生物公司内部-荧光定量PCR的全面SOPWord格式文档下载.doc
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（用DEPC水和无水乙醇配）
清洗RNA，去除杂质
10009164
红细胞裂解液
去除红细胞
BD
MG0048
DEPC水
溶解RNA沉淀
生工
DD1005
逆转录相关试剂
dNTPMixture（10mM）
DNA聚合酶的底物
Takara
D4030RA
RTaseM-MLV（RNaseH-）
RNA反转录酶
D2639A
RNasinInhibitor（40units/μl）
RNA抑制剂
D2313A
RandomPrimer
随机引物
D3801
Q-PCR反应相关试剂
SYBRPremixExTaq（2×
）
荧光染料
DRR420A
DeoxyribonucleaseI（DNaseI）
DNA酶
D2210
[实验仪器]
名称
型号
国别
PCR扩增仪器
Bio-rad
PTC-100
美国
匀浆机
IKA
T8
德国
微量核酸蛋白检测仪
ABI
7500
实时荧光定量PCR仪
NanoDrop
ND-1000
3.Q-PCR实验操作流
3.1.实验原理（简单描述）
通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。
在实时荧光定量PCR反应中，引入一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。
每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，可通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。
3.2.实验总体注意事项
3.2.1.为得到最佳的实验结果，实验人员要尽可能减少样品间交叉污染的可能，避免将核酸从一个实验带入下一个实验。
以下措施有助于避免实验污染问题：
3.2.2.用稀释的漂白剂或净化剂以及75%酒精抹擦工作台。
3.2.3.理想的条件是在指定地配有紫外灯的超净室、罩式或台式超净台中准备样品，如果没有要确保操作台的洁净。
3.2.4.在样品准备和配制反应液过程中勤换手套。
3.2.5.使用专门的移液器和枪头，勤用稀释的漂白剂清洁移液器。
3.2.6.只使用PCR级的水和PCR专用试剂进行PCR实验。
3.2.7.用带旋盖的EP管稀释和配制反应液。
3.2.8.除了注意以上事项，在进行PCR实验时，还应准备一个无模板的对照来验证有无污染发生。
3.2.9.为最小化实验结果的统计学偏差，先制备混合反应液，建议所有样本有三个重复。
大剂量包装的反应试剂，使用前进行分装，尽量减少试剂的反复冻融。
3.3.标准步骤:
基本流程：
RNA的提取→反转录成cDNA→引物设计→Q-PCR的扩增
3.3.1.不同样本RNA抽提：
A组织样本，先用液氮研磨破碎或者加TRIZOL溶液后用匀浆机破碎。
一般需要客户提供动植物组织30-50mg（如黄豆大小），如果组织完整需要先将其剪碎至小块状以便于匀浆，加1mlTRIZOL，根据提供的样本量以此增加或减少加入的TRIZOL量。
租用平台的匀浆机，在冰上操作，用PBS清洗匀浆机机头，用纸擦干，伸入1.5mlEP管至TRIZOL溶液2/3处每次匀浆3-5秒，防止机头过热，直到明显组织块均破碎，每换一个样本匀浆都要清洗机头。
B全血样本，先以1:
3-1:
5（1ml样本加入3-5ml裂解液）加红细胞裂解液至样本中，室温静置10min，3500转6min，弃上清后加TRIZOL溶液。
一般全血样本2-3ml对应1mlTRIZOL。
C细胞样本，细胞一般接种孔板时用细胞计数板计数，1*105-1*106，细胞长到70-80%以上。
贴壁细胞吸掉旧的培养基，用PBS清洗两遍，加入1-2mlTRIZOL铺满孔板或培养瓶瓶底，几分钟后贴壁细胞脱落裂解完全加到EP管中。
悬浮细胞吸到离心管中1200转离心2-3min，吸去废培养基加入1-2mlTRIZOL。
操作流程
1）以加1mlTRIZOL溶液为例，充分混匀，静置10min。
2）4℃12000g离心10min，吸取上清放入新的EP管中，不要吸到沉淀。
3）加入200ul氯仿剧烈振荡15S，然后室温静置5min。
4）4℃12000g离心15min，离心液体分三层（下面是氯仿，中间是油脂，上面是含RNA的溶液），小心吸取上层液体，转移到一个新的EP管中，不要吸取到油脂。
5）加入等体积异丙醇，轻轻混匀，室温静置10分钟（此步不要太剧烈震荡，上下颠倒10下左右即可）。
6）4℃12000g离心10min，弃上清，沉淀用75%乙醇洗涤两次（第一次要把沉淀全部旋起）。
7）4℃7500g离心5min，弃上清，沉淀干燥，风干后用15ul或20ulDEPC水溶解得到RNA原液。
3.4.RNA浓度测定。
3.4.1.RNA纯度鉴定
在平台使用微量核酸蛋白检测仪鉴定得到RNA的浓度，纯度指标（浓度以ng/ul为单位，纯度用A260/A280的比值表示，具体测定流程由平台的工作人员操作并打印出结果详单。
3.4.2.反转录体系操作流程
Step1：
基因组DNA去除（一般根据引物设计是否跨内含子来决定是否去除基因组DNA，如果引物设计跨内含子则不需去除，直接按照Step2往下操作如何去除），去除基因组DNA按以下体系，在无核酸酶的离心管中加入以下组分
反应组成成分
体积
37℃60min；
80℃10min
RNA
3μg
DNAasI（60～80U/μl）
1μl
10×
DNaseIBuffer
1.5ul
RNaseInhibitor（40units/μl）
0.5ul
DEPC-ddH20
补至15μl
Step2：
在无核酸酶的离心管中加入以下组分（如果紧接第一步反应则直接加组分至原离心管中）
15ul体系
70℃10min
RNA（去除基因组DNA）
2μg
RandomPrimer（25um）
然后在冰上迅速冷却2min；
Step3:
在上述体系中再加入如下成分：
10ul体系
30℃10min；
42℃60min；
70℃15min
5×
M-MLVBuffer
5μl
PCRNucleotideMix（10mMeach）
1.25μl
M-MLVReverseTranscriptase
DEPC-ddH2O
1.75μl
cDNA产物在-20℃保存。
3.5.引物设计（具体操作流程参见附件的视频教程）
引物使用Primer5.0软件设计，由invitrogen公司合成。
引物设计原则：
1）PCR扩增产物长度：
80-150bp最为合适（可以延伸至300bp）。
2）引物长度一般在17-25碱基之间，上下游引物不能相差太大。
3）G+C含量在40%~60%之间，45-55％最佳。
4）TM值在58-68度之间。
上下游引物的TM值不能相差太大。
5）碱基要随机分布，尽量均匀。
3′端不可修饰，而且要避开AT，GCrich的区域，避开T/C或A/G连续结构（2-3个）。
引物自身不能有连续4个碱基的互补。
引物之间不能有连续4个碱基的互补。
引物末端碱基为G或C。
6）引物设计避免DNA污染，最好跨外显子接头区。
7）一般可设计2-3对引物可供选择。
预实验选出最佳引物。
8）引物特意性验证，用blast（操作步骤见附件中的教程）。
3.6.Q---PCR反应
两步法反应如下：
）
10.0ul
（20ul体系）
95℃30秒；
95℃5秒；
60℃30秒；
n=40Cycles。
PCRForwardprimer（10uM）
0.4ul
PCRReverseprimer（10uM）
ROXRefereneDye（50x）
DNA模板
2.0ul
DEPC-ddH2O
6.8ul
3.7.数据分析
定量结束后，设置阈值和基线，得出Ct值，Ct值是热循环仪检测到反应体系中荧光信号的强度值，ΔCt实验组=（Ct，目的基因-Ct，管家基因）实验组，ΔCt对照组=（Ct，目的基因-Ct，管家基因）对照组，ΔΔCt=ΔCt实验组-ΔCt对照组，2-ΔΔCt即为两组的差异。
4.实验结果的标准
4.1.RNA的质量（包括浓度和纯度）验证：
浓度以ng/ul为单位，样本组织的提取浓度>
200，细胞提取的浓度>
30，纯度一般A260/A280在1.8-2.0之间为标准，实际实验范围可适当放宽为1.7-2.1之间。
严格按照提取RNA步骤，减少盐离子的影响。
4.2.溶解曲线，扩增曲线
4.2.1.溶解曲线
主要是看是否存在非特异性扩增，如果是单峰，且出峰位置是需要的退火温度，可以确定扩增的产物是单一，特异性的，则该结果可用（图1为标准的溶解曲线）。
如果出现多峰或退火温度不对，则可能是出现引物二聚体或者非特异性扩增。
图1.溶解曲线
4.2.2.扩增曲线
图中x-轴表示PCR循环数，y-轴表示扩增反应的荧光值，与反应管中扩增产物的量有比例关系。
扩增曲线显示2个阶段，指数增长阶段和之后出现的非指数平台阶段。
在指数增长阶段，每个循环PCR产物量大约增加一倍。
然而，随着反应的进行，反应体系组成成分的消耗，其中的一种或多种成分限制反应。
此时，产物增长速度变慢，反应进入平台期。
反应最初，虽然产物是指数增长，但是荧光处于背景水平，检测不到荧光增加。
当累积了足够的扩增产物，可以产生可检测的荧光信号时，这个循环数叫初始循环数，即CT。
曲线拐点清楚，特别是低浓度样本指数期明显，扩增曲线整体平行性好，基线平而无上扬现象，低浓度样本扩增曲线指数期明显。
各管的扩增曲线平行性好，表明各反应管的扩增效率相近（图2为标准扩增曲线）。
可疑样本是指曲线在37个Ct值后出现上涨且平台趋势不明显或上涨幅度比较低的标本。
图2.扩增曲线
4.2.3.CT值
CT值范围一般在15-35这个范围内比较合适，内参基因的CT值一般在15-20，目的基因的CT值在35内都是可信的，超过35个CT那么就算它没有扩增了，如果15之前起峰，那么就是模板浓度太高所引起的。
所有样本做三个平行重复，重复之间的CT值正负0.5之间可用。
5.实验结果的提供形式
5.1.实验报告（一般为实验流程）
实验结果（标准模板可为excel格式，包含以下几个内容，见提供的模板）
⒈标本对照表（一般同一个客户只有标本编号不同，其他都相同）
序号
标本
种属
标本形式
标本来源
原始标
本编号
标本数量
保存条件
检测方法
检测指标
1
2
3
2.样本浓度检测信息
样品编号
浓度ng/ul
260/280
A
1034.86
1.99
B
……
C
D
3.引物序列信息
引物
序列
Actb内参
Forward
TTCGTTGCCGGTCCACACCC
Reverse
GCTTTGCACATGCCGGAGCC
A指标
B指标
C指标
6.各检测指标Ct值及△Ct等（包括目的基因和内参）
7.扩增曲线和溶解曲线（目的基因和内参）
8.数据分析
包括：
8.1.每组结果分析的柱状图
8.2.误差线
8.3.对整个实验结果的初步总结（就是每个组的表达情况，以及与其他组的区别）
三、实验中遇到的常见问题及解决方案
1.Q：
RNA的质量不好，浓度低，纯度不好
A：
浓度低可能是提供的样本量少，或者提取过程中有污染导致RNA降解。
A260/A280的比值在1.8-2.0之间，太低说明有蛋白污染，太高说明核酸有降解。
如果样本量少，可适当减少TRIZOL溶液，提取中需要的EP管，枪头均确保是无RNA酶的，并且操作过程严格按照步骤所写，最好可以在超净台中操作，条件不允许时，也需保证操作台的清洁，操作人员需带上口罩。
2.Q：
无CT值（信号）出现
1）反应循环数不够。
一般都要在35个循环以上，可根据实验情况增加循环（如至45cycles），但高于45个循环会增加过多的背景信号。
2）引物降解。
可通过PAGE电泳检测其完整性。
3）引物的设计优化。
4）模板量不足。
对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。
5）模板降解。
避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
3.Q：
CT值出现过晚
A：
1）1.扩增效率低，反应条件不够优化。
2）提取液的残留会抑制PCR反应，提取RNA过程中要减少提取液的残留；
3）设计更好的引物；
适当降低退火温度；
增加镁离子浓度等。
4）2.PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。
4.Q：
熔解曲线不止一个主峰
1）引物设计不够优化。
应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
2）引物浓度不佳。
适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。
3）镁离子浓度过高。
适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。
4）模板有基因组的污染。
RNA提取过程中避免DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。
5）产物太长，一般采用80-150bp的产物长度。
5.Q：
实验重复性不好
1）.加样不准确。
2）仪器在样品上温度条件有差异，即温度均一性不好。
3）模板浓度低。
样品初始浓度越低，重复性越差，应减少样品的稀释倍数。
6.Q：
阴性对照也出现明显的起飞
1）应该是mix或水被污染。
2）引物二聚体的出现。
用SG法在35cycles以后阴性出现起飞属正常情况，可配合熔解曲线进行分析。
3）如果使用了ROX校正，则可能是ROX的降解所造成。
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