挖掘新基因资源的方法Word文件下载.doc

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2）:

I%^4@*m#m$U-A平皿快速检测法平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的"

形态"

变化。

具体的有纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等。

这些方法较粗放，一般只能定性或半定量用，常只用于初筛，但它们可以大大提高筛选的效率。

它的缺点是由于培养平皿上种种条件与摇瓶培养，尤其是发酵罐深层液体培养时的条件有很大的差别，有时会造成两者的结果不一致。

平皿快速检测法操作时应将培养的菌体充分分散，形成单菌落，以避免多菌落混杂一起，引起"

大小测定的偏差。

4.细菌的生理生化试验，各种代谢产物的测定。

5.细菌培养鉴定，性能测定，克隆基因，表达分析。

缺点：

开发周期太长；

优点：

操作方法简单，获得较多的菌种资源。

大型设备：

电子天平、超净工作台、高低温恒振荡培养箱、恒温水浴锅、可见光分光光度计、高压蒸汽灭菌锅、PCR仪，紫外成像系统。

实例：

筛选高温淀粉酶产生菌及克隆基因（广西大学薛蓓2009年硕士毕业论文）

i.采样在在高温环境（广西象州温泉）采样，共选择三个采样点，即热泉口（温度80℃，pH7.0）、温泉水（温度73℃，pH6.5）及温泉旁边的底泥（温度65℃，pH6.8）。

ii.产α-淀粉酶产生菌的菌株筛选将采集的样品分级稀释，涂布在以可溶性淀粉为唯一碳源的M9培养基上，于60℃-80℃倒置培养24h，待长出菌落后，将平板置于4℃，直到淀粉板上透明圈明显后取出，观察透明圈大小，并测量菌落直径（C）及透明圈直径（H），计算透明圈与菌落直径比值（H/C）作为初筛指标，初步筛选出产淀粉酶高的优良菌株进行进一步的纯培养。

再以这些菌株为材料，液体培养检测其淀粉酶的活力以复筛选出了淀粉酶产量高的菌株。

iii.菌株鉴定，酶学性质测定选取复筛优良菌株65℃，200rpm振荡培养24h，测定发酵液酶活，并初测其性质，并鉴定该菌株。

iv.克隆高温淀粉酶基因根据GeneBank已公布的与所筛选菌株同源性最高的菌株里淀粉酶的序列设计引物进行PRC扩增得到目的基因。

该基因编码的淀粉酶在80℃下保温20min,残留活性在85%以上。

二宏基因组技术挖掘新基因资源

分子微生物生态学的研究业已证明环境中大量存在未能培养的微生物，某些环境中采用现有培养技术能够培养的微生物不到1%，超过99%的微生物尚未能培养（AmannRI,LudwigW,1995），可见基于微生物分离培养的技术途径开发利用微生物资源受到了极大的限制。

为了突破上述限制，充分挖掘和利用微生物的多样性基因资源，人们在寻找新技术方法上倾注了极大的热情。

“宏基因组”即指生境中全部微小生物遗传物质的总和，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和（HandelsmanJ.,RondonM.R.Brady,1998）。

宏基因组文库既包含了可培养的又包含了未能培养的微生物基因，避开了微生物分离培养的问题，极大地扩展了微生物资源的利用空间。

目前已采用土壤、海水、海洋浮游生物、海棉、甲虫、人唾液等环境样品成功构建了宏基因组文库，已筛选到的生物活性物质有各种酶类及一些次生代谢产物，包括脂酶/酯酶、蛋白酶、淀粉酶、氧化酶、几丁质酶、核酸酶、膜蛋白、4-羟基丁酸代谢酶系、生物素合成酶系、色素、抗菌抗肿瘤活性物质及抗生素抗性基因等。

宏基因组文库技术的主要流程如下：

1从环境中提取宏基因组DNA；

先采集环境样品，处理，裂解，抽提总DNA，一般按处理样品方式的不同划分为直接提取法和间接提取法。

顾名思义，直接提取法就是直接对样品进行裂解，释放其中的DNA；

间接提取法则是先分离样品中的微生物，后对微生物进行裂解用核酸内切酶切割成一定长度的DNA片段并连接到合适的载体上。

2转化宿主菌，形成一个重组的DNA文库即宏基因组文库。

将提取的高质量的总DNA用合适的酶切、回收，然后和处理好的合适的载体进行连接，转化宿主。

3宏基因组文库筛选。

由于环境样品中微生物种类繁多，宏基因组文库容量一般较大，活性克隆子的筛选是新活性物质筛选的瓶颈，根据研究目的,可从生物活性水平、化合物结构水平以及DNA序列水平设计不同的筛选方案。

1）生物活性水平的筛选又称为功能驱动筛选（function-drivenscreening）,根据重组克隆产生的新活性进行筛选。

采用各种活性检测手段检测挑选活性物活性克隆子，进行生化分析和插入DNA片段序列分析，进而对其深入研究。

这一策略以生为线索能够发现全新的活性物质或基因，能够快速鉴别有开发潜力的克隆子，但工作量大，效率低，并且受检测手段的局限。

2）DNA序列水平的筛选又称为序列驱动筛选（sequence-drivenscreening）,以序列相似性为基础，执行某类功能的酶可能具有相识的基因序列。

根据某些已知的相关功能基因的保守序列或相似序列设计杂交探针或PCR引物，通过杂交或PCR扩增挑选阳性克隆。

这一策略有可能筛选到某一类结构或功能的蛋白质中的新分子，而且基于DNA的操作有可能利用基因芯片技术大大提高筛选效率，但必须对相关基因序列有一定的了解，较难发现全新的活性物质。

仪器设备：

恒温摇床，电热恒温培养箱，台式高速离心机，高速冷冻离心机，无菌工作台，低温冰箱,恒温水浴锅,制冰机,分光光度计，微量移液枪，PCR仪，精密移液器等。

该方法的难点是提取到高质量的DNA及高通量的筛选方法的建立。

筛选范围广，获得全新基因资源几率大

对实验操作人员要求高，技术复杂，实验经费较昂贵

目前也有很多研究者直接省略构建文库的步骤，以宏基因组DNA为模板，设计兼并引物或其他引物探针进行扩增基因。

如华南农业大学生物质研究所（林俊芳，2009年7月）就从海南，广州，新疆等地的环境样品中克隆到12个漆酶基因片段。

三从蛋白质纯化着手的方法（纯化后克隆）　

常规的基因克隆都是先通过构建基因文库或者PCR技术克隆到基因，然后通过对基因进行分析，来展开对该基因所编码的蛋白质研究。

随着蛋白质化学和蛋白质技术的发展，越来越多的研究者从天然的蛋白质出发，然后对蛋白质部分或者全部测序，从而分子生物学手段获取基因。

若研究者可得到足够多的纯化目的蛋白可根据目的蛋白的生物学功能,利用同位素标记的配体来筛选受体表达的阳性克隆。

当所分离的目的蛋白较难大量获得,但纯度较高时,可利用其中的一段氨基酸序列,反推出其基因序列,据此合成寡核苷酸用于cDNA文库的筛选;

或根据所获得的基因序列,指导5′端的引物合成,根据mRNA3′端poly2A序列指导合成poly2T的3′端引物,用PCR技术从制备细胞的mRNA或直接从胞浆内溶物物中合成相应的cDNA,将该cDNA克隆到表达载体上进行产物表达。

方法流程：

1培养微生物，收集培养物。

2分离纯化目标蛋白质，检测蛋白性质和纯度。

蛋白纯化主要有超滤，盐析（硫酸铵沉淀等），有机溶剂沉淀，离子交换层析，凝胶过滤层析，亲和层析等方法，一般在纯化过程中，以上方法组合使用。

3将纯化后的蛋白进行N端测序或者质谱分析，获得蛋白质全序列或者部分肽链序列。

4分析测序结果，设计引物，扩增基因（合成基因），进行表达分析。

培养Bacillussp.菌株，收集培养液（粗酶）

以Bacillussp.酸性淀粉酶克隆为例：

（广西大学2010年谢建华硕士毕业论文）

超滤

硫酸铵沉淀

凝胶过滤

对粗酶纯化获得Bacillussp.酸性α-淀粉酶

纯化的α-淀粉酶进行SDS-PAGE检验MALDI-MS分析GXBA-4淀粉酶的氨基酸序列质谱分析的结果

根据MALDI-MS分析的结果，经过BLAST比对，利用PCR技术克隆GXBA-4淀粉酶基因（合成基因）

目的基因进行表达和产物性质分析

该方法中，纯化蛋白和设计合适的兼并引物是关键和难点。

仪器设备：

恒温摇床，恒温培养箱，PCR仪，凝胶成像仪，冷冻离心机，核酸电泳仪，超净台，水浴锅，台式离心机，蛋白纯化系统等

目的明确，创新性强

费用高，流程复杂

四利用生物学数据库需找新基因资源

基因组测序技术的飞速发展使得生物数据库中基因和基因组序列数据呈爆炸式增长。

根据基因组测序计划统计网站GOLD（http:

//www.genomesonline.org）截止到2012年3月12日的统计数据，已有3173种生物的全基因组完成测序，其中2874种属于细菌，353种属于古细菌，173种属于真核生物；

而全球正在进行的全基因组测序计划还有10479个．另有1970个宏基因组测序计划正在进行或已经完成。

美国国家生物技术信息中心（NCBI）网站的统计数据显示（http：

//www.ncbi.him.nih.gov/Genbank/index.html）．截止到2011年4月．该网站中传统的Genbank数据库中已有近1.3亿多条序列．而全基因组鸟枪法（wholegenomeshotgun,WGS）测序数据库记录的来自个体和宏基因组的序列已有6200多万条．碱基数量累计1480亿个。

在如此庞大的基因组数据库中无疑包含着海量的工业酶基因资源。

新的基因资源的发现也从“挖土”筛选微生物转向从数据库中“挖基因”，也就是所谓的“基因组打猎”（genomehunting）或”数据挖掘”（datamining），该方法实际上是根据某一已知的探针酶的基因序列去搜索数据库来发现结构和功能类似的同源酶的编码序列。

在此基础上，研究者可以方便地设计引物，利用聚合酶链反应（PCR）技术从目标物种中大量地扩增获得目的酶基因．并进行异源重组表达。

基本流程：

1.从数据库（GenBank,EMBL,DDBJ等）中查询目标酶在不同物种中的编码基因信息和序列（或者相关生物的基因组数据）。

2.分析相关的基因（同源基因或物种相近的基因）序列，从中寻找目标酶的编码基因的全ORF或EST序列。

3.设计引物进行扩增或者进行基因合成，表达分析。

实例克隆碱性脂肪酶基因：

1查阅现有的相关碱性脂肪酶报道文献，了解碱性脂肪酶的信息。

2可在GenBank,EMBL,DDBJ数据库中检索碱性脂肪酶基因信息。

以GenBank为例检索。

在http:

//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/的检索框里输入alkalinelipase如图:

搜索的结果如下：

然后下载相关的alkalinelipase基因序列，在vectorNTI（或者NNASTAR等DNA分析软件）分析基因的ORF等信息。

如没有相关模板用来扩增，则可以直接将分析的NC_007195，和NC_011585.1基因的编码框进行全基因合成，进行基因表达分析。

在有特定的DNA模板的情况下，可以将来源相近的菌株的相关脂肪酶基因利用ClustalX进行比对，需找同源区域设计引物单次或多次扩增获得全长基因。

该方法关键在于能找到多个基因的同源片段，或者能找到目标酶一致性较高的基因。

设备：

计算机，PCR仪，紫外成像系统等

周期短，耗费少，操作简单

受现有的基因资源和研究者水平限制，有点机会主义。

五利用基因工程技术开发新基因资源

天然酶的性能是其对自然环境适应的结果，通常不能全面满足科研和工业生产的要求。

因此利用新兴的基因工程技术对天然酶基因进行分子改造也是获得新的基因资源很好的途径，也是我们研究的重点。

定向进化技术是研究者从基因水平改造蛋白质的最常规的手段之一。

常规的方法有：

基因突变（定点或随机突变），基因重组，融合酶等方法。

但盲目的进行分子改造，筛选效率低，费时费力。

因此生物信息学与实验检测相结合，为蛋白质序列改造设计提供可靠的预测模型，使得研究者能以更具目的性的半理性方式来对基因进行改造，获得有实际应用的新基因资源。

对现有基因和同源的基因ClustalX,vectorNTI,DNASTAR进行比对，分析总结个基因的异同可能导致蛋白质上的差异，然后通过smart（http:

//smart.embl-heidelberg.de/）对各基因进行结构域分析，再利用SWISSMODEL对其进行三维同源建模，分析模型，选取位点进行突变，或者选取不同的DOMIAN进行重组，先利用prosa2003软件进行能量分析，然后实验验证，PCR扩增构建新基因，并进行基因表达分析。