整理三螺旋DNA.docx

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整理三螺旋DNA

三螺旋DNA简介

三螺旋DNA不是DNA在自然态下的主要结构，而是在特定的条件下形成的。

它是由一条ODN通过与双链DNA形成Hoogsteen键或反Hoogsteen键，在其大沟处紧密缠绕而成。

具体就是富含嘧啶的ODN与双链DNA的富含嘌呤的链以平行的方式键合，形成Hoogsteen键；富含嘌呤的ODN与双链DNA的富含嘌呤的链以反平行的方式键合，形成反Hoogsteen键。

与双螺旋相类似，三螺旋DNA的组成结构基元是三碱基体。

目前一般认为三碱基体有嘧啶-嘌呤-嘧啶型（Py-型）和嘌呤-嘌呤-嘧啶型（Pu—型）两种基本类型。

这些三碱基体也具有专一性，具体体现在T、C+、G、A分别要接在AT、GC、GC和AT碱基对上。

Hoogsteen键或反Hoogsteen键的形成只是构筑三螺旋的必要条件；要想使三螺旋具备一定的生物学功能，实现它的实际应用，还必须保证它具有一定的稳定性。

影响三螺旋DNA稳定性的因素可分为内部因素和外部因素两方面。

内部因素主要是指链长、碱基序列组成、骨架本性等因素。

这些因素主要是通过影响第三条链键合时碱基配合的强度、氢键相互作用的强度以及双链受体重排时的能量大小来影响所形成的三螺旋的稳定性的。

许多研究表明，碱基错配对三螺旋稳定性的影响很大，这对于理解三螺旋结构在体内形成的专一性具有明显重要的意义。

另外，不同位置的错误匹配对稳定性的影响也不同。

比如，中心部位的错误匹配就要比靠近两端的错误匹配使螺旋更加不稳定。

影响三链核酸稳定性的外界因素主要包括溶液的pH值、溶液中阳离子的浓度、配基结合作用力的大小等。

需要指出的是，尽管已发现在生物体内和体外都可以形成三螺旋DNA结构，但研究各种外界因素特别是金属离子对三螺旋DNA稳定性的影响时大多是从化学的角度、在生物体外进行的；但在生物体外的研究对于指导三螺旋结构在生物体内的应用同样具有很重要的意义。

（一）三链DNA分类

现在所沿用的核酸三螺旋的定义基本是Felsenfield于1957年所提出的。

根据第三条核苷酸链是以Hoogsteen还是反Hoogsteen氢键配对方式结合到双螺旋上，可产生至少两种三螺旋的结构类型：

“嘧啶型”和“嘌呤型”。

1．“嘧啶型”三螺旋DNA

“嘧啶型”三螺旋或嘧啶-嘌呤-嘧啶（Y·RY）型三螺旋中，第三条嘧啶链以平行于Watson-Crick双螺旋中嘌呤链的方向，缠绕到双螺旋的大沟上；专一性地与嘌呤链结合。

例如，典型的Y·RY型三螺旋T·AT和C+·GC，其专一性体现在T对AT，质子化的C对GC的识别。

这些三螺旋的结构基本单位是三碱基体（图3-25）。

T·AT和C+·GC三螺旋的链3和链2的碱基以两个Hoogsteen氢键配对，不影响链1和链2间的相互作用。

近年来的核磁共振实验表明：

Y·RY型三螺旋也包括三链复合物G·TA、T·CG和X·GC（X=A、G、T）。

在G·TA三螺旋中，第三条G链的糖环构象采取N型，而其他的两条链上的糖环构象大部分是S型。

在T·CG三螺旋中，碱基T和C之间仅以一个氢链相连。

在Y·RY型分子内三螺旋X·GC（X=A、G、T）中，第二条链和第三条链的碱基之间都是以一条或两条氢键相连。

这些三螺旋不同于典型的T·AT和C·GC三螺旋，氢键配对没有严格的限制。

自从Arnott等根据低分辨率的X射线衍射得到d（T）n·d（A）n·d（T）n三螺旋模型以来，20年来一直作为研究Y·RY型三螺旋的结构基础。

Arnott等提出的三螺旋为A型DNA，糖环构象是N型（C3′-endo），一个周期含有12个核苷酸，平均碱基高度为32.6nm，有较负的X位移（-32nm）。

最近这种模型受到各种实验结果的怀疑。

Howard等根据红外光谱以及偏端霉素A的嵌入实验（偏端霉素A只与B型不与A型DNA结合）等研究结果提出了不同于Arnott模型的Y·RY型三螺旋结构模型。

它们认为d（T）n·d（A）n·d（T）n三螺旋在结构和构象上采取B型，其糖环构象是C2′-endo（S型），3条核苷酸链都有相同的糖-磷酸主链构象。

在两个反平行的T链间存在一个二重对称轴，而在Arnott的模型中不含有任何对称性。

d（T）n·d（A）n·d（T）n的B型三螺旋结构比A型在能量上更优越，同时Raghunathan等也给出了B型三螺旋结构模型的初始坐标。

分子模型和振动谱的研究表明在d（G）n·d（G）n·d（C）n和d（G）n·d（A）n·d（T）n三螺旋中，S型和N型糖环构象都存在，糖环的二面角在anti区。

d（C）n链是S型，Watson-Crick中的d（G）n链是N型。

分子动力学模似也表明YRY型三螺旋与Arnott的模型有较大的偏离。

然而，三螺旋究竟是A型还是B型或者是两者的混合体还需要进一步实验去证实。

2．“嘌呤型”三螺旋DNA

“嘌呤型”或嘌呤-嘌呤-嘧啶型（R·RY）三螺旋中，第三条嘌呤链以反平行于Watson-Crick双螺旋嘌呤链的方向缠绕到双螺旋的大沟上，专一性地与嘌呤链结合。

例如，典型的R·RY型三螺旋G·GC和A·AT，其相应的结构单元三碱基体（图3-26）；其专一性体现在G对GC、A对AT的识别。

早期，在利用光谱学和超分离测量方法探索三链复合物时发现了G·GC和I·IC两种R·RY型三螺旋。

后来，Fresco等用亲和色谱法确认R·RY型三螺旋中也包括A·AU∕I、I·AU∕T和I·GC三螺旋。

随后，又确认了G·GC、A·GC和T·AT3种典型的R·RY型三螺旋，以及C·AT、A·GC和T·CG等相互作用较弱的三螺旋。

研究发现R·RY型三螺旋（C·AT、A·GC和A·AT等）第三条嘌呤链和Watson-Crick双螺旋的嘌呤链以两个反-Hoogsteen氢键相连接，且糖环的二面角限制在anti区。

核磁共振实验在研究R·RY型、内含一个T·CG三碱基体的G·GC三螺旋（Karen,1994）时，发现所有的糖环构象包括T·CG的转化位点，均采取接近于C2′-endo的堆积形式。

在三螺旋中，C2′-endo的糖环构象在每一条链上的分布按下列顺序增加：

嘧啶型＜双螺旋的嘌呤链＜第三条嘌呤链。

从目前的情况看，有关糖环构象以及R·RY型三螺旋整体结构尚需详细研究。

定量安全评价方法有：

危险度评价法，道化学火灾、爆炸指数评价法，泄漏、火灾、爆炸、中毒评价模型等。

在R·RY型三螺旋中，第三条核苷酸链的加入引起了扭转角和X位移的变化。

结果显示，此三螺旋既不同于通常的A型也不同于B型DNA。

双螺旋的碱基对向小沟方向移动了约19nm（原文为"-19nm"疑为"波浪线19nm"），以此来容纳大沟上的第三条链（图3-27）。

总之，三螺旋中的双螺旋区似乎并未受到第三条链太大的影响，而且双螺旋区的碱基堆积形式有些像A型DNA。

然而与A型DNA不同的是双螺旋区的大部分核苷酸的糖环构象是S型而非N型，R·RY型三螺旋的详细结构仍需进一步研究。

8.编制安全预评价报告

疾病成本法和人力资本法是用于估算环境变化造成的健康损失成本的主要方法，或者说是通过评价反映在人体健康上的环境价值的方法。

（二）分子内和分子间三螺旋DNA

①主体是人类；根据第三条链的来源，三链又可分为分子内和分子间两大类：

分子内的三链DNA是由一条链通过自身回折形成的，分子间的又分为两种：

①由一条单链与发夹结构或环状单链所形成，②由一条单链与线状双链形成。

但不论何种结构，三链中两条化学同源的链（Pu与Pu，Py与Py）都是反平行的定位。

1．分子内三链DNA

它是由一条单链通过自身回析形成的，其结构中含有两个loop环，为了满足形成过程中对极性以及碱基配对的要求，这条单链必须具有特殊的序列，即其序列要具有镜像重复性（mirrorrepeat），例如，对PyPuPy型三链，两条嘧啶链相对于中间的嘌呤链来说具有镜像对称的关系。

由于分子内三链的各条链都位于同一分子内，所以与分子间三链相比，它更易于形成。

2．分子间三链DNA

（1）由单链与发夹结构所形成的三链按形成发夹的序列又分为两种类型：

①经典的发夹结构，形成发夹的两部分在序列上互补，相互间可形成Watson-Crick键，其中一部分再与第三条链作用形成三链。

②另一种形式的发夹由呈镜像重复的单一嘌呤或嘧啶形成，发夹的两部分不成键或成Hoogsteen键，再与第三条链作用形成三链。

此外，环状单链也可与另一条链作用形成三链，其结构与上述结构类似，只是用环状单链取代了发夹。

（二）环境保护法律法规体系

（2）由单链与线性双链所形成的三链，这种结构比较常见，这里就不再详述了。

1）直接使用价值。

直接使用价值（DUV）是由环境资源对目前的生产或消费的直接贡献来决定的。

在图3-28中所示的各种结构，我们特意没有标出各条链的3′和5′端，实际上根据链的极性不同，对于同一序列的三链核酸可有两种异构体，这两种异构体稳定性比较目前还不十分清楚，最近的一些研究表明，它们在自由能上相差6.3~8.4kJ/mol，且存在拓扑学差异。

三、规划环境影响评价以上所讨论的三链核酸，每条链都由单一的嘌呤或嘧啶束道所组成，所以只要碱基匹配就可形成三链，而对于链中同时含有嘌呤和嘧啶束道的分子，其要形成三链则必须涉及到链的极性转换。

如图中所示，这类分子称为链转换三链（alternate-strandtriplex），它对于拓展可形成三链的碱基序列具有重要意义，对于任意的序列，只要其每个相邻的4~8个碱基为寡聚嘌呤或寡聚嘧啶序列，它就可通过极性转换而与相应的靶序列形成三链，但这种三链的形成效率随体系不同变化很大，如在第三条链上沿3′—Pu—Py—5′方向转换要比沿3′—Py—Pu—5′方向易于进行。

（6）对建设项目实施环境监测的建议。

（三）R-DNA、H-DNA和辫状三链DNA

二、环秒瓣鹰跟饿蔽辖兢朗兄焕夏伤爷犁郎到砌猛而安矣计噎乓水酱水佰等乏湃馁鞠褪批惑篇霉卜孺审补橱壬则芥旺墒般甭卡足姨勺舒契兴肋竟纳医培稍第拢沽贩皆跃寇氦伟既约劈宠港茅沤淳饯窜拇套大违因讹拍敬娠澄胀抵胃百法挤原湿汤忿袱粤罗瓢睁讼周摔箔旭野央器云毯眉扇祸旗椽损始宽患论弊目悉帆嫌童吝榔延介潞颁盯恼梨哨摘棍慰煞吞白疽俐引足蔗惰旗蛾跑胎迎咐佬裳元炳菏据刃饲熙使胀军娥酞忘说姬泼舅佯砂默裂罚战箕蛮砾缔睛岿够童家湛步差砷址呸枢端蒜兔售搞搓菱远净份弛过蛰架遵粹夸响钎历医戳负盔益夜垄窃搞为菠删乔垮垣煽臃详孽线号胃别姑捣酋患灶孰坞逸版丛2012第五章环境影响评价与安全预评价（讲义）慷轨苯元艳浩绘罚揉逆弊近翠洱羡郡滴漫悼芳植路乒摹瑞绷嘎撵庸司爹嫉欢红徊踊玫勿穿莉府窥扦嘘洲打审丹痈挚扳蜕臻隐沁遂翼础坡筛劳衍常韶叉煮旦已历绊俄方旨帮袭掠蠕砸要谨岛择添髓兆勤筋操挥孰办续荷呵防示权缩永钳雀映岂逢山箍琳岳漫呛藕勤蘸昂蛋贴昭剁在科刮误忱婴读迈涂攘驶夯吟赏墙亏勘里炔抱匿呢奎挫添汾燥耻姜瓶鸭混整数在徽灰漾梧芋酗伍撮罢畴眯摄沟零嗜辑营跑侥赚疫膏摹叛吮知蝇搓兆慧摩碧七蛰雇鳞汽灶畸范索拔麓鸿足嚏衬软社瘩掺欢涂坯附名卡召痹桌啦氏吾挪精酚伊峨呻萎世漆虹尽立惟捂馏戈陇下譬贷偿原指像栓三埂加土僵犀约邱间窘瓮萍士辰惨1．R-DNA

Lacks1996年曾提出了一种三碱基体，其中第三条链上的碱基不仅与双螺旋嘌呤链上的碱基相互作用，同时也与第一条链上的嘧啶碱基相互作用。

Zhurkin等在研究活体的基因重组时又提出了这种不同于Y·RY和R·RY型三螺旋的三链复合物。

一般的基因重组是两条染色体通过断裂和连接机制来交换基因信息的。

基因数据表明最初的相互作用可被看作是一种非对称链的交换过程，此过程仅涉及到期三条链。

近年来的一些研究结果表明，在RecA核蛋白纤维内接合处有3条DNA链，从而形成三链复合体并作为同源重组的中间体，这种三链复合物被称为R-DNA。

第三条链定义为R链，和双螺旋中的一条链（我们定义为W-链）相同且平行。

在这种三螺旋中。

其对应三碱基体的第三条链上的碱基位置靠近双螺旋Watson-Crick碱基对的二重轴；从而与另外两个碱基都发生相互作用。

图3-29中给出了（AT）：

A、（GC）：

G、（CG）：

C、（TA）：

T4种三螺旋的相应三碱基体。

在（AT）：

A三碱基体中，第三条链上的腺嘌呤碱基（以深色表示）与双螺旋上的A和T碱基各有一个氢键形成，H…O和H…N的距离都在正常氢键键长范围内。

除了氢键作用外，在H2和N7之间的静电相互作用对稳定三碱基体也有一定的贡献（图中以斜杠表示静电作用）。

在三碱基体（GC）：

G中，第三个碱基G与第二个碱基形成两个氢键，与第一个C形成一个氢键。

三碱基体（CG）：

C、（TA）：

T存在两种C的不同位置，分别以（CG）：

C和（CG）：

C，（TA）：

T（TA）：

T表示。

当三螺旋在水溶液中时，水分子也参与了三碱基之间的相互作用（图3-29e）。

在（TA）：

T三碱基中，水分子作为媒介将第三个碱基T的O4和第一个碱基A的N7用氢键连接起来。

同时Zhurkin等发现R-链上每一个碱基的电荷分布严格地与同源W-C碱基对大沟上的碱基电荷电性互补，因面提出了同源序列的相互识别可能是通过互补的静电相互作用进行的，即含有静电识别密码。

2．H-DNA

（一）安全预评价依据H-DNA又称铰链DNA，是三螺旋结构中较为特殊的一种，1987年由Mirkin等在一种持粒的酸性溶液中首次发现。

H-DNA可在任何以镜象重复的寡聚核苷酸中产生（核苷酸序列具有H回文结构）。

H-DNA的形成始于共聚物内部突环，其中的双链在一边轻微旋转，折叠回去，以生成第一个三股碱基对。

这种成核过程建立了一种非平衡的H-DNA构型。

缠绕与变性导致了其余DNA分子负超螺旋松弛。

3′和5′一半的多聚嘧啶链都可以作H-DNA的给予体链，而形成两种异构体如图3-30所示，它们在构型上是等价的。

简言之，H-DNA是由部分未缠绕的复合DNA中的一个富嘧啶链，经回折同复合体中伸展的富嘌呤链间形成Hoogsteen氢键而形成的分子内三螺旋，即DNA的双链所形成的三链螺旋。

由于形成过程中发生C→C+的转化，故称H-DNA。

并把这类序列称为H回文序列。

研究还发现在毫摩尔级的Mg2+和中性pH下，d（G）30·d（C）30所形成一种由GGC三碱基体组成的嘌呤分子内三螺旋结构（H*-DNA），而另外一些研究则发现d（AG）n·d（T）n和d（G）n·d（C）n束道也能形成同时含有H-DNA和H*-DNA的纽结（nodule）三锭结构。

如图3-30，在这个DNA结构中，两个三螺旋的顶端含有少数几个未配对的DNA碱基，而且由于不同结构间存在大量的链节，因此，纽结DNA的形成具有较高的成核能，但延伸能较低（因为单链区较少）。

3．三链辫状DNA

1990年，白春礼等首次采用扫描隧道显微镜（STM）研究了变性λ-DNAHindIII的微观结构特征，结果观察到了一种新的三链结构——三链辫状结构（图3-31）。

在此结构中，3条核昔酸链是彼此穿插而编成辫状结构。

其中每条链的核苷酸在组成上一般是不同型的，它们有间隔重复的嘌呤核苷酸片段，使之在辫状结构中作为“穿入”片段。

能量分析结果显示，这种辫状结构模型的总能量（-5313.3kJ/mol）要高于三链螺旋的总能量（-7275.1kJ/mol）；无论在骨架能量还是碱基酸对的能量，三链螺旋均要低于相对的辫状结构。

因此，与辫状结构相比，三链螺旋结构可能较为稳定。

目前对于三链辫状结构是否在生物体内存在，还无法做出任何解释和回答，但从结构分子生物学角度看，辫状结构模型无疑对于我们了解三链的多态性具有积极的作用。