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在不同组织中也可表达不同种类siRNA分子，这种特异性揭示了miRNA分子可能参与了生物体中复杂的基因表达调控机制。
miRNA的生成：
miRNA基因在核内由RNA聚合酶II（pollI）转录形成，转录成具有帽子结构（7MGpppG）和多聚腺昔酸尾巴的pri-miRNAopri-miRNA在DroshaRNase和它的辅助因子Pasha的共同作用下被剪切成70nt具有茎环结构的miRNA前体（pre-miRNA）opre-miRNA在转运蛋白RAN-GTP和exportin5作用下输送到细胞质中。
在细胞质中被Dicer酶加工成21-25个核昔酸长度的双链miRNA,随后双链miRNA链解，单链的miRNA进入一个沉默复合体（RISC）中，通过与靶基因的3'
UTR
区互补配对，指导miRNA复合体对靶基因mRNA进行切割或者翻译抑制。
miRNA功能：
miRNA的功能作用机制
miRNA通过抑制靶基因的表达来发挥它的功能，它的作用机制主要有两种：
在植物体中，miRNA分子一般是完全互补或者几乎完全互补的方式识别并与mRNA靶基因序列相结合，然后通过类似RNAi的方式降解靶基因，实现对植物体发育形态和生理功能的调控。
这种结合并不仅仅局限在靶基因的3,非编码区，而是可以发生在靶基因中的任何位点；
在动物体中，miRNA分子一般是以不完全互补的方式和靶基因的3,端非编码区序列相结合，通过抑制蛋白质的翻译发挥它的生物学功能，这种调控一般不会影响靶基因mRNA的稳定性。
现在有一些研究显示核糖体也参与了这种转录后抑制的机制。
siRNA通过这两种作用机制抑制靶基因的表达，进而在各种植物及动物中发挥着许多重要的作用。
miRNA功能
到目前为止，只有一小部分miRNA的生物学功能得以确定。
这些miRNA调节细胞生长和组织分化。
通过对基因组上miRNA的位点分析，显示其在发育和疾病中起了非常重要的作用。
一系列的研究表明：
miRNA在细胞生长和凋亡、血细胞分化、神经元的极性、胰岛素分泌、大脑形态形成、心脏发生、胚胎后期发育等过程中发挥重要作用。
在植物中，编码siRNA分子的JAW基因能通过降解TCP基因的mRNA来调控拟南芥叶的生长发育。
miR-172通过抑制转录因子APETLA2的表达而与花的发育有关；
miR-165/166通过调节转录因子PHV/PHB/REV的表达，决定其叶子近轴与离轴细胞的分化方向o在动物中miR-273和lys-6编码的miRNA,参与线虫的神经系统发育过程；
miR-430参与斑马鱼的大脑发育；
miR-181控制哺乳动物血细胞分化为B细胞；
miR-375调节哺乳动物胰岛细胞发育和胰岛素分泌；
miR-143在脂肪细胞分化起作用；
miR-196参与了哺乳动物四肢形成，miR-1与心脏发育有关。
miRNA与癌症:
有关miRNA与癌症的关系目前存在着不同的观点，不同的研究者在不同的体系中得到的结论明显不同，有人发现miRNA像源癌基因一样，其突变或者错误表达可引发多种人类癌症。
但也有人发现miRNA具有肿瘤抑制因子的功能，可抑制多种重要癌症相关基因的表达，且在癌症的分类中可发挥巨大的作用。
充当源癌基因的miRNA
研究表明在已经发现的人类siRNA中，其中约50%定位于基因组脆性部位，并且这些部位与癌症发生有密切的联系omir-125b-l定位于llq24染色体上易发生突变的部位，它的缺失可导致肺癌、乳腺癌或子宫颈癌。
Slnoki等人的研究还发现该基因与白血病的发生有关。
尽管还不完全清楚mir-125b-l的表达是怎么调控肿瘤细胞发生的，但至少表明这个基因是一个源癌基因。
Lin等人研究发现，与正常组织样本相比癌细胞中起源于mir-17-92的前体和成熟miRNA明显增加。
在小鼠淋巴瘤B细胞中mir-17-92群表达增强并与myc表达协同作用加速肿瘤细胞的增殖扩散，而且起源于造血干细胞并表达mir-17-92群和cmyc的肿瘤细胞凋亡现象消失，因此认为mir-17-92可能是潜在的人类源癌基因
Metzler等人发现，在BIC基因上具有一段138个核昔酸的保守序列，编码mir-155的发夹结构。
该研究组还发现在Burkitt淋巴瘤中,miR-155表达量上升了100倍，此外的研究也发现,Hodgkin淋巴瘤等肿瘤中miR-155水平也有提高。
因此，mir-155可能是作为一个癌基因和MYC协同作用，而其正常功能是在B细胞的分化中起作用，其可能的靶基因是那些对抗MYC信号通路的基因。
He等人最近发表的论文发现在散布的B细胞淋巴瘤等肿瘤中常常有13q31位点的扩增。
而在这一扩增区域的唯一的基因就是一个非编码蛋白的RNA,C13orf25,这个转录本编码了mir-17-92基因簇，他们由此推断，这个基因簇的过表达与肿瘤形成有关，而后通过实验研究证明，过表达Myc和mir-17-19-bl基因簇淋巴癌与仅有Myc过表达肿瘤相比较，具有更强的增殖能力，更低的细胞死亡率。
当凋亡途径被mir-17-19-bl去除，MYC可以诱导细胞不受控制地增殖，这导致了肿瘤发生。
充当抑癌基因的miRNA
mir-125b-l,位于染色体的llq24脆性位点，乳腺癌、肺癌、卵巢癌、子宫癌病人中llq924位点常有缺失，而这一位点并不存在已知的抑癌基因。
65%B细胞慢性淋巴型白血病（CLL）病人，50%的v套淋巴瘤细胞病人，16-40%的骨髓瘤病人、60%的前列腺癌病人中有13ql4位点的缺失。
因此，在这个30Kb的区域中必定有一个肿瘤抑制基因的存在。
而mir-15a和mirT6T位于这一区域中一个功能未知的被称为LEU2的非编码蛋白的RNA基因的内含子区域。
Climmino等最近报道，miR-15a和miRT6T负调控BCL2,一个抗凋亡基因，因此，这两个miRNAs的缺失或下调，导致了BCL2表达的升高，促进了白血病、淋巴瘤和前列腺癌的发生。
有研究报道，mir-143和mir-145在结肠癌中明显下调。
其发夹结构的前体分子在肿瘤和正常组织中含量相似，这表明，可能是由于其成熟过程受到破坏。
mir-143和mirT45的肿瘤抑制基因功能不仅仅局限于结肠癌，在乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、淋巴癌等细胞系中其表达量也明显下调。
Calin等人在2001年就提出了miRNA具有肿瘤抑制因子的功能。
最近Cmimino等人研究发现miR-15a和miR-16-1对BCL2（抗凋亡基因，在多种人类癌症细胞中过表达）具有负调控作用，mir-15a和mir-16-1的缺失或者下调会导致BCL2表达水平升高，进而导致骨髓淋巴瘤和白血病的发生。
Steven等人发现let-7在正常的成年人肺组织中正常表达而在肺肿瘤细胞中几乎不表达，而RAS源癌基因在肺肿瘤细胞中的表达水平明显高于正常肺组织。
通过微阵列分析证明RAS的表达受到Let-7蛋白的负调控，let-7miRNA在肺组织中具有肿瘤抑制因子的作用。
对它的深入研究可能为肺癌提供一个新的治疗机制。
miRNA与免疫：
miRNA免疫作用
近年来，一系列的miRNA已被证实参与了免疫反应调控，许多致病异常包括自身免疫病和癌症都与免疫反应有关。
哺乳动物在长期的进化历程中，为免疫调控形成了一套复杂的自查与平衡系统，以保证机体在抵抗外源性抗原时可以保持一种自身耐受状态，这其中的许多机制现在仍未完全清楚。
近来，越来越多证据显示miRNA在免疫调控和免疫细胞的发育中扮演者及其重要的角色。
如固有性免疫应答，T、B淋巴细胞的分化，病原体感染与免疫及炎症的免疫调控等。
部分miRNA参与了固有性免疫应答和炎性反应的调控，是一类新的免疫调控因子。
Taganov等发现，人单核细胞株THP-1在脂多糖刺激下，可引起3类miRNA表达上调，即mirl46a/b>
mir-132,mir-155；
进一步研究表明,其他Toll样受体（Toll-likereceptor,TLR）配体（如LPS、鞭毛素、脂蛋白等）和炎性因子如肿瘤坏死因子和白细胞介素-1,也可通过核因子-炒信号通路上调mir-146的表达，进而抑制TNF受体相关因子6和IL-1受体相关激酶的表达，调控机体对于炎性刺激的免疫反应。
Rodriguez等发现，在miR-155的基因敲除小鼠中，T、B淋巴细胞和树突状细胞的功能都被坏,miR-155对于正常的免疫功能是必需的。
Tili等发现，LPS能诱导巨噬细胞的miR-155表达上调，miR-125b表达下调,miR-155和miR-125b均参与了免疫反应的调控。
另一方面，miR-155不但能抑制LPS诱导的免疫反应，还能促进TNF的翻译，这也充分表明miR-155在免疫调控作用中的复杂性。
在获得性免疫应答的调节中，miRNA在淋巴细胞的生成、发育与免疫功能过程中发挥重要作用。
Chen等通过构建miRNA文库的方法，在小鼠的造血细胞中鉴定出3个特异表达miRNA（miR-181amiR-223>
miR-142s）o当在造血干细胞中过表达miR-181a后，B细胞的数量显著上升，推测miR-181a主要调节淋巴细胞，特别是B淋巴细胞的分化；
同时，在动物模型中，过表达miR-181a后还能减少T淋巴细胞的数量,尤其是CD8+T细胞。
此外，miR-181a还通过调节T细胞抗原受体
（Tcellreceptor,TCR）的敏感性，从而在T细胞发育成熟过程中发挥调控作用。
因此，miR-181a在T、B细胞的发育过程中发挥重要作用，而且可能作用的靶基因各不相同。
另外，miR-150是另1个与T、B细胞发育成熟相关的miRNAomiR-16在单核、中性粒细胞和CD8+T、CD4+T等多数细胞和组织中高表达，推测其在调控细胞周期上具有重要的作用。
miRNA在感染性疾病的发生和进展过程中扮演着重要的角色，病原体与宿主双方都能利用，siRNA进行基因表达调控。
例如，在病毒感染过程中，病毒可编码特异性的miRNA,不但能调控自身的基因表达，还能调节感染细胞的基因表达，有利于病毒在宿主细胞的复制和免疫逃避；
另一方面，宿主细胞为应对病原体的感染，其miRNA的表达谱也可能会发生改变，最终导致下游靶基因的表达变化。
Lecellier等发现，在灵长类泡沫病毒感染过程中，宿主细胞编码的miR-32能抑制PFV病毒的复制。
Chen等发现，小球隐抱子虫感染胆道上皮细胞后，可引起细胞let-7i的表达下调，从而促进TLR4介导的免疫反应，有利于机体对外源病原体的清除。
miRNA免疫学目标
RNA诱导的免疫复合物中的关键组分是Ago蛋白家族。
在哺乳动物，有四种Ago蛋白（Agol-4）,但只有Ago2是siRNA或siRNA通路的功能组分。
Ago2可以分解被miRNA和siRNA靶定的mRNA,并且还可作为RNA干扰的催化酶。
除了Ago蛋白外，miRNA功能实现还需要许多其他蛋白，包括GW182和Rck/p54,这些蛋白均定为在离散的胞浆复合体中，比如GWBo2002年，在患有运动和感觉神经病变的自身免疫病患者血中发现这些局灶样小体，随后，GWB血清反应在一些患其他疾病的患者血中被鉴定出，如神经症状（33%）,舍格伦综合征（31%）,以及一些自身免疫性疾病包括系统性红斑狼疮（SLE,12%）,类风湿性关节炎（7%）,原发性胆汁性肝硬化（10%）0
1994年,Satoh等人通过抗Su自体抗体鉴别出分子量为100/102和200kDa的自身抗原。
SLE、硬皮病、重叠综合症的患者血清中，出现上述自身抗原抗体免疫沉淀反应的高达20%o2006年，Jakymiw等报道在风湿性疾病病人以及自身免疫模型小鼠中，抗-Su自身免疫抗体可以识别出RNAi/miRNA通路中的催化酶，其中包括Ago2、Agol、Ago3>
Ago4以及Dicero
免疫荧光实验显示抗-Su自身抗体可以识别GWB。
最近，对带有GWB自身抗体病人临床和血清学特征研究的研究表明，这些病人最常见的临床表现是神经症状、舍格伦综合征、SLE、类风湿性关节炎和原发性胆汁性肝硬化。
最常见的自身抗原是Ge-1/Hedls（58%）,GW182（40%）,以及Ago2（16%）,此外还有18%的GWB活性血清并未与任何已知的抗原反应，暗示可能还有其他的靶位自身抗原未被发现。
这些数据均指出RNAi/miRNA通路的关键组分与自身免疫反应有关，miRNA通路对自身抗体的生成和诱导有一定的作用。
miRNA在免疫细胞发育中的作用
几项研究显示miRNA涉及了免疫细胞的发育过程。
最先报道与此
相关的miRNA是miR-181a,它在胸腺细胞中呈高表达，而在心、淋巴结以及骨髓中的表达则相对较低。
在骨髓来源的B细胞中，从原B细胞发育成前B细胞的过程中，miR-181a的表达下降。
另有证据显示miR-181a在造血干细胞和祖细胞中的表达，造成了CD19+B细胞的增加以及CD8+T细胞的减少。
miR-181a还被发现可以调节TCR信号通路，并影响T细胞对于抗原分子的敏感性。
近来，有报道称miR-181b可调控活性B细胞的类别转换重组。
miR-181b在活性B细胞中的表达削弱了类别转换重组，导致活性诱导胞核嗜嚏核贰脱氨酶（AID）在蛋白水平和mRNA水平发生下调。
这些结果也为通过抑制AID活性防止B细胞恶化这一新的调节机制提供了证据。
其他miRNA介导调控免疫细胞发育的例子包括miR-223对于粒细胞生成的调控，以及miR-150在B细胞分化中的关键作用。
miRNA的提取和鉴定：
miRNA的获取
由于miRNA具有非常重要的调控功能，因此寻找新的miRNA成为生物领域的一大热点。
到目前为止，miRBase上公布的siRNA总数将近3000种。
现在已知靶基因的miRNA多是通过基因克隆和生物信息学筛选的方法发现的。
基因克隆：
直接克隆的方法通常是从总RNA中提取大约22nt的小RNA分子，制备一个小RNA的cDNA文库。
将文库中的小RNA序列与基因组数据库中
BLAST比对，排除非miRNA序列后，通过Northern印迹方法（Northernblotting）得到最终确认。
目前大量的已知miRNA都是通过这种方法获得的。
基因克隆方法的优点是对于高丰度或常表达的基因来说，可以获得完整的miRNA序列。
然而对于另一些miRNA,它们在生物体内浓度很低（表达量低或表达产物极不稳定，或前体到成熟的加工效率低等原因引起），或者某些只在生物体的特定时期或特定组织器官中表达，直接克隆法则无法获取。
生物信息学：
人们根据目前已知的miRNA基因序列总结它们的特征和规律，编写了一些计算机程序，通过对生物基因组数据库进行搜索，可以找到那些可能为miRNA的基因序列，然后通过Northernblotting来筛选真正的miRNA基因。
生物信息学手段可以说是一种更高通量的方法。
主要有有以下几种方法
（1）Mirscan是一种基于二级结构的预测程序，通过扫描两种系之间是否存在同源的茎环结构，被系统的应用于检测脊椎动物和线虫的候选基因。
（2）Mirseeker是一种检查RNA序列茎环结构的预测程序，应用于筛选昆虫的候选基因。
（3）ERPIN是一种类似于BLAST的校对程序，用于搜寻动物基因组中与miRNA序列类似的序列。
（4）MiPred可以通过randomforest预测模型和miRNA特征的结合，区分miRNA的真正前体和假冒前体。
生物信息学筛选的缺点是不能精确的鉴定miRNA的完整序列，因此它还需要用Northern等方法对它的分析结果进行进一步的验证。
miRNA的鉴定：
miRNA的判断标准
根据siRNA的定义和特点，要确定一个RNA分子是否为miRNA,必须以下列几个原则作为判断标准：
（1）能够通过与特定大小的总RNA样品杂交得到22个碱基对的产物（即需要Northern杂交或引物延伸反应验证表达）。
（2）所得的序列是从特定大小的小分子RNA库中克隆到的，并且必需与克隆的来源物种的基因组序列完全匹配。
（3）经过前体的二级结构预测，有发夹状的二级结构，并且成熟的miRNA序列在发夹的一条臂上。
（4）成熟的miRNA序列与预测的二级结构在不同物种间有保守性。
（5）在Dicer突变的系统中，前体的积累增多。
miRNA的鉴定方法
鉴定miRNA的主要方法有
（1）克隆测序法：
先分离纯化小RNA,3,和5,寡核昔酸接头连接进行RT-PCR获得cDNA,连接到载体上构建cDNA文库，筛选克隆进行测序，获得miRNA序列。
其优点是操作直接,结果可靠，缺点是很难克隆出在不同时期表达或只在特定组织或细胞系中表达的miRNA；
而且由于克隆方法固有的局限性，也很难捕获表达丰度较低的miRNA；
该方法受其他小分子（如siRNA）的影响，易产生假阳性。
（2）基因芯片技术可以高通量的检测基因表达谱，检测灵敏度较高且可以并行处理，但是其结果是半定量的，重复性较差，不能同时优化所有待测miRNA的杂交环境，因而不能区分高度类似miRNAo（3）Northern杂交：
简便可靠，将已知浓度梯度的寡核昔酸参照物与待测样品进行平行杂交，实现对miRNA的半定量检测。
既可用于检测miRNA在组织细胞中的表达水平，又可结合RNAmarker检测miRNA的分子大小。
缺点是对样品的需求量较高，需要微克级样品才能避免假阴性，有时样品量达到40ug才会出现明显杂交信号。
（4）RT-PCR技术：
可以简洁、快速、特异、高通量的检测miRNA的相对含量，并可同时检测多种miRNA的表达。
需求RNA量少，且不用放射性同位素标记。
可以同时检测到成熟miRNA及其对应的pre-miRNAo但是操作中需确保引物3'
端的不同，较高的退火温度（60—61°
C）可提高反应特异性，以富集的miRNA为模板扩增可提高检测的灵敏性。
（5）荧光定量技术：
具高度特异性，超宽的定量线性范围和高度的检测灵敏度。
适用范围广，总RNA、细胞裂解物及纯化的RNA都可用于miRNA的定量检测，样品消耗少，仅需1〜10ng的总RNA。
但引物、探针设计要求较高。
miRNA靶基因鉴定：
目前鉴定miRNA靶基因的策略和方法主要有以下几种：
正向遗传学、生物信息学预测、miRNA过表达和基因表达芯片相结合、免疫共沉淀和生物芯片结合、miRNA过表达和蛋白质组学相结合正向遗传学：
正向遗传学筛查是分子遗传学家最初使用的一种方法，该技术意在鉴定产生特定表型的变异。
第一个miRNAlin-46的缺失突变体（e912）首先在Brenner实验室发现，该突变体对线虫发育和分化的影响首先被Horvitz和Sulston确认，lin-4突变体线虫由于不能形成阴户，导致无法正常产卵，卵在孵化的同时会吞噬母体导致母体死亡。
之后，Ferguson等进一步确认了该突变体的突变基因为lin-4。
之后，哈佛医学院的Ruvkun和Asbros合作，历经4年时间最终确认了，lin-4并不编码蛋白质而是转录一长度21nt的的非编码RNA。
至此历经多年的不懈研究终于发现了第一个miRNA:
lin-4由此可见，利用正向遗传学研究miRNA的体内作用靶标存在明显的缺陷，非常耗时费力，不适合大规模的研究。
生物信息学预测：
利用生物信息学预测miRNA的体内作用靶标并用双色荧光报告系统加以验证是目前比较流行的方法。
该方法首先应用于在果蝇中发现的第一个miRNAbantamo与正向遗传学鉴定相比，生物信息学预测方法在miRNA靶标鉴定方面存在明显的优势:
（1）适合于大规模研究特定miRNA的的作用，可从中选择感兴趣的靶基因加以确认，这就存在明显的目的性和目标，极大地加速了靶标鉴定的速度。
（2）对靶标的功能归类分析使我们对特定miRNA的功能有整体的概念。
但生物信息学预测也存在明显的缺陷：
⑴该方法建立在已知的miRNA和靶标相互作用的基础上，不能预测与已知规则不符的基因。
⑵该方法强调miRNA靶位点在进化中的保守性，不能系统预测miRNA的非保守性靶标。
据估计非保守性靶标的数目是保守性靶标的10倍以上。
（3）该方法排除了G:
U配对的情况，导致靶标预测的不完整性。
近年的研究发现种子区的G:
U配对并不影响siRNA的作用效果⑷该方法仅仅考虑保守性和配对情况，忽略了靶位点区的二级结构以及蛋白结合因子对miRISC进入的影响，故不能反映siRNA在体内生理条件下的真实作用情况。
以上的缺陷导致生物信息学预测miRNA作用靶标的准确率较低，往往需要大量的验证才能找到miRNA的真正体内作用靶标。
miRNA过表达和基因表达芯片相结合：
在植物中发现的miRNA由于和靶标niRNA完全互补配对，故植物中miRNA作用靶标的大规模鉴定普遍采用miRNA过表达和基因表达芯片相结合的方法。
首先瞬时高表达特定miRNA,然后提取总RNA,利用生物芯片寻找mRNA表达水平下降的候选基因，之后进行生物信息学分析，找出表达水平下调的miRNA的3，UTR区与miRNAseedreagion区互补配对的保守序列。
与前面的方法相比，该方法存在明显的优势：
在表达水平下调的miRNA中寻找靶基因降低了搜寻的范围，使得预测
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