第二章临床生物化学实验室基本技术与管理2.docx

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第二章临床生物化学实验室基本技术与管理2

第二章临床生物化学实验室基本技术与管理

实验室的基本技术与管理是临床生物化学检验工作的重要基础。

本章所涉及的实验室基本技术与管理主要是应用于临床生物化学检测的分析技术与质量管理，目的在于加强基础，提高生物化学检验的质量。

对于实验室的其他基本知识，基本技术以及实验室的管理方法，可参阅其他相关教材。

第一节常用临床生物化学分析技术

临床生物化学分析技术很多，常用的主要有光谱分析技术、电泳技术、离心技术、层析技术、电化学分析技术等。

一、光谱分析技术

利用各种化学物质所具有的发射、吸收或散射光谱谱系的特征，来确定其性质、结构或含量的技术，称为光谱分析技术。

根据光谱谱系的特征不同，可把光谱分析技术分为发射光谱分析、吸收光谱分析和散射光谱分析三大类。

在临床生物化学检验中，光谱分析是一类十分重要的技术，应用极为广泛。

分光光度法（spectrophotometry）

I.光谱分析法（photometry）

1.定义：

根据物质吸收、发射或散射辐射能而建立起来的一类分析方法。

2.光的基本性质：

高速传播的电磁辐射；

具有波动性（=c/v）和微粒性（E=hv）；

短波能量大，长波能量小

3.物质对光吸收的基本原理：

能量转移----当光辐射通过某种物质时，组成该物质的分子与光子发生“碰撞”，光子的能量就转移至分子、原子上，使它们由基态（低能态）跃迁到激发态（高能态），这种跃迁称为激发。

选择吸收----组成物质的分子仅吸收与其内能变化（基态与激发态能量差）相对应的波长或频率的光，所得到的光谱称为吸收光谱。

发e.g.,

射荧

光光

谱

吸

收激

光发

谱

激发态（E1）

能量释放----处于较高能态的分子（激发态分子）不稳定，当其返回基态时，以热或发射光谱的形式将能量释放出来。

所发射出的相应光谱，称分子发射光谱。

E=E1-E2=hv

基态（E0）

4.分类

（1）吸收光谱分析法：

根据溶液能吸收由光源发出的某些

可见、紫外分光光度法（visibleandultravioletspectrophotometry）*

原子吸收光谱法（atomicabsorptionspectrophotometry）：

微量金属元素

红外分光光度法

波长的光后所形成的特征光谱来鉴定该物质的性质和含量的方法。

（2）发射光谱分析法：

根据物质受到热能或电能等的激发

火焰发射光谱法（flameemissionphotometry）：

碱金属/碱土金属元素

荧光光谱法（fluorometry）：

少量无机物、酶活力、激素等

后所发射出的特征光谱来进行定性及定量分析的一种方法。

（3）比浊/散射光谱分析法：

测定光线通过溶液混悬颗粒后

的光吸收或光散射程度的一类定量方法。

比浊法（turbidimetry）：

在光源的光路方向上测定透射光强度（透射光&散射光）与入射光强度的比值和胶体溶液中质点浓度间的关系。

散射测浊法（nephelometry）：

在光路的垂直方向上测量散射光强度和胶体溶液中质点间的关系。

5.特点：

灵敏度高；测定简便、快速；试样不被

破坏等。

II.可见、紫外分光光度法

1.定义：

根据物质分子对于200nm~700nm光区

电磁辐射的吸收特性进行分析的方法。

可见光：

400~700nm,有色物质溶液

紫外光：

200~400nm,无色物质

2.特点：

灵敏度高（10-4~10-7g/ml）;选择性强；

精确度和准确度高；

仪器设备简单，操作易掌握

3.吸收光谱

（1）光谱的产生：

化合物分子的价电子跃迁

（2）吸收光谱曲线：

电子跃迁的吸收波长和吸收强度可用仪器测定，在可见、紫外光区内绘制或扫描得到一条以波长（）为横坐标,吸光度（A）为纵坐标的吸收曲线。

4.光吸收的基本定律（Lamber-Beer’sLaw）

（1）定律：

单色光通过吸光溶液后，吸光度与浓度或厚度之间呈正比关系。

Lamber定律：

说明吸收与厚度间的关系

Beer定律：

说明吸收与浓度间的关系

（2）表达式：

-lgIt/Io=abc*It/Io为透光率（transmittance,T）（%）

A=-lgT=abc*A为吸光度（aborbance）

*a为吸光系数（absorptivity）,即吸光物质在单位浓度及单位厚度时的吸光度。

b为液层厚度

c为溶液浓度（concentration）

5.比色法（colorimetry）

（1）定义：

用可见光作光源，比较溶液的颜色深浅度以测定所含有色物质浓度的方法

（2）所用仪器：

分光光度计（spectrophotometer）

（i）基本原理：

溶液中的物质在光的照射激发下，产生了对光吸收的效应，物质对光的吸收是具有选择性的。

各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱，故当某单色光通过溶液时，其能量就会被吸收而减弱，光能量减弱的程度和物质的浓度有一定的比例关系。

（ii）结构组成（以722分光光度计为例）

光源：

可见光区的光源为钨灯，波长范围是320~1000nm。

（紫外光区的光源为氢灯或氘灯，波长是200~320nm）

单色器：

一种将光源产生的混合光分解为单一波长的光学系统。

一般是根据通过棱镜的折射或光栅的衍射而获得的。

试样室：

由比色皿座架及光门组成。

可见光区用光学玻璃比色皿（紫外光区用石英比色

皿）

光电管暗盒：

由光电管（可将光能转变为可以放大检测和记

录的电能）和微电流放大器组成。

显示器：

由放大器和读数元件组成。

（3）比色法的定量方法：

（i）标准曲线法：

将一系列浓度不同的标准溶液按照一定操作过程显色后，分别测吸光度（A），以A为纵坐标，浓度为横坐标制标准曲线（至少要5点）。

在相同条件下处理待测物质并测定其吸光度，即可从标准曲线找出相对应的浓度。

（ii）对比法：

将标准品与待测样品在相同条件下显色并测定各自的吸光度。

由于测定体系温度、厚度及入射光波长一致，故标准与待测样品a&b值相等，可用下式比较计算待测样品浓度Cx=CsAs/Ax

III.实验内容

1.可见光分光光度计波长校正

（1）原理：

镨钕玻璃是一种含有金属镨与钕的玻璃制品，在可见光波长范围内，它具有特征性的吸收光谱，吸收峰的波长固定，可作校对仪器波长正确性的依据。

（2）操作：

用镨钕玻璃与空白光路作对照，作出波长从512~541nm的镨钕玻璃吸收曲线，以横坐标为波长，纵坐标为吸光度，每隔2nm作一个点，查找529nm处是否有一个吸收峰的极值，若这个吸收峰的极值相对应的波长大于529nm，则反时针方向调节波长调节螺杆，使这个极值相对应地靠近529nm，一直调到波长误差在允许范围内（5292nm）;反之，吸收峰极值相对应的波长小于529nm，则顺时针方向调节螺杆。

2．红蛋白及衍生物吸收光谱测定（见书）

分光光度计的使用

1．开电源开关，打开箱盖，预热10mins

2．将空白管、对照管、测定管分别装入比色皿

（3/4vol）,并用吸水纸擦干光面外壁。

3．选定波长

4．打开箱盖（光路开关自动关闭），用空白管调

T=0

5．盖上箱盖（光路开关自动打开），再用空白管调

T=100%（若调不到，则可调节灵敏度开关）

6．将选择开关旋至A,此时显示数值应为0，否

则调节“消光零”旋钮调至0。

7．逐步拉出试样架拉手，读取各管吸光度值A。

8．全部测定结束后，取出比色皿（洗净），关闭开关。

二、电泳技术

电泳

Electrophoresis

一、定义

电泳—带电粒子在直流电场中向着电性相反电极移动的现象。

电泳分析技术—利用电泳现象进行物质分离的技术。

二、电泳分析技术发展概况

1809年俄国物理学家Рейсе首次发现电泳现象。

他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极，加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变混浊，即带负电荷的粘土颗粒向正极移动，这就是电泳现象。

 1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。

他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。

 1937年瑞典Uppsala大学的Tiselius对电泳仪器作了改进，创造了Tiselius电泳仪，建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法，并首次证明了血清是由白蛋白及α、β、γ球蛋白组成的，由于Tiselius在电泳技术方面作出的开拓性贡献而获得了1948年的诺贝尔化学奖。

 1948年Wieland和Fischer重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法，对氨基酸的分离进行过研究。

 从本世纪50年代起，特别是1950年Durrum用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后，开创了利用各种固体物质（如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等）作为支持介质的区带电泳方法。

 1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝胶作为支持介质，创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳，极大地提高了电泳技术的分辨率，开创了近代电泳的新时代。

30多年来，聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学和分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分析鉴定技术，是检验生化物质的最高纯度：

即“电泳纯”（一维电泳一条带或二维电泳一个点）的标准分析鉴定方法，至今仍被人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的最后、最准确的手段，即“LastCheck”。

 由80年代发展起来的新的毛细管电泳技术，是化学和生化分析鉴定技术的重要新发展，己受到人们的充分重视。

三、电泳分析技术的分类

1.根据被分离样品的量多少

分析电泳

制备电泳

2.根据电泳电压的高低

常压电泳0～500V

高压电泳500～3000V

3.根据电泳中是否使用支持物

自由电泳—不使用支持物，在溶液中进行。

区带电泳—使用支持物

（1）按支持物的物理性状不同，可分为

①滤纸及其他纤维薄膜电泳，如醋酸纤维素、玻璃纤维、聚氯乙烯纤维

②凝胶电泳，如琼脂、琼脂糖、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳

③粉末电泳，如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳

④丝状电泳，如尼龙丝、人造丝电泳

（2）按支持物的装置形式不同，可分为

①平板式电泳

② 垂直板式电泳

③垂直柱式电泳

4.根据电泳系统pH是否连续

▪连续pH电泳—指电泳过程中pH保持不变，如滤纸电泳、醋纤膜电泳

▪不连续pH电泳—指电极缓冲液和电泳支持物的不同区段也有不同的pH，如PAGE、IFE

优点是在不同pH区之间形成高的电位梯度区，使蛋白质移动加速压缩为一极狭的区带而达到浓缩的目的。

电泳技术的特点:

▪凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分离,并可进行定性或定量分析;

▪样品用量极少;

▪设备简单;

▪可在常温进行;

▪操作简便省时;

▪分辨率高.

电泳技术应用

▪基础理论研究;

▪临床诊断;

▪工业制造.

双向凝胶电泳和质谱技术的建立和联用,提供了蛋白质组研究所需的技术体系,使得蛋白质组的研究成为可能.

四、电泳的基本原理

▪一个质点，如能解离或能吸附带电质点，在电场中便会向正极或负极移动。

▪电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。

许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。

电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。

 为了更好的了解带电分子在电泳过程中是如何被分离的，下面简单介绍一下电泳的基本原理。

在两个平行电极上加一定的电压（V），就会在电极中间产生电场强度（E），L是电极间距离。

 在稀溶液中，电场对带电分子的作用力（F），等于所带净电荷与电场强度的乘积。

 这个作用力使得带电分子向其电荷相反的电极方向移动。

在移动过程中，分子会受到介质粘滞力的阻碍。

粘滞力（F’）的大小与分子大小、形状、电泳介质孔径大小以及缓冲液粘度等有关，并与带电分子的移动速度成正比，对于球状分子，F’的大小服从Stokes定律，即：

                F’=6πrηυ

 式中r是球状分子的半径，η是缓冲液粘度，υ是电泳速度（υ=d/t，单位时间粒子运动的距离，cm/s）。

当带电分子匀速移动时：

F=F’，

              ∴ q•E=6πrηυ

 由此可以看出，迁移率与带电分子所带净电荷成正比，与分子的大小和缓冲液的粘度成反比。

迁移率（Mobility）——带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。

VQ

M=-----------=-----------

E6r

五、影响电泳速度的因素

1.电场强度（E）

E↑→电流↑→热效应→支持介质上的水分蒸发→样品的热变性

E↓→电泳速度慢→延长电泳时间→样品扩散→区带模糊不清→分辨率下降

 电场强度（V/cm）是每厘米的电位降，也称电位梯度。

电场强度越大，电泳速度越快。

但增大电场强度会引起通过介质的电流强度增大，而造成电泳过程产生的热量增大。

电流在介质中所做的功（W）为：

             W=I2.R.t

 上式中：

I为电流强度，R为电阻，t为电泳时间。

 电流所作的功绝大部分都转换为热，因而引起介质温度升高，这会造成很多影响：

 ①样品和缓冲离子扩散速度增加，引起样品分离带的加宽；②产生对流，引起待分离物的混合；③如果样品对热敏感，会引起蛋白变性；④引起介质粘度降低、电阻下降等等。

电泳中产生的热通常是由中心向外周散发的，所以介质中心温度一般要高于外周，尤其是管状电泳，由此引起中央部分介质相对于外周部分粘度下降，摩擦系数减小，电泳迁移速度增大，由于中央部分的电泳速度比边缘快，所以电泳分离带通常呈弓型。

降低电流强度，可以减小生热，但会延长电泳时间，引起待分离生物大分子扩散的增加而影响分离效果。

所以电泳实验中要选择适当的电场强度，同时可以适当冷却降低温度以获得较好的分离效果。

2.离子强度（I）

溶液的I越高，质点的泳动速度越慢，但区带分离度却较清晰。

I↑→缓冲能力越大→缓冲液所载的分电流增加，而样品所载的电流相应减少→电泳速度减慢

缓冲液的浓度可用摩尔或离子强度表示.离子强度低,电泳速度快,分离区带不易清晰,如果过低,缓冲液的缓冲量小,难以维持pH值的恒定;离子强度高,电泳速度慢,但区带分离清晰,如果过高,除了使得电泳速度过慢,还会因为离子强度增加使电泳时的电流变大,增加热量的产生,引起温度改变,对电泳不利。

一般0.02~0.2M之间。

3.缓冲液的pH

pH值决定了化合物解离的程度，也决定了质点所带的净电荷。

 缓冲液的pH值会影响待分离生物大分子的解离程度，从而对其带电性质产生影响，溶液pH值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大，尤其对于蛋白质等两性分子，缓冲液pH还会影响到其电泳方向，当缓冲液pH大于蛋白质分子的等电点，蛋白质分子带负电荷，其电泳的方向是指向正极。

为了保持电泳过程中待分离生物大分子的电荷以及缓冲液pH值的稳定性，缓冲液通常要保持一定的离子强度，一般在0.02－0.2，离子强度过低，则缓冲能力差，但如果离子强度过高，会在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层（即离子氛），由于离子氛与待分离分子的移动方向相反，它们之间产生了静电引力，因而引起电泳速度降低。

另外缓冲液的粘度也会对电泳速度产生影响。

4.电渗（electro-osmosis）——指在电场作用下液体相对于固体支持物的相对移动。

由于支持介质表面可能会存在一些带电基团，如滤纸表面通常有一些羧基，琼脂可能会含有一些硫酸基，而玻璃表面通常有Si-OH基团等等。

这些基团电离后会使支持介质表面带电，吸附一些带相反电荷的离子，在电场的作用下向电极方向移动，形成介质表面溶液的流动，这种现象就是电渗。

在pH值高于3时，玻璃表面带负电，吸附溶液中的正电离子，引起玻璃表面附近溶液层带正电，在电场的作用下，向负极迁移，带动电极液产生向负极的电渗流。

如果电渗方向与待分离分子电泳方向相同，则加快电泳速度；如果相反，则降低电泳速度。

5.分子筛

在凝胶电泳中，分离蛋白质等物质除了利用所带电荷的差异的效应外，还利用了其分子量的不同及形状不同。

5.温度

电泳时电流通过支持介质会产生热量，按焦耳定律，电流通过导体时的产热与电流强度的平方、导体的电阻和通电的时间成正比（Q=I2Rt）

产热可促使支持介质上溶剂的蒸发，而影响缓冲溶液的离子强度。

温度升高时，介质黏度下降，分子运动加剧，引起自由扩散变快，迁移增加。

温度每升高1度，迁移率约增加2.4%。

若温度过高可导致分离样品变性而使电泳失败。

醋酸纤维薄膜电泳

Celluloseacetatemembraneelectrophoresis，CAME

一、醋酸纤维素

是纤维素醋酸酯，由纤维素的羟基进行乙酰化后制得，将它溶于有机溶剂涂抹成均匀的薄膜，待有机溶剂挥发后，即为白色不透明的醋酸纤维薄膜。

厚度：

0.15mm

二、特点

1.吸附作用小

2.电渗作用小

3.需加样量少

4.吸水性差

三、影响醋纤电泳结果的因素

1. 电泳图谱不齐

① 点样时血清点加不均匀

② 薄膜局部干燥

③电泳时供给薄膜的液量不均匀或过少

④缓冲液变质

⑤电泳时薄膜位置不正,与电流方向不平行

2.电泳图谱分离不清

①标本加量过多

② 电流过低

③薄膜结构过分致密，透水性差

④ 薄膜表面干燥

3. 电泳速度慢

①电流过低

②供给薄膜的液量不足

③电泳时温度过低

④缓冲液离子强度过高

⑤薄膜中杂质多

4. 白蛋白区带中间部分不着色，染色不足

可能为染料使用过久或加血清过多

5.γ球蛋白向反方向移动

主要因为电渗现象

可升高缓冲液液面或加大电流量加以改进，并注意两侧电泳槽内缓冲液液面是否在同一水平。

血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳（实验）

[原理]CAME是以醋纤膜（CAM）作支持物的一种区带电泳技术。

将血清样品点样于醋纤膜上，在pH8.6的缓冲液中电泳时，血清蛋白质均带负电荷移向正极。

由于血清中各蛋白组分等点电不同而致表面净电荷量不等，加之分子大小和形状各异，因而电泳迁移率不同，彼此得以分离。

电泳后,CAM经染色和漂洗，可清晰呈现5条区带。

再经脱色，比色即可计算出血清各蛋白组分的相对百分数。

[器材和试剂]

1.器材

（1）醋酸纤维薄膜（8×2mm）

（2）点样器

（3）染色皿，漂洗器，镊子

（4）722型分光光度计

（5）电泳仪：

直流电源整流器，水平电泳槽

2.试剂

（1）巴比妥缓冲液（pH8.6I=0.06）

（2）氨基黑10B染色液

（3）漂洗液：

95%乙醇、冰醋酸、H2O

（4）洗脱液：

0.4mol/LNaOH

[操作]

1.将电泳槽置于水平平台上。

将缓冲液注入电泳槽中两边的电极槽缓冲液的高度要在同一点平面上。

2.在醋纤膜一端欲点样处作好标记，然后将薄膜放进缓冲液中，湿润速度按膜吸收缓冲液的快慢而定，应让其自然浸润。

3．将充分浸透（指膜上没有白色斑痕）的薄膜取出，用滤纸吸去膜上过多的缓冲液。

4．用加样器蘸取血清（约5ul）,垂直印在CAM粗糙面上，待样品全部渗入薄膜内后，移开点样器。

5．电泳

（1）加样后，将薄膜条架于支架两端，无光泽朝下（点样面），点样侧置于阴极端，膜两侧分别塔上纱布，纱布一端垂入缓冲液中。

薄膜应位正，平直无弯曲，加上槽盖平衡5分钟后通电电泳。

（2）正确连接电泳槽与整流器对应的正负极。

开启电源通电。

电压10~15V/cm膜总宽。

电泳40~60分钟，泳动距离约达3.5~4cm时即可断电。

6.染色

电泳完毕后断电，用镊子取出薄膜条投入染液5~10分钟，染色过程中不时轻轻晃动染色皿，使染色充分。

7．漂洗

从染液中取出薄膜条并尽量沥去染液，投入漂洗皿中反复漂洗，直至背景漂尽为止。

此时清晰可见5条色带，待干。

8.定量

（1）洗脱比色：

将各蛋白质区带仔细剪下，分置各试管中，另从空白背景剪块平均大小的膜条置于空白管中。

各管加入0.4mol/lNaOH4ml,于37℃水浴20分钟（不时振荡），待颜色脱净即用波长620nm比色，以空白管调零读取各管吸光度。

（2）计算

吸光度总和（T）

=A+α1+α2+β+γ（吸光度）

血清蛋白组分的相对百分数：

A%=A/T×100%

α1%=α1/T×100%α2%=α2/T×100%

β%=β/T×100%

γ%=γ/T×100%

琼脂糖凝胶电泳

AgaroseGelElectrophoresis

概述

凝胶电泳：

由琼脂、琼脂糖、淀粉胶及聚丙烯酰胺等物质作支持体的电泳。

琼脂糖是从琼脂中提纯出来的，主要是由D－半乳糖和3,6脱水L－半乳糖连接而成的一种线性多糖。

琼脂糖凝胶的制作是将干的琼脂糖悬浮于缓冲液中，通常使用的浓度是1％－3％，加热煮沸至溶液变为澄清，注入模板后室温下冷却凝聚即成琼脂糖凝胶。

琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结构，这种交联的结构使琼脂糖凝胶有较好的抗对流性质。

琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来控制，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。

特点：

1.可以制成非常均匀的凝胶，带电质点在凝胶的孔中泳动。

2.电泳操作方法简便，电泳速度快

3.分辨率高，重复性好，电泳图谱清晰。

4.适用于生化，免疫等定性定量测定

琼脂糖凝胶的特点

（一）优点

1.因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗

2.对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。

3.凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、病毒等大分子物质。

4.透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。

5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定

6.有热可逆性

（二）缺点

1.机械强度差，易破碎，浓度不能太低。

2.易被细菌污染，不易保存，临用前配制。

3.琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。

4.与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。

应用

1.适用于大分子的核酸、核蛋白等的分离、鉴定及纯化

2.临床生化检验中常用于LDH、CK等同工酶的分离与检测

3.为不同类型的高脂蛋白血症、冠心病等提供生化指标

脂蛋白

血清脂蛋白（lipoprotein）的组成

ApoAApoB

蛋白质：

即载脂蛋白

ApoCApoDApoE

甘油三酯（TG）

脂类磷脂（PL）

游离胆固醇（FC）

胆固醇酯（CE）

少量糖

（二）分类

1.按电泳法分

  乳糜微粒（chylomicron,CM）

   -脂蛋白（-位）

   前-脂蛋白（2-位））

-脂蛋白（1-位）

2.按超速离心法分

乳糜微粒（chylomicron,CM）（<0.96）

极低密度脂蛋白（0.961.006）

（verylowdensitylipoprotein,VLDL）

中间密度脂蛋白（1.0061.019）

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