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农杆菌介导木薯“新选048”遗传转化体系的初步建立
摘要
木薯是重要的旱地经济作物及能源植物，广西是我国木薯的主产区，木薯“新选048”品种是广西主栽品种之一，具有抗旱、高产的特点，具有很好的经济价值。
通过农杆菌介导，在优良木薯品种中转入抗逆性基因，获得既高产优质又具抗性的木薯新品种，是木薯育种的有效途径。
本研究通过农杆菌介导，在木薯“新选048”中转入抗逆性基因，获得如下研究结果：
1.以腋芽为外植体的再生体系建立
灭菌：
春秋季节取外植体，以0.1%HgCl2处理12min灭菌效果最好，污染率控制在30%以内，而成活率达到56.7%。
初代诱导培养：
添加KT的培养基外植体萌芽率比添加6-BA和TDZ的要高，最适培养基为MS+KT0.5mg/L，外植体腋芽萌发率可达85.0%，
增殖培养：
细胞分裂素与NAA配比的效果比单使用细胞分裂素或者与赤霉素配比的都好，以MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L培养基为最佳的增殖培养基，增殖率高，平均芽高度最高，可达5cm。
生根培养：
在合适的浓度下，单独添加NAA、IBA、IAA的培养基诱导的生根率都可达到100%，平均根数以MS+NAA0.6mg/L培养基的最多，达6.9条。
移栽：
控制空气湿度尤为重要，相对湿度太大，则容易引起组培苗植株茎段发霉腐烂，影响成活率。
试验中，移栽18d后存活率不足10%，因此移栽技术还需进一步的研究。
2、无菌叶片再生体系的建立
选择无菌叶片诱导愈伤组织，最适诱导培养基为MS+2,4-D5.0mg/L，诱导率可达90%以上，愈伤组织淡黄色透明松软，在进一步培养中容易转化为胚性愈伤组织。
愈伤组织的增殖培养基则以MS+2,4-D3.0mg/L为适宜，增殖率为90%。
愈伤组织分化采用6-BA和NAA配合以及硫酸铜两种处理来诱导不定芽，结果6-BA和NAA配合处理并没有无菌芽的分化，而MS+CuSO4200mg/L处理有不定芽分化，但分化率不高。
3、遗传转化体系的初步建立
以无菌叶片和愈伤组织作为材料进行抗生素选择压的试验，以确定培养材料细胞全部死亡的最低抗生素浓度。
试验结果为叶片抗生素选择压的培养基为MS+3.0mg/L2,4-D+2.3g/LKm，而愈伤组织抗生素选择压的培养基为MS+3.0mg/L2,4-D+2.5g/LKm。
以携带目的基因的根癌农杆菌侵染无菌叶片，以5min为好，GUS瞬时表达率先升高后降低，最高为83.3%；
对愈伤组织转化的效率以10min侵染时间相对较好，GUS瞬时表达率为85%。
共培养时间2d对无菌叶片转化的效率最好，GUS瞬时表达率为77.8%。
研究结果初步建立了农杆菌介导木薯“新选048”的遗传转化体系。
关键词：
木薯；
“新选048”；
组织培养；
遗传转化；
再生体系
PreliminaryConstructionofAgrobacteriumtumefaciens-mediatedTransformationSystemofCassava“Xinxuan048”
Abstract
Cassavaisanimportantdrylandcropsandenergyplants,GuangxiisthemainproducingareaofcassavainChina.Asoneofthemajorvarietiesofcassava,“Xinxuan048”hasfeaturesofdroughtresistanceandhighyieldandhigheconomicvalue.Aneffectivewayofcassavabreedingistotransferresistancegenesintothefinevarietiesofcassava,byAgrobacteriumtumefaciens-mediatedtoobtainnewvarietiesofcassavawithhighyield,goodqualityandresistance.Inthisstudy,resistancegenesweretransferredinto“Xinxuan048”byAgrobacteriumtumefaciens-mediated,mainresultswereobtainedasfollowing:
1.Establishmentofregenerationsystemthattheaxillarybudswereusedasexplants
Sterilization:
theexplantsshouldbetakeninspringorautumn,thebesteffectofsterilizationwastodealwith0.1%HgCl2（Mercuricchloride）treatmentfor12min,whichthecontaminationratecouldbecontrolledwithin30%,whilesurvivalratewas56.7%.
Asaresult,themoresuitableculturemediumforgerminationwerefoundasaddedKT,whichgerminationratecameto85%,thebudssturdyandhad3.5cmhigh.thebudsgrouphadmoreseverebudgerminationglassinmediumaddedTDZ.
Inductioncultureofinitialgeneration:
explantsgerminationofmediumthataddedKTwashigherthanwhichadded6-BAandTDZ,andtheoptimummediumwasMS+0.5mg/LKT,whichthegerminationrateofexplantswasupto85.0%.
Multiplicationculture:
CombinationofCytokininswithNAApayedabettereffectonbudsproliferationthanusedCytokininsonlyorcombinedwithGA3,andtheoptimummediumforproliferationofaxillarybudswerefoundasMS-media+1.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA,whichshowedhighgerminationrate,thehighestaverageheight（upto5.0cm）.
Rootingculture:
therootingratecouldbe100%inproperconcentrationthataddedNAA,IBA,IAAinmediumonly.TheaveragenumberofrootsinMS+0.6mg/LNAAmediumwasmost,whichwas6.9piece.
Transplanting:
Controlledtheairhumiditywasveryimportantintransplantedtissuecultureseedlings.Whiletherelativehumiditywastoohigh,theplantstemsweremildewandroteasily,andaffectedthesurvivalrate.Theresultinthistestshowedabelow10%survivalrateaftertransplanted18d,technologyoftransplantingshouldbefurtherstudied.
2、Establishmentofregenerationsystemofsterileleaves
Sterileleaveswereusedtoinducecallus,andtheresultsindicatedthatMS
+5.0mg/L2,4-Dwastheoptimuminductionmedium,whichtheinductionratewasupto90%,andthecalluswaspaleyellow,transparentandsoftthatcouldbeeasilytransformedintoembryoniccallusbysubculture.
TheappropriatemultiplicationmediumforcalluswasMS+3.0mg/L2,4-D,whichtheproliferationratewasupto90%6-BAandNAAtogetherorCuSO4wereusedtoinduceadventitiousbudsfromcallusdifferentiation,theresultsindicatedthattherewerenodifferentiationofadventitiousbudswhenused6-BAandNAAtogether,whileMS+200mg/LCuSO4coulddifferentiateadventitiousbuds,butthedifferentiationratewaslow.
3.Establishofgenetictransformationsystem
Sterileleavesandcalluswereusedasmaterialsofantibioticselectionpressuretesttodeterminetheminimumconcentrationofantibioticthatcausedallcellsofculturematerialsdeath.TheresultsindicatedthattheantibioticselectionpressuremediumforleaveswasMS+3.0mg/L2,4-D+2.3g/LKm,whileforthecalluswasMS+3.0mg/L2,4-D+2.5g/LKm.
SterileleaveswereinfectedbyAgrobacteriumtumefaciens-mediatedwhichcarriedthetargetgene,andtheoptimuminfectiontimewas5min,the
transientexpressionofGUSgeneincreasedatfirstandthendecreased,upto83.3%.Forcallus,theoptimumtimewas10min,andthe
transientexpressionofGUSgenewas85%.Andtestedaboutthethetransformationefficiencyindifferentco-culturetimeshowedthat2dwastheoptimumtime,upto77.8%.
Thus,genetictransformationsystemofcassavavariety"
Xinxuan048"
wasinitiallyestablished.
Keywords:
cassava;
“Xinxuan048”;
genetictransformation;
regenerationsystem
缩写词
Englishabbreviationusedinthedissertation
缩写
英文全称
中文名称
Abbreviation
FullnameinEnglish
FullnameinChinese
6-BA
6-Benzylaminopurine
6-苄基腺嘌呤
NAA
Naphthylaceticacid
萘乙酸
IBA
Indolebutyricacid
吲哚丁酸
IAA
Indol-3-aceticacid
吲哚-3-乙酸
GA3
Gibberellin
赤霉素
TDZ
Thidiazuron
噻苯隆
KT
6-furfurylaminopurine
6-糠基氨基嘌呤
2,4-D
Dichlorophenoxyaceticacid
二氯苯氧乙酸
MET
Paclobutrazol
多效唑
ZT
Zeatin
玉米素
Km
Kanamycin
硫酸卡那霉素
GM
Gentamycin
庆大霉素
CTX
Cefotaximesodium
头孢噻肟钠
SM
Streptomycin
链霉素
CTRX
CeftriaxoneSodium
头孢曲松钠
AC
ActivatedCarbon
活性炭
目录
1前言1
1.1木薯的经济价值和用途1
1.1.1木薯是淀粉加工的重要来源1
1.1.2木薯茎叶可作加工禽畜饲料的良好原料2
1.1.3木薯的食用价值2
1.2国内外研究现状3
1.2.1木薯的育种研究现状3
1.2.2木薯的组织培养现状4
1.2.3木薯的转基因研究现状5
1.3选题背景及目的意义7
1.3.1选题背景7
1.3.2选题目的与意义8
2材料与方法9
2.1试验材料9
2.1.1植物材料9
2.1.2农杆菌菌株与质粒9
2.1.3主要仪器设备及组织培养试剂10
2.2试验方法12
2.2.1木薯组织培养12
2.2.2叶片再生体系的建立14
2.2.3遗传转化体系的建立15
2.2.4根癌农杆菌侵染液的准备和GUS组织化学检测15
2.3培养条件16
3结果与分析17
3.1外植体灭菌及初代培养17
3.1.10.1%HgCl2对外植体灭菌的影响17
3.1.20.1%HgCl2和75%酒精配合对外植体灭菌的影响17
3.1.4抗生素培养基对外植体灭菌的影响19
3.1.5人工激素对外植体腋芽萌发的效果20
3.2增殖培养21
3.2.16-BA、TDZ、KT对芽增殖的影响21
3.2.26-BA、KT与NAA配比对芽增殖的影响22
3.2.36-BA与GA3配比对增殖的影响23
3.3.1不同浓度NAA、IBA、IAA对无菌芽生根的影响24
3.3.2多效唑对生根的影响25
3.3.3添加活性炭对生根的影响26
3.4再生体系的建立27
3.4.1愈伤组织诱导27
3.4.2愈伤组织增殖培养28
3.4.3愈伤组织分化培养28
3.5遗传转化体系的初步建立30
3.5.1叶片抗生素选择压的确定30
3.5.2愈伤组织抗生素选择压的确定31
3.5.3不同侵染时间对无菌叶片转化的影响31
3.5.4不同共培养时间对叶片转化的影响32
4结论34
4.1以腋芽为外植体的再生体系建立34
4.2无菌叶片再生体系的建立34
4.3遗传转化体系的建立34
5讨论36
5.1课题的创新之处36
5.2讨论36
5.2.1外植体的灭菌36
5.2.2外植体初代培养及无菌芽增殖培养37
5.2.3无菌芽生根培养37
5.2.4组培苗移栽38
5.2.5再生体系的建立38
5.2.6遗传转化体系的影响因素39
6展望40
致谢41
参考文献42
附图48
1前言
木薯又名树薯、树番薯，为大戟科（Euphorbiaceae）植物，主要分布于南北纬30°
之间、海拔2000m以下地区，是世界三大薯类作物（甘薯、木薯、马铃薯）之一。
因为具有高生物产量、高淀粉含量以及耐旱耐脊的特点使其受到多个国家和地区的重视，全球种植面积达1700余万公顷，仅次于马铃薯，是热带、亚热带地区重要的热能来源，为全球6亿多人口提供基本的食物（Roslingetal.,1987;
Bokangaetal.,1995;
Nwekeetal.,2004）。
作为重要的旱地经济作物，木薯在我国的种植面积约为50万公顷，主要分布在广西、广东、海南和云南等地，其中广西是主产区（方佳等，2010；
尹达，2011），种植面积达30万公顷，产量600万吨，均占全国65%以上（邵乃凡，2009）。
上世纪90年代以来，由于饲料和淀粉工业及其深加工工业的迅速发展，国际市场对木薯的需求大幅度增长（詹玲等，2010）。
据预测，到2020年，世界木薯需求量将从目前的1.7亿吨增加到2.7亿吨。
我国制定的“十一五”再生能源发展战略以及新颁布的《国家可再生能源法》中，将木薯、玉米和甘蔗定为未来生产燃料乙醇的主要原料，其中以木薯生产酒精最具有经济性（王文泉等，2007；
陈立胜，2007）。
此外，国家财政部在《可再生能源发展专项资金管理暂行办法》中，已将木薯列为非粮乙醇原料首选作物。
随着燃料乙醇用量的急剧增加，木薯的需求量日益增大，国内已无法自给，目前仅干片年进口量就超过450万吨，总值近7亿美元（刘康德，2006；
邵乃凡，2009；
方佳等，2010）。
在这样的背景下，木薯生产逐渐成为广西的一个重要支柱产业（罗兴录，2006；
杨丛，2010，张慧坚等，2012），不仅关系到广西的经济发展，更关系到国家的能源安全和经济建设大局。
1.1木薯的经济价值和用途
1.1.1木薯是淀粉加工的重要来源
木薯块根中含有大量的淀粉，在非洲，木薯是主要的粮食作物（濮文辉，2007）。
木薯块根中高淀粉含量，蛋白质、果胶、油脂及灰份的含量很低，是生产优质淀粉的良好原料，可加工生产淀粉糖系列产品（麦芽糖、葡萄糖、果糖、低聚糖等），发酵产品（酒精、柠檬酸、味精、醋酸、乳酸、衣康酸等），氧化还原产品（山梨醇、甘露醇、草酸、葡萄糖酸、麦芽糖醇等）（付海天等，2010），还可生产可降解塑料（降解塑料袋、降解一次性餐具、降解医护用品、农用地膜、包装袋等）。
木薯淀粉具有粉质细腻，糊化温度低，杂质（蛋白质等）含量少，直链淀粉（约17%）的比例适中，粘度高，分子的聚合度大，无凝沉现象，与纤维的粘着力强，易酸解易酶解等许多优良特性（伍玉碧，2001），非常适于生产变性淀粉，特别适于生产造纸变性淀粉、食用变性淀粉和纺织变性淀粉等。
这些淀粉深加工产品广泛应用于造纸、医药、能源、建材、食品、铸造、轻工、纺织、石油饲料等行业（李慧贤等，2002）。
加工的变性淀粉还可作为食品添加剂用在各类食品中（冯琳等，2011）。
1.1.2木薯茎叶可作加工禽畜饲料的良好原料
木薯茎叶混合后含蛋白质17.2%，比多数热带禾本科和豆科作物茎叶所含的蛋白质高，纤维素含量较低，氨基酸的种类和大豆一样多，尤其是赖氨酸含量较高，对改善缺乏赖氨酸的小麦、玉米等谷类作物的饲料很有价值。
去毒后的木薯叶粉是很好的饲料，其蛋白质可消化率达81%，可作禽畜饲料蛋白质的补充物（罗兴录，2001）。
对反当动物来说，青贮料是相当平衡的饲料。
青贮料是将整株木薯（包括块根和地上部分）切碎后放在简易青贮坑中制作青贮料，供乡村一级在旱季饲喂家畜。
木薯渣常被称作木薯粉，它是木薯块根提取淀粉以后的残渣，可添加在牛的日粮中。
在东南亚，淀粉和木薯渣被广泛用作猪饲料，在那里被认为是一种有价值的饲料。
1.1.3木薯的食用价值
在世界范围内，木薯全部产量的65%被当做食物供人类食用。
在非洲几乎所有的木薯都作为粮食消耗，在拉美约一半产量是加工制成各种食品后食用的。
在亚洲除印尼用木薯做为粮食的补充外，其他国家很少食用。
木薯的叶片中含有丰富的蛋白质，维生素A、维生素B和维生素C，是一种良好的植物蛋白，可作蔬菜食用，因其所含的固体物质较一般蔬菜高数倍，煮熟后不象一般蔬菜那样柔软，需在煮前将叶片捣烂或擦烂，然后做为煮汤或炒素的原料（MpokoBokanga，1995）。
此外，木薯还可以制作各类糕点、做成木薯粉丝、酱料和虾片等食物。
1.2国内外研究现状
1.2.1木薯的育种研究现状
目前，大多数的木薯育种研究机构主要以常规育种方法来培育木薯新品种，并取得了一定的成就。
其中，巴西育成并推广了高产新品种BRA900等；
CIAT已向亚、非、拉等一些发展中国家推荐了一批高产优质、适应性强的优良品种，如：
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