜍离体心脏活动的影响
滴加1%KCl溶液,蟾蜍离体心脏收缩力显著减弱,洗去NaCl溶液,蟾蜍心脏收缩力逐渐恢复正常。
洗涤过程中动作过于剧烈,对心搏曲线造成了影响
图71%KCl溶液对蟾蜍离体心脏活动的影响
向任氏液中滴加KCl溶液,细胞外K+离子浓度升高,而K+与Ca2+有竞争性拮抗作用,K+可抑制细胞膜对Ca2+的转运,使进人细胞的Ca2+减少,心肌的“兴奋--收缩耦联”过程减弱,心肌收缩力降低。
细胞外K+浓度较高时,膜内外K+浓度梯度减小,静息电位的绝对值减小,Na+通道失活,心肌的兴奋性丧失,心肌不能兴奋和收缩,停止于舒张状态,此时,仅由Ca2+来构成动作电位,钙通道激活慢,去极化上升幅度小而缓慢,因此兴奋传导性降低。
【思考题选作】
1.本实验说明心肌的哪些生理特性?
答:
(1)自动节律性;
(2)兴奋性;
(3)传导性;
(4)收缩性。
2.用本实验说明内环境相对恒定的重要意义。
多细胞动物机体内,全部细胞的新陈代谢,都必须通过内环境才能进行。
内环境中各种
理化因素维持在相对恒定的状态,即使外坏境有强烈的变化,机体的内环境仍可以保持
相对恒定。
当内环境的相对恒定被破坏时,机体的生命过程就会遭到损坏,包括心脏的
节律性跳动,等。
3.试分析任氏液中适量的钠、钙与钾离子对心肌的作用。
略。
4.为何强调实验中保持灌流液面的恒定?
灌流量对心肌活动有什么影响?
保持灌流液面恒定,是为了保证对心脏的压力保持恒定,否则,不能说明心搏曲线的变
化是由药物引起还是由压力的变化引起。
灌流量大,对心肌的压力大,心脏所承受的负
荷大,心肌活动能力会略微减弱;
反之,心肌活动能力会略有加强。
【注意事项】
1.暴露心脏的过程中要小心,不要将血管剪断;
2.用棉线结扎血管时要扎紧,避免漏液;
3.插管时,不要插得过深,以免心室壁堵住套管口;
4.将左、右主动脉连同插入的套管用双线紧紧扎紧,避免漏夜,再将结线固定在套管的小玻璃钩上,避免脱落;
5.于静脉窦下方剪断有牵连的组织,仅保留静脉窦与心脏的联系,使心脏离体时,切勿损伤静脉窦。
6.用蛙心夹夹心尖部肌肉时要小心,不要损坏心肌组织;
7.向套管内加药和更换任氏液时,动作不要太剧烈,以免对心搏曲线造成大的影响;
8.在实验过程中,要不断用任氏液湿润心肌组织,避免干燥。
参考文献
[1]解景田,刘燕强,崔庚寅.蛙类斯氏或八木氏离体心脏灌流.生理学实验,79-83
[2]王玢,左明雪.心脏生理.人体及动物生理学(第3版).高等教育出版社,209-213
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