香菇多糖的分离纯化结构链构象和生物活性的研究进展.docx

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香菇多糖的分离纯化结构链构象和生物活性的研究进展

香菇多糖的分离纯化、结构、链构象和生物活性的研究进展

张阳阳a李生a王小华a张丽娜a*PeterC.K.Cheungb

（a武汉大学化学系武汉430072。

b食品自然科学，生物部门，中国香港大学，中国香港）

摘要：

香菇多糖b-（1-3）-D-glucan是从食用香菇香菇子实体分离提取的一种多糖，众所周知，它能激活调节人类的免疫系统因而具有很强的抗癌的生物活性。

然而,其分离纯化技术中的难点以及缺乏透彻的了解香菇多糖分子结构和功能的关系，使其广泛的药效受限制。

本文旨在探讨不同研究的领域进行了香菇多糖在过去的40年里,包括它的提取及纯化方法本文主要探讨了过去40年里香菇多糖在不同研究领域的分离纯化方法、结构分析、分子链构象以及它的流变特性和生活活性特别是抗癌的药性。

大约引用了156篇文献讨论了香菇多糖的研究进展。

关键词:

香菇多糖b-（1/3）-D-glucan提取构象流变性质生物活性Lentinus香菇

1前言

在二十一世纪,利用食物中的自然资源和工业药物已成为国际前沿性技术，它们具底有毒性、激活调节人体的免疫系统的特异性高等特点。

蘑菇是一种真菌，已经长时间作为食物,也是东方药物中的活性成分。

蘑菇中最多的成分香菇多糖可以提高人类的免疫力，具有抗癌和抗病毒的作用。

香菇多糖是一种最广泛的食用蘑菇，因为它味道鲜美营养价值高，在中国、日本和其他亚洲国家大量种植,从香菇中提取的香菇多糖b-（1/3）-D-glucan药用功效（Cheung,2008）显著，在中国和日本它被誉为香菇。

日本一些学者已经证明了香菇多糖抗癌的生物活性（Chihara,Maeda,Hamuro,Sasaki,&Fukuoka,1969）,因此香菇多糖引起的重大关注，在日本学者研究的,许多研究人员展示了香菇多糖强大的抗癌生理活性，它通过激活人体免疫细胞如T细胞、白细胞、吞噬细胞来杀死癌细胞。

细胞和巨噬细胞（Freunhauf,Bonnard,&Heberman,1982；Gergely,Vallent,Bodo,Feher,&Kaneko,1988;Hamuro、Röllinghoff,&Wagner,1980;Ladányi,Tímár,&Lapis,1993;Maeda&Chihara,1973）.。

最近,香菇多糖广泛用于可选择性医学和饮食补充。

虽然近四十年香菇多糖因其抗癌和抗滤过性病原体疗效显著而闻名，但是它分离纯化困难，链构象不明，结构和生物活性之间的关系不明确，阻碍了疗法的发展。

因此,基本的了解它的化学结构,链构象及生物活性是香菇多糖成功应用于治疗疾病的关键。

最近,我们实验室利用激光光散射法（LLS）,粘度测定法、分子排阻色谱结合LLS法（SECeLLS）、13C核磁共振波谱法等方法，测定了香菇多糖的分子量和链构象并且证明了香菇多糖在水溶液中的以三重螺旋的链构象存在（Wang,Xu,&Zhang,2008;Zhang,Li,Zhou,Zhang,&Chen,2002;Zhangetal.,2001）。

此外,该多糖在水、二甲基亚砜（DMSO）混合物和氢氧化钠溶液或140℃水中会由三重螺旋的链构象分解成单一随机螺旋（Wangetal.,2008;Zhangetal.,2002;Zhang,Xu,&Zhang,2005）。

有趣的是香菇多糖不同的构象抗肿瘤活性不同。

因而，当香菇多糖由三重螺旋分解为单一随机螺旋时,其抗肿瘤活性下降显著或消失。

香菇多糖的抗肿瘤活性与它的三重螺旋构象、中等分子量和结合的蛋白质有很大的关系（Unursaikhan,Xu,Zeng,&Zhang,2006;Zhang,Li,Xu,&Zeng,2005;Zhang,Xu,Unursaikhan,&Liu,2005）。

本文献主要集中回顾了当前香菇多糖的提取及纯化方法链构象和结构与生物活性关系。

2分离纯化的方法

香菇多糖存在于真菌细胞壁，其提取方法的选择要视细胞壁结构的情况而定。

通常,香菇多糖的提取分为两大类:

一个是溶剂萃取法,用热水、碱液、聚乙二醇,另一个使用超声波或超高压提取

多糖。

（Chihara,Hamuro,Maeda,Arai,andFukuoka（1970）,Chiharaetal.（1969））第一种提取方法是热水提取法，此方法近期已被改善（Yap&Ng,2001）。

先用热水粗提香菇多糖，获得香菇多糖粗提物，随后,浓缩提取物，醇析，用碱性溶液溶解提取物，过滤，用酸中和提取物。

该提取物可以通过Sevag方法在氯仿混合液中脱蛋白进一步纯化。

香菇多糖产品在真空中冷冻干燥保存。

提纯干燥的产品为有分支机构（1-3）-b-D-葡聚糖,命名为香菇多糖。

通常,用热水和有机溶剂分离香菇多糖产率低只有0.12%（Lu,2006）。

我们的团队最近建立了用1.25MNaOH和0.05%NaBH4的混合碱液从香菇菌丝体中提纯香菇多糖的新方法（Wangetal.,2008;Zhang,Zhang,&Cheng,1999;Zhangetal.,2001;Zhang,Xu,Unursaikhan,&Li,2005）。

香菇多糖的得率上升到5%,并且采用一种triple-helix构造（Wangetal.,2008）。

这是一个“绿色环保”的过程,而且此方法过程简单,高产率，高品质，高效率，低成本。

此外,提纯的香菇多糖储存时间长（超过1年）,室温下，易溶于水。

最近,超高压渗透膜已经应用于提取香菇多糖（Du,Yang,Wen,Tang,&Li,2008）。

该方法包括在超高压环境下用水从香菇干粉中提取香菇多糖，之后跟传统的提取方法一样，经过过滤、浓缩,和醇析，干燥等步骤得到纯的香菇多糖。

超高压力增加了渗透膜的两侧的压差，从而加快萃取,同时它也可以杀死一些有害微生物。

这是较短的过程,没有高温和碱性液体下处理，不会降低香菇多糖的生物活性。

Minato等人已经研究了香菇多糖在酶联免疫吸附（ELISA）检测方法,利用anti-lentinan抗体中的稳定性（Minato,Mizuno,Ashida,etal.,1999;Minatoetal.,2001;Minato,Mizuno,Terai,&Tsuchida,1999）。

在20℃储存下,7天后香菇多糖的干量从12.8毫克减少到3.7毫克,但是在5℃储存下较少9.3毫克此外,glucanase（香菇多糖分解酶）的活性有助于香菇多糖降解,在20℃下glucanase的活性比在低温下高，因而低温保存更好。

3化学结构

天然聚合物的结构非常复杂,它们有不同的分子结构,因而生物活性也不同。

多糖的化学结构由组成它的单糖的种类，单糖链的的构象，糖苷键连接的位置，单糖的排列顺序决定。

（Zhang,Cui,Cheung,&Wang,2007）.单糖的种类分析是水解断开糖链的糖苷键，分馏获得单醣,和用核磁共振的方法测得单糖的种类和含量（Carboneroetal.,2008;Chaubey&Kapoor,2001;Dengetal.,2000）.糖苷键的连接位置是通过甲基化分析法（Harris,Henry,Blakeney,&Stone,1994;

Mischnick,Lange,Gohdes,Stein,&Petzold,1995;Needs&Selvendran,1993）,史密斯控制降解分析法（Dengetal.,2000）和酶解法（Hrmova&Fincher,1993）确定。

anomerity（α或β）的留,可以通过每个糖的核磁共谱（Cui,2005）和红外光谱法（Kiho,Sakushima,Wang,Nagai,&Ukai,1991）。

分支程度（DB）和聚合度（DP）可由一维和二维核磁共振光谱和GCeMS分析法确定（Gidley,1985;Kimetal.,2000;Tao,Zhang,Yan,&Wu,2007;Zhangetal.,1999）。

SasakiandTakasuka表明香菇多糖的结构是一个以α（1-3）β-D-glucan为主链，有两个（1-6）-b–glucop支链，每个分支有五个（1-3）-β-glucopyranoside。

如图1所示（Saito,Ohki,Takasuka,&Sasaki,1977,1979;Sasaki&Takasuka,1976）。

我们的实验室采用高效液相色谱法、红外光谱法及13C核磁共振光谱法证明了香菇多糖是以α（1-3）β-b-D-glucan为主链以（1-6）-glucosyl为侧链。

这香菇多糖单糖的重复单位与真菌细胞外提取的具有三重螺旋链构象的裂褶多糖不同，它是以β-（1-3）-D-glucan为主链，每隔三个β-（1-3）-D-glucan有一个β-（1-6）-D-glucopyranoside支链。

y.张丁晓萍。

/食物的高科技企业e20625（2011）196

图1.香菇多糖的重复单位。

取自Zhangetal.2008b。

4分子质量和链的构象

4.1分子质量

用光散射测量它的平均分子质量为9.5×105～10.5×105（Maeda,Hamuro,&Chihara,1971）用凝胶渗透色谱法（GPC）和quasi-elastic光散射测量法（Suzuki&Wada,1982）测得它的平均分子质量为3×105～8×105。

最近,张翔的研究小组用超声波照射香菇多糖分子使其在水溶液中降解测定了香菇多糖三个片段的分子量，那三个片段子在0.5molNaCl溶液中25℃时用LLS和SEC-LLS方法测定的分子量是3.04×105～18.32×105。

分子比（Mw/Mn）为1.8～2.7。

（Zhangetal.,2001）。

有趣的是香菇多糖在0.5molNaCl溶液中的分子质量Mw是有趣的是在DMSO中的三倍（表1）。

这表明香菇多糖存在,这表明香菇多糖在水溶液中以三重链存在而在DMSO溶液中以单链存在。

表1香菇多糖的分子特性。

取自Zhangetal.,2001

SamplesMwm×10-5（s2）z,m1/2/nmMw,m/Mn,mMw,s×10-5Mw,DMSO×10-5Mw,m/Mw,DMSO

L-FV-I16.32137.11.33.265.582.9

L-FV-I114.68129.31.72.812.9

4.88a

L-FV-I213.96120.31.62.57

4.643.0

L-FV-I312.92114.91.41.924.14a3.1

L-FV-I410.22101.31.32.51—

L-FV-I58.0587.31.22.61—

L-FV-I64.3549.81.31.37—

L-FV-I73.0436.41.30.83—

数据来自秦氏图

4.2链构象

多糖水溶液中展现出不同的链构象例如随机卷曲（Senti,1955）,单螺旋（Zhang&Yang,1995）,双螺旋构（Sato,Norisuye,&Fujita,1984）,三重螺旋（Kashiwagi,Norisuye,&Fujita,1981）,聚合体（Ding,Jiang,Zhang,&Wu,1998）,sphere-like构象（Taoetal.,2007）。

它主要靠分子间的作用力氢键维持它的双螺旋构象。

（Giannotti,Rinaudo,&Vancso,2007）。

多糖的结晶结构可以利用x射线衍射分析。

然而,在正常情况下,多糖的结晶能力差,导致多相的晶体结构。

目前,只有一些有刚性螺旋结构的多糖有规则的晶体结（Deslandes&Marchessa,1980）从x射线衍射结果看，有五种不同的构象（Bluhm&Sarko,1977）如β-（1-3）-D-glucan香菇多糖的单螺旋、双螺旋和三螺旋的晶体结构的和右手三螺旋结构螺距为0.29nm。

此外,香菇多糖的主链β-（1-3）-D-glucan和侧链β-（1-3）-D-glucan的单螺旋结构相互缠绕形成更稳定的胶状结构（Saitoetal.,1977）。

香菇多糖溶解在尿素的冷溶液中再用蒸馏水透析可由单螺旋转化为三螺旋构象（Saitoetal.,1979;Saitoetal.,1987;Saito,Yoshioka,Yakoi,&Yamada,1990）.有β-（1-3）-D-glucan侧链的网状结构多糖在凝胶状态时主要以三重螺旋结构存在（Saitoetal.,1990）。

我们的实验室第一次证明,香菇多糖在水溶液中以三重螺旋的构象存在，在DMSO中以散乱的单链构象存在（Zhangetal.,2001）。

实验结果从粘度、光散射实验结果显示香菇多糖在0.5molNaCl溶液中的分子质量Mw为1.87×105～1.20×106由霍温克公式（MarkeHouwink）得[η]¼=7.69×10-6Mw1.32（ml/g）,这是香菇多糖在水中的粘度（表1）。

香菇多糖在DMSO中[η]-Mw关系曲线趋势与在水中的相似，指数为0.5。

香菇多糖在0.5molNaCl溶液中分子量的指数要比在DMSO中的高，显示了香菇多糖在水中无弹性而在DMSO中有弹性。

此外,在香菇多糖的分子量，旋转半径（s2z1/2）和粘度的基础上可以算出水溶液中香菇多糖的构象参数一摩尔香菇多糖分子链伸长长度为2180±100nm螺旋长度为120±10nm，每条主链的长度为0.31nm，与x射线衍射法测得的0.29nm相近。

（Bluhm&Sarko,1977）此外,香菇多糖在水溶液中构象的参数与理论上的三重螺旋的参数相一致。

（Yamakawa&Yoshizaki,1980）因此,香菇多糖在水溶液中以三重螺旋存在而在DMSO溶液中以单链存在（Zhangetal.,2001）。

众所周知,回转半径的定义是点到中心线的距离而动力半径（Rh）可以表征维度大分子与流体之间的相互作用力大小，这有助于描述聚合物分子的形态。

旋转半径（s2z1/2）数值可以描述聚合物的分子形状，直接直接反映了链（Niu,Liaw,Sang,&Wu,2000）。

在SEC-LLS、动态激光散射和粘度结果的基础上在25℃下0.9%氯化钠水溶中香菇多糖的旋转半径（s2z1/2）为0.94，等价于有分支的聚合物或者说是正常形态的聚合物（Wangetal.,2008）。

这与其三重螺旋的弯曲程度和它内部链的缠绕有关，香菇多糖的分子量大（Mw¼=1.71×106），链很长，因此其三重螺旋会弯曲。

通常螺旋的多糖的旋转半径要比直链的回旋半径小，从而旋转半径（s2z1/2）小。

因此得出在25℃水中香菇多糖以旋转的三重螺旋存在。

内部支链的相互缠绕和原子间的相互作用力（AFM）维持了香菇多糖三重螺旋的构象。

图2显示香菇多糖在25℃等离子水中原子显微镜下图像（Wangetal.,2008）。

香菇多糖分子在水里展览蠕虫状的直线和曲线交叉的形态（即多链聚集）还观察到了螺旋交叉的裂褶多糖的在原子显微镜下图像（Stokke,Elgsaeter,Brant,&Kitamura,1991;Stokke,Elgsaeter,Brant,Kuge,&Kitamura,1993）。

香菇多糖和裂褶多糖都有两个或一个β-（1-6）-D-glucopyranosyl侧链每隔5个或3个主链葡萄糖单元，在水溶液中各自以三重螺旋存在。

裂褶多糖在水溶液中,依靠分子内和分子间氢键维持。

支链的存在和数量对葡聚糖物理性质有重要意义。

裂褶多糖的支链与水分子间的氢键起关键作用（Okobira,Miyoshi,Uezu,Sakurai,&Shinkai,2008）。

有两种氢键的类型，一种是侧链、主链与水分子之间的氢键，一种是支链之间的氢键，它们是维持三重螺旋分子构象的主要作用力（Zhang,Xu,&Zhang,2008a,2008b）近期发现，香菇多糖水溶液温度由7℃到9℃时，键能急剧下降，表明氢键的数量大幅降低，因此香菇多糖的构象由规则的三螺旋结构变为不规则的螺旋结构。

表明香菇多糖分子周围的水分子因与其支链形成氢键流动受阻。

图2AFM的图像和25℃水溶液的理解图。

取自Wangetal.,2008.

4.3构想的转变

香菇多糖螺旋的主要动力是分子内氢键，三重螺旋构象也是存在分子内氢键的结果，因此破坏了分子内氢键就能导致螺旋构象发生转变。

分子构象的转变受溶剂、温度和pH值的影响。

香菇多糖既能溶于水中也能溶于DMSO中，根据上文所述，香菇多糖在水溶液中以三重链存在而在DMSO溶液中以单链存在（Zhangetal.,2001）。

在25℃下水和DMSO混合溶液中，当水的质量分数减少到0.15（Zhangetal.,2002）图3显示了在不同水的质量分数的水和DMSO混合溶液中13C核磁共振光谱。

三重螺旋和单链在13C核磁共振光谱的区别是螺旋时在86.3ppm主链β-（1-3）的C3峰值几乎消失，螺旋到中间状态时61.0ppm的C6为不对称的宽峰，随着螺旋增强C6的峰面积越大，在螺旋状态由于形成分子内分子间氢键使碳原子的峰值降低或消失。

香菇多糖在不同浓度氢氧化钠中存在不同链构象（Zhang,Zhang,&Xu,2004）。

香菇多糖在NaOH质量分数介于0.05mol-0.08mol溶液中时快速不可逆的解螺旋变性，然而变性的香菇多糖在15℃的室温下，用水在用纤维制成的透析管中透析，7天后可重新形成三重螺旋结构。

在130℃-145℃的热水中香菇多糖也会发生累似的不可逆的解螺旋过程（Wangetal.,2008）。

有趣的是,除了可以观察解螺旋的过程，在水的不同质量分数中的水和DMSO混合溶液中还可以观察到香菇多糖链的断裂和形成。

水的质量分数由0到1.0范围内，当W（H2O）<0.1时，混合液的粘度与纯的DMSO一样，此时香菇多糖以单链自由状态存在（Xu,Zhang,Zhang,&Wu,2004）.当W（H2O）=2.5时，混合液的粘度开始减小表明氢键开始形成链开始收缩，当W（H2O）>2.5时混合液的粘度继续减小，分子间的作用力继续增大，直到分子链螺旋链形成三重螺旋构象。

香菇多糖的构象在高温的水和DMSO混合溶液中有多个转变，图4中多糖溶液（5毫克/毫升）在水和DMSO混合溶液的余热显示了香菇多糖对温度的依赖性。

在所有水和DMSO容积比的混合溶液中香菇多糖的链构象有两种转换方式。

第一种香菇多糖构象的转换方式（T1）出现在温度低于45℃由高度有序的三重螺旋变为杂乱无序的三重螺旋结构（triplehelix-II），这是由于香菇多糖的支链与水分子间的氢键断裂造成的。

第二个转变为香菇多糖在温度高于80℃的DMSO和水混合溶液中，糖链有三重螺旋解螺旋变为松散的单链。

当温度升高到一定程度，侧链间的作用力可以维持稍微松散的无序的螺旋（triplehelix-II）构象，第二种构象转变是由于香菇多糖的分子间氢键分子内氢键全部断裂导致的。

图3香菇多糖L-FV-IA在不同水-DMSO混合液的13C核磁共振光谱，WDMSO0.3（A）0.8（B）,0.85（C）,并在DMSO（D）。

取自Zhangetal.,2002。

图4VP-DSC探测到的香菇多糖在水-DMSO混合液多余的热量的温度依赖性。

图上显示了WDMSO值

5流变性能

5.1香菇多糖的稀溶液

聚合物溶液可分为三个浓度区域（Liu,Cheng,&Qian,1995）在极稀的溶液中聚合物单链互相分离,当浓度的升高多糖单链开始重叠,最后形成浓缩液。

链的开始重合和缠绕的相应的聚合物浓度称为链重叠或相互作用的的临界浓度（c*）（Lapasin&Pricl,1995;Morris,1995;Morris,Cutler,RossMurphy,Rees,&Price,1981）。

临界浓度由链条大小、粘度、剪切模量和剪切存储模式等的物理性质决定（Berry&Fox,1968;Desbrieres,2002;Xu,Liu,&Zhang,2006）。

多糖多通过不连续变化的零比粘度（hsp,0）和反重叠参数c[η]也可以估计决定c*的值（deGennes,1979;Launay,Cuvelier,&Martinez-Reyes,1984;Launay,Doublier,&Cuvelier,1986;Li&Aoki,1997）。

分子量为1.75×106用螺旋香菇多糖分子量的c*值约为3.8×10-4g/ml（Xu,Xu,Zhang,&Zhang,2008）。

香菇多糖与大多数食用多糖相比,c*值要小的多，例如杂多糖右旋糖酐静脉滴注,瓜尔胶、刺槐豆胶、海藻酸钠、羧甲基直链淀粉和土豆多糖（Launayetal.,1986;Morrisetal.,1981）,也低于均一多糖黄原胶和裂褶多糖等。

图五中比较了香菇多糖与四种不同分子量的裂褶多糖的零比粘度（hsp,0）的大小。

香菇多糖的粘度与裂褶多糖的类似，因此链的刚性一样，低浓度下两者零比粘度（hsp,0）都随分子量的增加而减小（Xuetal.,2008）。

5.2浓溶液的性质

从真菌中提取的多糖的是很多产品的添加剂，特别是食品和药物行业，因为它安全无毒副作用并且功能多样性。

香菇多糖为三重螺旋构象能形成“胶”,但与黄原胶和三螺旋裂褶多糖成胶的条件不同。

香菇多糖在水溶液中在室温下不用添加任何化学物质,便可形成凝胶，

而后者必须添加特定的离子或不成胶的多糖的条件下才成胶（Annable,Williams,&Nishinari,1994;Fang&Nishinari,2004）。

已观察到25℃度水中香菇多糖成胶的过程，并且成胶点也用比例法得出。

（Flory,1953;deGennes,1979;Stockmayer,1943,1944）Winter-Chambon理论能准确的判定香菇多糖水溶液的胶点，香菇多糖的胶点要比其他合成糖（Li&Aoki,1997）和其他单链多糖的胶点低得多,这是由于香菇多糖的三重螺旋使其氢键丰富。

香菇多糖的胶点随着它分子量的增加而急剧减小，在低温下成胶难在高温下成胶容易。

此外，凝胶温度随分子量和浓度的减小而减小。

分子量不变时，随着浓度的增加凝胶点指数下降（Zhangetal.,2008b）。

表二总结了胶点附近香菇多糖水溶液的特征。

键能G’和粘度η*在7℃-9℃最低，这是由于形成了刚性强的胶体，侧链与水之间，侧链与侧链之间的氢键断裂形成了无序的胶体结构。

图5。

香菇多糖和四个不同分子量裂褶多糖零比粘度的比较

图6。

25℃香菇多糖不同浓度的照片3.0×103（g/mL）和6.0×25（g/mL）。

取自Zhang,Xu,Xu,&Zhang,2007。

6生物活性与分子结构的关系

6.1抗癌和其他生物活性

香菇多糖以其强大的抗癌作用而闻名，自日本学者第一次报告后（Chiharaetal.,1970,19